Summary
Den endotel glycocalyx / endoteloverflade lag er ideelt undersøgt ved hjælp intravital mikroskopi. Intravital mikroskopi er teknisk udfordrende i en bevægelig organ, såsom lungen. Vi viser, hvordan samtidig lysfelt-og fluorescensmikroskopi kan anvendes til at estimere endoteloverflade lagtykkelse i en frit bevæge
Abstract
Den endotheliale glycocalyx er et lag af proteoglycaner og tilhørende glycosaminoglycaner foring det vaskulære lumen. In vivo er glycocalyx kraftigt hydratiserede, danner en væsentlig endotel overfladelag (ESL), der bidrager til opretholdelsen af endotelfunktion. Da den endotele glycocalyx er ofte afvigende in vitro og forsvinder under standard vævsfiksering teknikker, undersøgelse af ESL kræver anvendelse af intravital mikroskopi. For bedst at tilnærme den komplekse fysiologi alveolar mikrovaskulatur, er pulmonal intravital billeddannelse ideelt udført på en frit bevægelig lunge. Disse præparater er imidlertid typisk lider omfattende bevægelsesartefakter. Vi viser, hvordan lukkede brystet intravital mikroskopi af en frit bevægelig muselunge kan anvendes til at måle glycocalyx integritet via ESL udelukkelse af fluorescens-mærkede højmolekylære dextraner fra den endoteloverfladen. Denne manglende inddrivelse kirurgisk teknik, som kræversamtidig lysfelt og fluorescerende billeddannelse af muselunge, tillader langsgående observation af subpleural mikrovaskulatur uden tegn på at inducere confounding lungeskade.
Introduction
Den endotheliale glycocalyx er et ekstracellulært lag af proteoglycaner og tilhørende glycosaminoglycaner foring vaskulære intima. In vivo er glycocalyx kraftigt hydratiserede, danner en væsentlig endotel overfladelag (ESL), der regulerer en række forskellige endotheliale funktioner, herunder fluidpermeabilitet 1, neutrofil-endothelial adhæsion 2 og mechanotransduction af fluid forskydningsspænding 3.
Historisk set har glycocalyx været undervurderet på grund af sin aberrance i dyrkede cellepræparater 4, 5 og dens nedbrydning under standard tissue fiksering og bearbejdning 6. Den stigende brug 7 i intravital mikroskopi (in vivo mikroskopi, IVM) falder sammen med øget videnskabelig interesse i betydningen af ESL til vaskulær funktion under sundhed og sygdom. ESL er usynlig for lysmikroskopi og ikke nemt kan mærkes ivivo, i betragtning af den tilbøjelighed fluorescerende glycocalyx-bindende lectiner at forårsage RBC agglutination 8 og fatal lungeemboli (upublicerede observationer). Adskillige indirekte metoder er derfor blevet udviklet til at udlede ESL tykkelse (og i forlængelse heraf, glycocalyx integritet) i ikke-bevægelige kar såsom cremasteric og mesenteriallymfeknuderne microcirculations. Disse teknikker indbefatter måling af forskelle i cirkulerende mikropartikel hastighed som en funktion af afstanden fra den endotele membran (mikropartikel billede Velocimetry 9) samt måling af udelukkelsen af voluminøse, fluorescens-mærkede vaskulære markører (fx dextraner) fra endoteloverfladen (dextran udelukkelse teknikken 10, 11). Af disse teknikker, er kun dextran udelukkelse stand til at anslå ESL tykkelse fra målinger foretaget på et enkelt tidspunkt. Ved samtidig måling vaskulære bredder ved hjælp brightfield mikroskopi (en bredde iclusive af "usynlig" ESL) og fluorescensmikroskopi af en vaskulær sporstof udelukket fra ESL, kan ESL tykkelsen beregnes som halvdelen af forskellen mellem vaskulære bredder 2.
