Summary
내피 내피 / glycocalyx 표면 층은 이상적인 intravital 현미경을 사용하여 공부하고 있습니다. Intravital 현미경은 기술적 같은 폐 등 움직이는 장기에 도전하고 있습니다. 우리는 동시 brightfield 및 형광 현미경은 자유롭게 - 이동에 내피 표면 층의 두께를 추정하는 데 사용할 수 있습니다 방법을 보여줍니다
Abstract
내피 glycocalyx은 혈관 내강을 늘어서 proteoglycans 및 관련 glycosaminoglycans의 층이다. 생체에서 glycocalyx은 내피 기능의 유지에 기여 상당한 내피 표면 층 (ESL)을 형성, 매우 충분한 것입니다. 내피 glycocalyx가 자주 체외에서 탈선 및 표준 조직 고정 방법 중에 손실 된 바와 같이, ESL의 연구는 intravital 현미경의 사용이 필요합니다. 폐포 microvasculature의 가장 대략적인 복잡한 생리에, 폐 intravital 영상은 이상적으로 자유롭게 움직이는 폐에 수행됩니다. 이러한 준비는하지만, 일반적으로 광범위한 운동의 유물로 고통 받고 있습니다. 우리는 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 폐 가슴 intravital 현미경은 내피 표면에서 휘황 - 라벨 고분자 체중 dextrans의 ESL 제외 통해 glycocalyx 무결성을 측정하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 필요이 아닌 복구 수술 기법,동시 brightfield와 마우스 폐의 형광 이미징은 혼란 폐 부상을 일으킬 증거도없이 subpleural microvasculature의 길이 방향 관찰 할 수 있습니다.
Introduction
내피 glycocalyx은 혈관 intima 릴 proteoglycans 및 관련 glycosaminoglycans의 세포 층입니다. 생체에서 glycocalyx는 호중구 - 내피 유체 투과성 1 등의 내피 기능의 다양한 규제 상당한 내피 표면 층 (ESL)을 형성, 높은 수화입니다 접착 2, 유체 전단 응력의 3 mechanotransduction.
역사적으로, glycocalyx 인해 표준 조직 고정 및 처리 6시 배양 세포 준비 4, 5 및 저하에서의 aberrance에 무시받는되었습니다. 증가 사용 intravital 현미경의 7 (생체 현미경에 IVM) 건강과 질병 중 혈관 기능에 ESL의 중요성에 상승 과학적 관심과 일치하고 있습니다. ESL은 빛 현미경에 보이지 않는과 쉽게 표시 할 수 없습니다적혈구 응집 8 치명적인 폐 emboli (게시되지 않은 관찰)을 일으킬 수있는 형광 glycocalyx 바인딩 lectins의 성향에 주어진 생체. 여러 간접적 인 방법 따라서 예를 cremasteric과 창 자간 막 microcirculations 같은 비 이동 혈관 침대에서 ESL 두께 (및, 확장하여, glycocalyx 무결성)을 추론하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 내피 표면에서 내피 막 (microparticle 이미지 velocimetry 9)뿐만 아니라 부피가 큰, 휘황 - 라벨 혈관 마커 (예 : dextrans)의 배제의 측정에서 거리의 함수로 microparticle 속도를 순환의 차이의 측정을 포함 (dextran 제외 기술 10, 11). 이러한 기술 중 단 dextran 제외 시간에 하나의 시점에서 만들어진 측정에서 ESL의 두께를 추정 할 수 있습니다. 동시에에 brightfield 현미경 (폭을 사용하여 혈관 폭을 측정하여"눈에 보이지 않는"ESL)과 ESL에서 제외 혈관 추적의 형광 현미경의 clusive, ESL 두께는 혈관 폭 2 ~ 한 반 차이로 계산 될 수있다.
ESL 두께의 순간 측정의 사용은 폐 glycocalyx 연구에 적합합니다. 폐의 Intravital 현미경은 크게 폐와 심장 모션 아티팩트 주어진 도전입니다. 최근 진보 생체 12, 13에 마우스 폐의 고정을 허용하지만, 문제는 폐 정지 physiologic 미치는 영향에 관한 존재합니다. 폐 부동는 14 신호 감소 내피 질소 산화물, 호중구 부착 15 폐 부상 16에 모두 영향을 신호 경로와 연결되어 있습니다. 또한,의 고전 physiologic 개념에 따라 폐 유해한 전단 세력 ( "atelectrauma"소위)에 모바일 폐포를 둘러싼 노출의 지역의 고정,폐포 상호 의존성 17.