Anvendelsen af en øjeblikkelig foranstaltning ESL tykkelse er velegnet til undersøgelse af lunge-glycocalyx. Intravital mikroskopi af lungen er udfordrende, da signifikant pulmonal og hjerte bevægelsesartefakter. Mens nylige fremskridt muliggør immobilisering af muselunger in vivo 12, 13, eksisterer bekymringer med hensyn til fysiologiske virkninger af lunge stasis. Lung immobilitet er forbundet med nedsat endotel nitrogenoxid signalering 14, en signalvej, der påvirker både neutrofiladhæsion 15 og lungebeskadigelse 16. Endvidere immobilisering af et område af lungen udsætter omgivende mobile alveoli til skadelige forskydningskræfter (såkaldt "atelectrauma"), i overensstemmelse med de klassiske fysiologiske begrebernealveolær afhængighed 17.
I 2008 udviklede Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler og kolleger en kirurgisk teknik giver mulighed for intravital mikroskopi af et frit bevægelse muselunge 18. Respiratory artefakt som følge af denne teknik kan neutraliseres ved hjælp af high-speed billedbehandling, herunder samtidig måling af lysfelt og fluorescensmikroskopi. I denne rapport detalje vi hvorledes øjeblikkelig dextran udelukkelse billeddannelse kan anvendes til at måle ESL tykkelse i subpleural mikrocirkulation af et frit-bevægelse, in vivo muse lunge. Denne teknik kan let modificeres til bestemmelse glycocalyx funktion-specifikt evnen hos et intakt ESL at udelukke cirkulerende elementer fra endoteloverfladen. Vi har for nylig anvendt disse teknikker til at bestemme betydningen af pulmonal ESL integritet til udviklingen af akut lungeskade ved systemiske inflammatoriske sygdomme, såsom sepsis 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Kirurgisk Tubing, Vaskulære katetre, brystvæggen Window
- Intravital mikroskopi fase. Vi skræddersyede en plexiglas scene, hvor den bedøvede mus ligger under mikroskopi. Denne fase rummer både et 15 x 10 cm fleksibel plastik skærebræt (hvorpå musen ligger under induktion af anæstesi, trakeostomi placering, og venøs kateterisering) samt en tilsvarende størrelse varmeelement (placeret under skærebrættet).
- Muse thoracostomy rør præparat (fig. 1). En 10 cm længde af PE 50 slange (Intramedic, indre diameter 0,58 mm, ydre diameter 0,965 mm) skæres. Den ene ende er fastgjort til den stumpe ende af en buet 23 gauge nål, og dette nål vil blive anvendt til at passere slangen gennem den thorakale væg (indvendig → ydersiden) inden lukning af den thorakale vinduet.
Den distale ende af røret (1,5 cm lange, modsat til vedlagte 23 gaugenålen) gentagne gange gennembrydes af en 30 gauge nål, skabe "sideporte" for at lette effektiv aspiration af intrathoracic luft.
Denne fenestrated del separeres derpå fra resten af røret af flere rundtgående løkker af 04:00 silkesutur, disse loops vil tjene som en "prop" i sidste ende forankring af 1,5 cm fenestrated del inden i brysthulen. - Jugular venøse katetre. To 15 cm længder af PE 10 slange (Intramedic, indre diameter 0,28 mm, ydre diameter 0,61 mm) skæres. En skalpel anvendes til at bevel enderne af røret og derved øge den lethed, hvormed venepunktur. Slangen skylles gennem en 1 ml sprøjte indeholdende 6% 150 kDa dextran-opløsning (i PBS) fastgjort til den ikke-affasede ende af røret.
- Brystvæggen vindue præparat (fig. 2). Transparent polyvinyliden membran (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) skæres i en oval form (hovedakse 6 cm, lilleakse 4 cm). En cirkulær 5 mm # 1 dækglas (Bellco) er fastgjort til membranen under anvendelse af α-cyanoacrylat lim (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf).
- . Rør til pneumothorax induktion ("blow tube") En 10 cm stykke rør (indre diameter 3 mm, ydre diameter 5 mm) er fastgjort til en 5 ml sprøjte, den modsatte ende vil blive anvendt til at indføre luft ind i dyret brystkassen forud for brystvæggen vindue engraftment.
- Sprøjte til nedsænkning i vand af mål. En 23 gauge nål er fastgjort til en 30 ml injektionssprøjte indeholdende destilleret vand. Spidsen af nålen er svagt (under anvendelse af en metal-fil) for at forhindre beskadigelse af målet.
2. Mus Anæstesi
- En mus er bedøvet med en blanding af ketamin (10 mg / ml) og xylazin (2 mg / ml), administreret intraperitonealt i en dosis på 8 pi per gram mus legemsvægt. Sedation sker inden for 3 - 6 min, og bør ikke hindre spontan respiration.
- Ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, barberinghalsen, brystet, maven og højre side af musen.
- Brug tape, musen sikre en tynd plastik skærebræt. Lederen af musen skal pege mod operatøren (Figur 3). Let spænding leveret af en løkke af suturen passerer under den øverste tænder tjener til at opretholde hovedforlængeren. Skærebrættet anbringes på en varmepude, vedligeholdelse mus euthermia under tracheostomi og venekateter placering.
- Våd barberes områder med 100% ethanol.
- Bekræft passende bedøvelse med en hale / pote knivspids. Fortsæt, hvis minimal respons, yde en ekstra bolus af ketamin / xylazin, hvis ikke tilstrækkeligt bedøvet.
3. Trakeostomi
- En 1 cm incision over halsen. Underliggende bindevæv dissekeres, og spytkirtlerne separeres og reflekteres lateralt. Den sternohyoid musklen umiddelbart foran den trachea resekterede.
- En løkke af 04:00 sutur føres frem under the trachea (figur 4). Sløjfen skæres derefter at skabe to særskilte strenge af sutur underliggende trachea. Den kaudale sutur vil blive anvendt til at fastgøre tracheotomituben, den kraniale sutur vil blive anvendt til at tilvejebringe spænding på trachea under tracheostomirør placering.
- Med to fingre, er den øvre sutur gribes og blid spænding påføres trachea. En vandret snit er lavet i luftrøret mellem øvre og nedre suturer. Denne indsnit bør krydse cirka to tredjedele af den tracheale omkreds. En flange tracheostomirør (Harvard Apparatus, 1,22 mm ydre diameter) indsættes i den distale trachea og sikret på plads ved hjælp af den caudale luftrør sutur.
- Tracheostomirøret er forbundet til en volumenkontrolleret små dyr ventilator (Inspira, Harvard Apparatus), og musen bliver ventileret med 40% inspireret luft og 9 ml / kg tidal volumener (indstillinger optimeret til at opretholde tilstrækkelig iltning / ventilation i vort laboratorium). Positive end-eksspiratorisk tryk (PEEP) er ikke begyndt på dette tidspunkt. Af note, skal ventilatorens indstillinger optimeres til unikke forhold i de enkelte laboratorier. Forskellige længder af redundante rør (indskudt mellem ventilatorslangen Y-konnektor og tracheostomi) kan anvendes til at justere dødrum, hvilket sikrer en stabil alveolar ventilation til enhver valgt respirationsvolumen.
4. Venøs kateterisering
- Forbindelsen mellem indre og ydre halsvene kan identificeres ved at spore distale venøse grene proximalt. Den ydre halsvene findes under de reflekterede spytkirtler, hvilket kan spores proximalt for at finde den eksternt indre halsvene junction.
- Brug blid stump dissektion for at adskille jugularis junction fra omgivende bindevæv.
- Ved hjælp 04:00 suturer, hæft de eksterne jugular og interne halsvener distale (craniale) til jugularis krydset.
- Lave et lille snit i carinaaf jugularis junction, blødning bør være minimal.
- To katetre kan trinvist frem gennem snittet og ind i jugular stammen. Efter blid aspiration for at sikre blod gengæld er katetre fastgjort i venen ved hjælp 04:00 suturer.
- Tape venøse katetre til skærebrættet for at forhindre mod utilsigtet frigørelse.