2008 년 Arata 타 부치, 볼프강 Kuebler와 동료는 자유롭게 움직이는 마우스 폐 18 intravital 현미경을 허용하는 수술 기술을 개발했다. 이 기법에서 발생하는 호흡기 유물은 brightfield과 형광 현미경의 동시 측정 등의 고속 이미지의 사용에 의해 무효가 될 수 있습니다. 순간 dextran 제외 이미징은 생체에서 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 subpleural microcirculation에서 ESL의 두께를 측정하는 고용 할 수있는 방법을이 보고서에서, 우리는 자세히 설명합니다. 이 기술은 쉽게 함수 구체적으로 glycocalyx를 결정하기 위해 내피 표면에서 요소를 순환 제외 할 수 ESL 그대로의 능력을 수정할 수 있습니다. 우리는 최근에는 패혈증이 같은 전신 염증 질환 중 급성 폐 손상의 발전에 폐 ESL 무결성의 중요성을 결정하기 위해 이러한 기술을 사용했습니다.
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Protocol
1. 외과 배관, 혈관 카테터, 가슴 벽 창의 작성
- Intravital 현미경 단계. 우리는 anesthetized 마우스가 현미경 동안 자리 잡고있는시 플렉시 글라스 단계를 주문했습니다. 이 단계는 10cm 유연한 플라스틱 가공 보드 (마우스를 마취의 유도, tracheostomy 배치, 및 정맥 catheterization 동안 자리 잡고있는시)뿐만 아니라 유사한 크기의 가열 요소 (도마 아래에있는)에 의해 15cm를 모두 수용 할 수 있습니다.
- 마우스 thoracostomy 관 준비 (그림 1). PE 50 튜브 (Intramedic, 내경 0.58 mm, 외경 0.965 mm)의 10cm 길이가 절단됩니다. 한쪽 끝은 곡선 23 게이지 바늘의 무딘 끝으로 연결되어,이 바늘은 가슴 윈도우의 폐쇄하기 전에 가슴 벽 (→ 외부 내부)를 통해 관을 통과하는 데 사용됩니다.
튜브의 말단부 (첨부 된 23 게이지 맞은 편에 길이 1.5 cm,바늘)이 반복적으로 intrathoracic 공기의 효과적인 흡인을 용이하게하기 위해 "쪽의 포트를"만들기, 30 게이지 바늘에 구멍이 나고 있습니다.
이 fenestrated 부분은 다음 4시 실크 봉합의 여러 주변 루프에 의해 튜브의 나머지 부분에서 분리되어, 이러한 루프는 궁극적으로 1.5 cm가 흉강 내에 부분을 fenestrated 고정, "스토퍼"로 될 것입니다. - 경정맥 정맥 카테터는. PE 10 튜브 (Intramedic, 내경 0.28 mm, 외경 0.61 mm)의 두 15cm 길이가 절단됩니다. 메스는이를 venipuncture의 용이성을 증가 베벨 관의 끝을하는 데 사용됩니다. 튜브는 튜브의 비 beveled 끝 부분에 부착 6퍼센트 150 kDa dextran 솔루션을 (PBS)를 포함하는 1 ML의 주사기를 통해 플러싱된다.
- 가슴 벽 창 준비 (그림 2). 투명 염화 비닐 막은 (뉴 구레 랩, Kuresha, 도쿄) 타원형 모양 (주요 축 6cm, 단축 4cm)로 잘라 수 있습니다. 원형 5mm # 1 coverslip (BellcO)은 α-시아 노 아세틸렌 접착제를 사용하여 막 (Pattex flüssig, 헨켈, 뒤셀도르프 (Düsseldorf))에 부착되어 있습니다.
- . pneumothorax 유도 ( "타격 관") 튜브의 10cm 길이 (내경 3mm, 외경 5mm)에 대한 관은 5 ML의 주사기에 부착되어, 반대쪽은 동물 가슴 케이지에 공기를 도입하는 데 사용됩니다 가슴 벽 창 engraftment 이전.
- 목적의 물 침적에 주사기. 23 게이지 바늘은 증류수를 포함하는 30 ML의 주사기에 부착되어 있습니다. 바늘의 끝은 목표에 손상을 방지하기 위해 (금속 파일을 사용하여) 잘 지내냐이 있습니다.