5. Intravital muselunge Microscopy Surgery (tilpasset fra Tabuchi et al. 18)
- Skærebrættet (indeholdende den behersket, bedøvede mus samt tapede venøse katetre) er overført til den intravital mikroskopi fase, hvor de resterende kirurgiske indgreb vil blive udført. En rektal temperatur sonden er placeret, hvilket grænseflader med en adaptiv varmesystem (placeret under skærebrættet), så vedligeholdelse af mus euthermia.
- En jugular venekateter er fastgjort til en sprøjtepumpe, som leverer en ketamin (10 mg / ml)-xylazin (2 mg / ml)blanding ved 200 pi per time. Tilstrækkelig anæstesi også bekræftes ved hjælp af hale / pote knivspids.
- Den midtliniesnit udvides fra halsen til xyphoid proces, så forløber lateralt til højre (fig. 5).
- Ved hjælp af elektrokauterisation er brystmuskulatur fjernet, udsætte brystkassen. Omhu for at sikre fuldstændig hæmostase.
- Kryds musens højre bagben over venstre side og tape ned. Den resulterende abdominal torsion roterer brystkassen lidt, mere brugervenlig kirurgi.
- Den fase i en 45 graders vinkel (fig. 6), denne positionering tillader lungerne at falde væk fra brystvæggen når pneumothorax induceres.
- Den 1 st rib (mest ringere ribben) gribes med en pincet og opdrættet; en krum pincet er stumpt skubbet under ribben. Dette adskiller parietal lungehinden fra brystvæggen. Lungehinden bør forblive unpunctured.
- Ved hjælp af slag røret ogen sprøjte, bliver luft tvangsmæssigt indført på parietale pleura. Dette fører til brud på pleural overflade og pneumothorax uden at beskadige den underliggende lunge. Den underliggende lunge vil falde væk fra brystvæggen, hvilket tillader indførelsen af en elektrokauterisation pincet uden at beskadige lungerne. Et fald i ventilator tidalvolumen typisk ikke påkrævet i dette trin.
- Ved hjælp af elektrokauterisation pincet, dissekere brystvæggen muskulatur og går på tværs af 5 th og 6 th ribben / parietal brysthinden, hvilket gør en ~ 8 mm cirkulært hul i brystvæggen. Det er væsentligt, fuldstændig hæmostase opretholdes, da tilstedeværelsen af blødning vil overskygge mikroskopi (figur 7).
- Ved hjælp af en nål føreren, thoracostomy røret indsætte i brystvæggen hul. Nålen skal punktere brystvæggen og forlade brysthulen ringere og lateralt i forhold til thorax (Figur 7). Vær omhyggelig med at undgå punktering af membranen. Denrør derefter forsigtigt trækkes ud af brystvæggen indtil den modstand forekommer fra suturen "proppen" placeret på kanten af fenestrated del af røret.
- Placer scenen flad.
- Tilsæt 3 cm H2O PEEP til ventilatoren til at bistå lunge reexpansion.
- Lim (Pattex gel, Henkel) er placeret periferisk rundt om brystkassen vinduet. Membranen er fastgjort, med dækglas vendt exterior til brysthulen. Omhyggeligt (og periferisk) nærmer membranen til limen ved anvendelse af en bomulds applikator.
- Under udførelsen af en lunge rekruttering manøvre (3 tidalvolumener hvor PEEP ventilator porten er blokeret), er -3 mm Hg sugning anvendes på brystet røret. Lungen bør vedvarende omtrentlige membranen, mens frit blev under tidevandsenergi ventilation (figur 8).
- Højre forben af musen er krydset over til den venstre side, hvilket resulterer i en venstre lateral decubitus position i det murine.Svamp kiler kan anvendes til korrekt at placere musen så brystet vinduet ligger på linie med mikroskopi nedsænkning i vand mål.
- Destilleret vand er placeret på dækglasset før mikroskopi, hvilket muliggør visualisering af lungen ved hjælp af en nedsænkning i vand mål. Vand vil være nødvendigt at intermitterende genopfyldes hele billeddannelse.
6. Måling af Pulmonal endoteloverfladen lagtykkelse
- Umiddelbart efter brystvæggen lukning, er 500 pi FITC-mærket 150 kDa dextran (6% opløsning i PBS) administreret via den anden (ikke-anæstesi) jugularis venekateter. Denne bolus tjener som volumen genoplivning og det vaskulære sporstof for ESL måling. Dextranen bolus påvirker ikke neutrofiladhæsion eller lunge ødemdannelse 2.
- Nedsænkning i vand Målet er centreret over dækglasset. Valget af mål er vigtigt, at visualisere små forskelle i ESL tykkelse, en høj numerical åbning er nødvendig (> 0,8) og samtidig bibeholde en 2 - 3 mm arbejdsafstand (tillade indtrængen gennem lungerne vinduet og pleural overflade). Vi bruger Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) og CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) mål til dette formål.
- At måle ESL tykkelse i en bevægelig organ, er det vigtigt, at lysfelt og fluorescerende vaskulære bredder udføres samtidigt. Dette kan udføres ved anvendelse af et billede splitter (Dual View, Photometrics), der giver mulighed for samtidig indfangning af reflekteret lys differential interferens kontrast (DIC, brightfield) og FITC-billeder (figur 9).
- Under en 5 sek inspiratorisk pause, er løbende billeddannelse optrådt og indspillet. Senere kan disse billeder blive gennemgået for at identificere i-fokusfelt.
- Ved hjælp af en i-fokusrammen er subpleural mikrokar (<20 um diameter) identificeret mindst 3 mikrokar findes typisk på en enkelt ramme. Efter afslutning af forsøget, DICog FITC-dextran vaskulære bredder måles (ved en blindet observatør) ved midling af længderne af tre på hinanden vinkelrette opfanger pr mikrokar. Under forudsætning af ens ESL tykkelse på begge kanter af beholderen kan ESL størrelse defineres med halvdelen af forskellen mellem DIC og FITC-dextran vaskulære bredder som beskrevet i repræsentant afsnittet Resultater.
- Typisk kan intravital mikroskopi udføres for> 90 min uden nogen tegn på lunge skade eller hypotension 2. Indledende forsøg bør udføres for at bekræfte mus stabilitet (blodtryk, iltning, ventilation, lunge skade) i observationsperioden. Eksperimentelle stoffer kan indføres gennem den anden (ikke-anæstetisk) jugular kateter på noget tidspunkt under proceduren.
7. Alternativ Måling af Pulmonal endoteloverfladen Layer Integrity
De intakte endoteloverflade lag-funktioner (delvis) at udelukke circulatING elementer fra endoteloverfladen 2. ESL integritet kan derfor måles ved evnen af en cirkulerende element (fx et fluorescerende mikrokugler) til at få adgang til og interagere med celleoverflade-adhæsionsmolekyler (såsom ICAM-1).
- Anti-ICAM-1 mærket fluorescerende mikrosfærer fremstilles forud for operationen. Streptavidin-coatede 0,97 um fluorescerende mikrosfærer inkuberes med biotinyleret anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 klon, 1:50, eBioscience) antistof eller isotypekontrol i 30 min ved stuetemperatur. Mikrosfærerne vaskes tre gange og suspenderes i PBS ved 1 x 10 9 mikrokugler pr ml.
- Under intravital mikroskopi, er den Mikrokuglesuspensionen (100 ul) injiceres i vena venekateter. Efter 15 minutters omsætning, er fluorescerende billeder, der optages i løbet af 5 min. Mikrosfærer ubevægelig for> 5 min betragtes vedhængende og kvantificeret ved hjælp af billedbehandling software.