2. 마우스 마취
- 마우스 케타민 (10 MG / ML)과 xylazine (2 밀리그램 / ML), g의 마우스 체중 당 μl 8 복용의 관리 intraperitoneally들에 대한 내용을 담은 anesthetized 있습니다. 진정 작용은 3 이내에 발생 - 6 분, 자발적인 호흡을 방해해서는 안됩니다.
- 전기 면도기를 사용하여 면도목, 가슴, 복부, 그리고 마우스의 오른쪽.
- 테이프를 사용 얇은 플라스틱 절단 보드에 마우스를 고정하십시오. 마우스의 머리 연산자 (그림 3)으로 지정해야합니다. 윗니 아래에 봉합 패스 루프에 의해 제공 젠틀 긴장은 머리 확장을 유지하는 역할을한다. 도마는 tracheostomy과 정맥 카테 테르를 배치하는 동안 마우스 euthermia을 유지, 가열 패드에 배치됩니다.
- 100 % 에탄올로 젖은 면도 공간을 갖추고 있습니다.
- 꼬리 / 앞발로 땅을 차다 핀치와 적절한 마취를 확인합니다. 최소한의 응답하면 진행, 케타민 / xylazine 있지 않은 경우 적절하게 anesthetized의 추가 bolus를 제공합니다.
3. Tracheostomy
- 1cm 절개는 목으로 구성되어 있습니다. 기본 결합 조직은 해부되고, 침샘이 분리되어 옆으로 반영됩니다. 기관에 즉시 앞 sternohyoid 근육이 resected 수 있습니다.
- 4시 봉합의 루프는 일에서 전진하고 있습니다전자 기관 (그림 4). 루프는 다음 기관의 기반이 봉합의 두 개의 가닥을 만드는, 절단합니다. 꼬리 봉합은 tracheostomy 튜브를 보호하는 데 사용됩니다, 두개골 봉합이 tracheostomy 배치시 기관에 긴장을 제공하는 데 사용됩니다.
- 두 손가락을 사용하여 상부 봉합이 파악되고 부드러운 긴장이 기관에 적용됩니다. 수평 절개는 상부 및 하부 봉합 사이의 기관에서 이루어집니다. 이 절개는 tracheal 주위의 약 2 정도일 교차한다. 플랜지 tracheostomy 관은 (하버드 장치, 1.22 mm 외경) 말초 기관에 삽입하고 꼬리 tracheal 봉합을 사용하여 제자리에 고정된다.
- tracheostomy는 볼륨 제어 작은 동물 환풍기 (영감, 하버드 장치)에 연결되어 있으며, 마우스 40 % 영감을 산소와 9 ML / kg 갯벌 볼륨 (설정의 실험실에서 충분한 산소 / 환기를 유지하기 위해 최적화)와 통풍이 있습니다. Positive 최종 날숨 압력 (따위가 나오기 시작)은이 시점에서 시작되지 않습니다. 참고, 환풍기 설정은 각 실험실 내부의 고유 조건에 최적화해야합니다. 중복 튜브 (환풍기 튜브 Y-커넥터와 tracheostomy 사이에 interposed)의 서로 다른 길이는 어떤 선택 갯벌 볼륨에 대한 안정적인 폐포 환기를 보장, 죽은 공간을 조정하는 데 사용할 수 있습니다.
4. 정맥 Catheterization
- 내부 및 외부 경정맥 정맥의 교차점은 proximally 말초 정맥 지점을 추적하여 식별 할 수 있습니다. 바깥목은 반영 침샘 아래에서 발견되며 이는 외부 - 속목 교차로를 찾을 수 proximally 추적 할 수 있습니다.
- 결합 조직을 둘러싼에서 경정맥 연결을 분리하는 부드러운 무딘 절개를 사용하십시오.
- 4시 봉합을 사용하여 경정맥 교차로에 (두개골) 말초 외부 경정맥과 속목 정맥을 묶어.
- 카리나에 작은 절개를합니다경정맥 접합의, 출혈을 최소화해야합니다.
- 두 카테터는 점차적으로 절개 통해 경정맥 트렁크에 진출 할 수 있습니다. 혈액 수익을 보장하는 부드러운 흡인 후 카테터는 4시 봉합을 사용하여 정맥 내에 확보하고 있습니다.
- 테이프 정맥 실수로 dislodgement되는 것을 방지하기 위해 도마에 카테터.