8. Eutanasi
<p class = "jove_content"> Efter afslutning af proceduren bliver bedøvede mus aflivet ved forblødning via direkte hjertepunktur. Eutanasi er bekræftet via bilaterale pneumothoraces, hvorefter lunger er høstet og lynfrosset til senere analyse.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle tilgang er beskrevet i trin 1-6 vil tillade indfangning af flere rammer af samtidige DIC (brightfield) og fluorescerende billeder. At bestemme ESL tykkelse, er optagne billeder gennemgået af en blindet observatør efter afslutningen af den eksperimentelle protokol. Anvendelse af en in-fokusrammen, er subpleural mikrokar (<20 um diameter) identificeret mindst 3 mikrokar findes typisk på et enkelt billede (figur 10). Brug billedanalyse software (NIS Elements, Nikon) er vaskulære bredder måles (ved en blindet observatør) som gennemsnittet af længderne af tre på hinanden vinkelrette aflytninger pr mikrokardannelse. Da ESL er usynlig for DIC billedbehandling, DIC vaskulære bredder spænder endotelial membran til endotel membran og er derfor inklusive ESL tykkelse 9, 10. I modsætning hertil er FITC-dextran (150 kDa) udelukket fra ESL. Følgelig finder FITC vaskulære bredder ikke inkorporere ESL tykkelse. Antages lige ESL tykness ved begge kanter af beholderen kan ESL størrelse derfor defineres med halvdelen af forskellen mellem DIC og FITC-dextran vaskulære bredder.
Flere potentielle tekniske faldgruber kan påvirke fortolkning af forsøgsresultater. Tilstedeværelsen af blødning i mikroskopi område vil overskygge både DIC og FITC visualisering af subpleural mikrovaskulatur og derfor skal der drages omsorg for at opnå hæmostase (med elektrokirurgi) under vinduesplacering (5.9). Derudover lungen måske ikke reapproximate den thorakale vinduet efter rekruttering manøvren (5,14), hvilket normalt indikerer ufuldstændig rundtgående adhæsion af membranen rundt om thorax vinduet. Dette kan normalt korrigeres ved genanvendelse af lim omkring den thorakale vinduet, derefter en ny lunge rekruttering manøvre. Endelig skal der drages omsorg for at undgå utilsigtet injektion af intravenøs luft ind i mus. Air emboli, selv om det ikke dødelig, vil preferenti allieret rejser til nondependent lunge, forebygge FITC-dextran perfusion af den visualiserede (nondependent) subpleural mikrovaskulatur.
Måling af ESL bredder kræver anvendelse af et billede splitter (frembyder samtidig DIC og fluorescerende billeddannelse) og specialiserede mikroskopi mål. Disse udstyr krav kan undgås med nogle ændringer til vores protokol. Glycocalyx integritet kan måles indirekte ved bestemmelse ESL udelukkelse af cirkulerende mikrosfærer fra beholderen overflade. Tilstedeværelsen af ESL nedbrydning derfor indikeres ved forøget subpleural mikrovaskulær indfangning af mikrosfærer rettet mod endoteloverflade adhæsionsmolekyler (såsom ICAM-1) (fig. 11).
Figur 1.
Figur 2.
Figur 3.
Figur 4.
Figur 5.
Figur 6.
Figur 7.
Figur 8.
Figur 9.
Fig. 10. Måling af muse pulmonal ESL tykkelse. (A) Repræsentant samtidigt-fanget DIC og fluorescerende billeder af musen subpleural mikrovaskulatur (skala bar, 50 um). Mikrokardannelse bredde måles ved hjælp af gennemsnittet af tre på hinanden vinkelrette lineære aflytninger. ESL tykkelsen kan bestemmes ved halvdelen af forskellen mellem DIC (inklusive den ESL) og fluorescerende (eksklusiv ESL)mikrokar bredder. (b) DIC målinger præcist at identificere subpleural karvægformer grænser, som det fremgår af næsten identisk DIC og GFP-fartøjets bredde målinger udført i endothel-fluorescerende Tie2-GFP-mus (Jackson Labs). Optrukne linie repræsenterer identisk linje. (C) subpleural mikrovaskulatur kan følges på langs, som det fremgår af det progressive tab af ESL tykkelse forekommer efter intravenøs lipopolysaccharid (LPS). N = 3 mus. * P <0,05 i forhold til tid = 0 min ved ANOVA.