5. Intravital 마우스 폐 현미경 수술 (타 부치 외에서 적응. 18)
- 나머지 수술 개입이 수행 될 위치 커팅 보드 (억제, anesthetized 마우스뿐만 아니라 녹화 정맥 카테터를 포함), intravital 현미경 단계로 전환됩니다. 직장 온도 프로브가 배치됩니다,이 인터페이스를 적응 난방 시스템 (도마에 위치)로, 마우스 euthermia의 유지 보수를 수 있도록합니다.
- 한 경정맥 정맥 카테터는 케타민 (10 MG / ML) xylazine (2 MG / ML) 제공하는 주사기 펌프에 부착되어 있습니다시속 200 μl의 혼합. 적절한 마취 다시 꼬리 / 동물의 발자국이 핀치를 사용하여 확인합니다.
- 중간 선 절개는 다음 (그림 5) 오른쪽 측면 진행, xyphoid 프로세스에 목 연장됩니다.
- electrocautery 사용하여 가슴 근육은 가슴 케이지를 노출, 제거됩니다. 주의 전체 지혈을 보장하기 위해 이루어집니다.
- 왼쪽 및 테이프 마우스의 오른쪽 hindleg을 보도록. 그 결과 복부 비틀림가 수술의 편의성을 향상 약간 가슴을 회전합니다.
- 45도 각도 (그림 6)에서 무대를 놓고,이 위치는 pneumothorax가 유도되면 폐는 가슴 벽에서 떨어져 떨어질 수 있습니다.
- 1 리브는 (대부분의 하부 리브) 포셉으로 파악하고 제기된다; 곡선 포셉은 퉁명스럽게 늑골 아래에 밀어 수 있습니다. 이 가슴 벽에서 정수리 늑막을 분리합니다. 늑막은 unpunctured 유지됩니다.
- 타격 튜브 등을 사용주사기가 공기가 강제 정수리 늑막에 대해 소개합니다. 이 기본 폐를 손상시키지 않고 흉막 표면과 pneumothorax의 파열로 연결됩니다. 기본 폐는 폐를 손상시키지 않고 electrocautery 포셉 도입을 허용, 가슴 벽에서 떨어져 감소 할 것이다. 환풍기 갯벌 볼륨에있는 감소는 일반적으로이 단계에서 필요하지 않습니다.
- electrocautery 포셉을 사용하여 가슴 벽 근육을 해부하고 가슴 벽에 ~ 8mm 원형 구멍을 만드는 5 일, 6 일 갈비 / 정수리 늑막을 가로 질러. 출혈의 존재가 현미경 (그림 7)을 가리는 것 같은 그것은 완전한 지혈이 유지하는 것이 중요합니다.
- 바늘 드라이버 사용하여 가슴 벽 구멍에 thoracostomy 튜브를 삽입합니다. 바늘이 찔린 가슴 벽을하고 가슴 창 (그림 7)에 하부와 측면 흉강을 종료해야. 피임기구를 펑 쳐링 않도록 조심해.그 저항은 관의 fenestrated 부분의 가장자리에있는 봉합 "마개"에서 발생할 때까지 튜브가 부드럽게 가슴 벽을 꺼내는 있습니다.
- 단계는 평면 배치합니다.
- 폐 reexpansion 문제를 해결하는 데 많은 도움이 환풍기에 3cm에게 H 2 O의 피프 추가합니다.
- 접착제 (Pattex 젤, 헨켈)은 가슴 창 주위에 원주에 위치해 있습니다. 막이 흉강에 외관이 직면하고있는 유리 커버 슬립과 함께 첨부되어 있습니다. 주의 (및 원주) 대략적인면 작은 주걱을 사용하여 접착제에 막.
- 폐 모집 기동 (관음증 환풍기 포트가 방해되는 동안 세 갯벌 볼륨)을 수행하는 동안, -3 mm HG 흡입은 가슴 튜브에 적용됩니다. 자유롭게 갯벌 환기 (그림 8) 동안 이동하는 동안 폐는 지속적으로 대략 멤브레인를 요구합니다.
- 마우스의 오른쪽 foreleg은 마우스의 왼쪽 측면 decubitus 위치의 결과로, 왼쪽으로 건너되어 있습니다.스폰지 웨지 등을 만들었고는 가슴 창은 현미경 물 침적 목적에 부합 될 수 있도록 마우스를 적절히 배치하는 데 사용할 수 있습니다.