Movie 1. Glycocalyx integritet kan bestemmes ved at vurdere for anti-ICAM-1 mikrosfære vedhæftning i subpleural mikrovaskulatur. Højhastighedstog konfokal mikroskopi (Nikon A1R) viser klæbende fluorescerende mikrosfærer 45 min efter intravenøse LPS (20 mg per kg legemsvægt). Bemærk, at cirkulerende mikrosfærer kan occasionally set passerer gennem mikrocirkulationen. For at forbedre visualisering af (grønt fluorescerende) mikrosfære lokalisering, i trin 6,1 mus blev forbehandlet med det vaskulære tracer TRITC-dextran (150 kDa, 6%) i stedet for FITC-dextran. se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenfaldende med den stigende anvendelse af in vivo mikroskopi, er der stigende forståelse for både den betydelige størrelse af ESL samt dens mange bidrag til vaskulær funktion. Disse nye data er imidlertid først og fremmest stammer fra studier af den systemiske kar. Faktisk brug af in vivo mikroskopi i lungen er teknisk udfordrende, da signifikant pulmonal og hjerte bevægelsesartefakter.
Adskillige seneste tekniske fremskridt har tilladt til stabilisering af den bevægelige muselunge, giver en bedre anvendelse af intravital teknikker til det pulmonale mikrocirkulation 12, 13. Disse fremgangsmåder er imidlertid potentielt forvekslet med de fysiologiske konsekvenser af lunge immobilitet. Da lungerne er teleologisk et organ beregnet til kontinuerlig bevægelse, vil lunge stasis intuitivt ændrer pulmonal fysiologi. Faktisk er lunge stasis forbundet med ændringer i endothelial nitric oxid signalering, en vej med mange downstream konsekvenser i både raske og sårede lunge 14, 16. Endvidere immobilisering af et område af lungen emner omkring alveolerne til skadelige forskydningskræfter, i overensstemmelse med "atelectrauma" karakteristisk for ventilatoren inducere lungebeskadigelse 19. Disse og andre endnu-til-være-identificerede konsekvenser af lunge stasis vil sandsynligvis forvirre fortolkning af intravital observationer af pulmonal mikrovaskulære (pato) fysiologi.
Da disse bekymringer, søgte vi at udvikle en metode, som pulmonale ESL kunne studeres i et frit bevægende, in vivo muse lunge. Vi valgte at tilpasse teknikken Tabuchi og Kuebler, en fremgangsmåde, der tillader langsgående visualisering af en frit bevægelig muselunge uden tilskyndelse lungebeskadigelse 18. Vigtigere er det, vores tilgang indeholder flere subtile ændringer fra Tabuchi oprindelige protokol; disse alteraninger udviklede sig fra behovet for at imødekomme særlige forhold inden for vores laboratorium. Tilsvarende vedtagelsen af vores model for ESL måling andetsteds vil kræve lignende optimering for at sikre stabiliteten i mus hæmodynamikken, iltning, ventilation, og fraværet af lungeskader.
Vi valgte at bruge dextran udelukkelse som vores primære tilgang til ESL måling. Denne teknik er velegnet til vor model, som ESL målinger kan udføres fra et enkelt tidspunkt, at bevirke pulmonal og kardial bevægelsesartefakter. Mens tidligere undersøgelser af den systemiske mikrovaskulatur har antydet, at dextran udelukkelse kun er nøjagtig i små kar (<15 um 6), har vi bemærket konkordante ESL ændringer i fartøjer op til 30 um i diameter. Disse forskelle kan skyldes optiske egenskaber ved den pleural overflade.
I et bevægende vaskulære leje, er det vigtigt, brightfield-og fluorescerende imaging occurs samtidigt, selv en kort forsinkelse i billedet erhvervelse (f.eks lukker lukning mellem sekventielle billeder) ville fatalt forvirre målinger af ESL tykkelse. Mens pause ventilation kan nedsætte denne confounding, vil en inspiratorisk pause ikke fuldstændig forhindre hjerte-bevægelsesartefakter eller respiratorisk artefakt fra gas omfordeling heterogent-oppustede, tilskadekomne lunger ("pendelluft") 20. Vi valgte at bruge et billede splitter til samtidigt at sende brightfield og fluorescerende billeder til en enkelt CCD kamera. Alternative fremgangsmåder kunne potentielt indbefatter anvendelsen af dikroiske spejle til samtidig indfange reflekteret lys og fluorescerende billeder under konfokal mikroskopi.
Et yderligere kritisk efterspørgsel af vores model er brugen af specialiserede vand-nedsænkning mål. Disse mål skal have en tilstrækkelig stor numerisk apertur for at tillade opløsning af små forskelle i fartøjernes bredder samtidig VEDLIGEHOLg en tilstrækkelig arbejdsafstand at trænge både den thorakale vindue og pleural overflade. Disse mål, mens rådighed, er meget dyre. Brugen af reflekteret lys differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, en brightfield teknik, der fremhæver ufarvede væv kanter, er desuden ønskeligt, da DIC forbedrer præcision af vaskulære bredde målinger.
Alternative teknikker eksisterer til bestemmelse af pulmonal ESL bredde. Mens mikrokugle Velocimetry ikke kan nøjagtigt udføres på en bevægende vaskulær seng, kan mikrosfære vedhæftning anvendes til indirekte at teste pulmonal glycocalyx integritet. Vi har tidligere vist, at de intakte ESL funktioner at udelukke cirkulerende mikrosfærer fra endoteloverflade adhæsionsmolekyler 2. Tilstedeværelsen af anti-ICAM-1 mikrosfære adhæsion til endoteloverfladen indikerer derfor et tab af glycocalyx / ESL integritet. Denne teknik kræver ikke samtidig brightfield / fluorescerende billeddannelse, er heller ikke høj numerisk blænde mål nødvendigt. Dog en vigtig advarsel findes: for øget anti-ICAM-1 mikrosfære adhæsion at angive glycocalyx tab, skal der være lignende ICAM-1 celleoverfladeekspression mellem kontrol-og forsøgsgrupper. Mens ICAM-1 endoteloverflade ekspression forblev stabil tidligt (<45 min) ved sepsis-induceret lungeskade 2 vil overfladeekspression endelig øger i et NF-KB afhængig måde 21. Anvendelse af mikrokugle vedhæftning som en markør for glycocalyx integritet, kan derfor kun være gyldig i den tidlige inflammation.
Af note, mens vores kirurgiske og mikroskopi teknikker ikke fremkalde lungeskade 2 er det usikkert, hvordan udviklingen eksperimentel lungeskade (f.eks skade induceret af intratracheal syre instillation) påvirker målinger af ESL tykkelse. Udviklende lungeødem potentielt kunne forvirre DIC målinger af fartøjets breddeog / eller indflydelse dextran permeabilitet. Denne usikkerhed kan blive dæmpet af komplementær brug af flere teknikker (f.eks dextran udelukkelse, mikrokugle vedhæftning, samt bekræftende histologiske vurderinger af fartøj glycosaminoglycan indhold 2) for at bekræfte observerede ændringer i den pulmonale ESL.
Sammenfattende, ved at udvide kirurgiske metode oprindeligt rapporteret af Tabuchi og Kuebler har vi udviklet en eksperimentel model, der giver mulighed for nøje observation af den pulmonale ESL. Brug af denne model bør give mulighed for en større forståelse af betydningen af den endotele glycocalyx til pulmonal vaskulær fysiologi i sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Drs. Arata Tabuchi og Wolfgang Kuebler (University of Toronto) for instruktion vedrørende intravital mikroskopi. Vi takker Andrew Cahill (Nikon Instruments) for at få hjælp i mikroskopi design og implementering. Dette arbejde blev finansieret af NIH / NHLBI tilskud P30 HL101295 og K08 HL105538 (til EPS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