- 증류수는 물 침적 목표를 사용하여 폐의 시각화를 위해 수 있도록 현미경하기 전에 커버 슬립에 표시됩니다. 물은 간헐적으로 영상을 통해 보충해야합니다.
6. 폐 내피 표면 레이어 두께 측정
- 즉시 가슴 벽 폐쇄 한 후, 500 μl FITC-라벨 150 kDa dextran (PBS에서 6 % 용액)가 두 번째 (비 마취) 경정맥 정맥 카테터를 통해 관리합니다. 이 bolus는 볼륨 인공 호흡뿐만 아니라 ESL 측정을위한 혈관 추적 역할을합니다. dextran bolus는 호중구 부착 또는 폐 부종 형성이 영향을주지 않습니다.
- 물 침적 목적은 커버 슬립으로 중점을두고 있습니다. 목표의 선택은 필수 -하는 것입니다 ESL 두께의 작은 차이, 높은 numeri를 시각화아직 2을 유지하면서 칼 개구는 (> 0.8)이 필요합니다 - 3mm 작동 거리 (폐 창 흉막 표면을 통해 침투를 허용). 우리는이 목적을 위해 75 LWD 25x (NA 1.1) 목표를 니콘 CFI 75 LWD 16X (NA 0.8)와 CFI를 사용합니다.
- 정확하게 움직이는 장기의 ESL 두께를 측정하기 위해, 그것은 brightfield 및 형광 혈관 폭이 동시에 수행되는 것이 중요합니다. 이것은 동시 반사 된 광 차동 간섭 대비 캡처 (DIC, brightfield)와 FITC 이미지 (그림 9)을 허용 이미지 스플리터 (듀얼 뷰 Photometrics)를 사용하여 수행 될 수있다.
- 5 초 inspiratory의 일시 정지 기간 동안, 연속 영상이 수행하고 기록됩니다. 나중에이 이미지는 포커스에 프레임을 식별하기 위해 검토 할 수 있습니다.
- 포커스에 프레임이, subpleural microvessels가 (<20 μm 직경) 식별을 사용하여, 최소 3 microvessels는 일반적으로 하나의 프레임에서 찾을 수 있습니다. 실험, DIC 완료 후그리고 FITC - dextran 혈관 폭이 microvessel 당 3 수직를 도청의 길이를 평균하여 (눈을 멀게 관찰자에 의해) 측정합니다. 선박의 양쪽 가장자리에 동일한 ESL 두께를 가정, ESL 크기는 DIC 등 대표 결과 섹션에 설명 된 FITC-dextran 혈관 폭, 사이에 반 차이로 정의 할 수 있습니다.
- 일반적으로 intravital 현미경은 폐 부상 또는 저혈압 (2)의 증거없이> 90 분에 수행 할 수 있습니다. 예비 실험 관찰의 기간 동안 마우스 안정성 (혈압, 산소, 환기, 폐 부상)를 확인하기 위해 수행해야합니다. 실험 약물은 절차 중에 시점에서 두 번째 (비 마취) 경정맥 카테터를 통해 유입 될 수있다.
7. 폐 내피 표면 레이어 무결성 대체 측정
그대로 내피 표면 레이어 기능 (일부) circulat를 제외하는 방법내피 표면 2 ING 요소. ESL 무결성 따라서 액세스 세포 표면 부착 분자 (예 : ICAM-1 등)과 상호 작용하는 순환 요소의 능력 (형광 microsphere를 예를 들어)에 의해 측정 할 수 있습니다.
- 반 (反) ICAM-1이라는 형광 마이크로은 수술 전에 준비가되어 있습니다. Streptavidin-코팅 0.97 μm 형광 마이크로은 실온에서 30 분에 biotinylated 항 ICAM-1 (YN1/1.7.4 복제, 1시 50분, eBioscience) 항체 또는 isotype 제어 incubated 수 있습니다. 마이크로은 세 번 세척하고 ML 당 1 개 10 9 마이크로에서 PBS에 일시 중지됩니다.
- intravital 현미경 동안, microsphere 정지 (100 μl)은 경정맥 정맥 카테터에 주입되어 있습니다. 순환 15 분 후 형광 이미지는 5 분 이상 캡처합니다. > 5 분에 고정되어 마이크로은 자기편 및 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 정량화 간주됩니다.
8. 안락사
<절차의 완료 후 P 클래스 = "jove_content">, anesthetized 마우스는 직접 심장 구멍을 통해 일어난 과다 출혈에 의해 euthanized 있습니다. 안락사는 폐는 나중에 분석을 위해 수확 및 스냅 - 냉동 된 이후 양국 pneumothoraces를 통해 확인합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
단계 1-6에 설명 된 실험 방법은 동시 DIC (brightfield) 및 형광 이미지의 여러 프레임 캡처를 할 수 있습니다. ESL 두께를 확인하려면 녹음 이미지는 실험 프로토콜의 완료 후에 눈을 멀게 관찰자에 의해 검토됩니다. 포커스에 프레임이, subpleural microvessels가 (<20 μm 직경) 식별을 사용하여, 최소 3 microvessels는 일반적으로 하나의 프레임 (그림 10)에서 찾을 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어 (NIS 요소, 니콘)를 사용하여 혈관 폭이 microvessel 당 3 수직를 도청의 길이를 평균하여 (눈을 멀게 관찰자에 의해) 측정합니다. ESL은 DIC 이미지에 보이지 않는 바와 같이, DIC 혈관 폭은 내피 막에 내피 막에 걸쳐 따라서 ESL의 두께 9, 10의 포함되어 있습니다. 반면, FITC-dextran (150 kDa)은 ESL에서 제외됩니다. 따라서, FITC 혈관 폭은 ESL 두께를 포함하지 않습니다. 동일한 ESL 두께를 가정선박의 양쪽 가장자리에 다움은 ESL 크기는 따라서 DIC와 FITC-dextran 혈관 폭 사이에 반 차이로 정의 할 수 있습니다.
몇 가지 기술적 인 함정은 실험 결과의 해석에 영향을 줄 수 있습니다. 현미경 필드에 출혈이의 존재는 subpleural microvasculature의 DIC와 FITC 시각화 모두를 흐릿하게되며 따라서 치료가 창 배치 (5.9) 동안 지혈을 (electrocautery를 사용하여) 얻기 위해 이동해야합니다. 또한, 폐는 모집 연습 (5.14) 후 reapproximate 가슴 창 않을 수도 있습니다,이은 일반적으로 가슴 창 주변의 멤브레인의 불완전한 원주 접착력을 나타냅니다. 이것은 보통 반복 폐 모집 기동 한 다음, 흉부 창 주위에 접착제의 reapplication에 의해 수정 될 수 있습니다. 마지막으로,주의 마우스에 정맥 주사 공기의 실수로 주사를 방지하기 위해 이동해야합니다. 에어 emboli는 경우에도 치명적 아니라 preferenti됩니다 시각화 (nondependent) subpleural microvasculature의 FITC-dextran 재관류을 방지 nondependent 폐 동맹이 여행.
ESL 폭의 측정은 이미지 스플리터 (동시 DIC와 형광 이미징을 affording)뿐만 아니라 전문 현미경 목표의 사용이 필요합니다. 이 장비의 요구는 우리의 프로토콜에 대한 몇 가지 수정 회피 할 수 있습니다. Glycocalyx 무결성이 간접적으로 혈관 표면에서 순환 마이크로의 ESL 제외를 결정하여 측정 될 수있다. ESL 저하의 존재는 그러므로, 내피 표면 접착 분자 (예 : ICAM-1) (그림 11)에 대해 대상으로 마이크로 증가 subpleural microvascular 캡처로 표시됩니다.
1 그림.
그림 2.
그림 3.
4 그림.
그림 5.
6 그림.
그림 7.
그림 8.
9 그림.
그림 10. 마우스 폐 ESL 두께 측정. (가) 대표 마우스 subpleural microvasculature (스케일 바, 50 μm)의 DIC 및 형광 이미지를 동시에 - 캡처. Microvessel 너비는 세 수직 선형 도청의 평균을 사용하여 측정됩니다. ESL 두께는 DIC (ESL 포함) 및 형광성 (ESL의 배타적) 사이에 반 차이에 의해 결정될 수microvessel 폭. (B) DIC 측정 정확하게 거의 - 동일 DIC 및 내피 - 형광 Tie2-GFP 마우스 (잭슨 실험실)에서 수행 GFP 선박 폭 측정에 의해 증명, subpleural 혈관 벽 테두리를 확인합니다. 실선은 신분의 선을 나타냅니다. 정맥 주사 lipopolysaccharide (LPS). 여기서 n은 = 3 마우스 이후에 발생하는 ESL 두께의 진보적 인 손실에 의해 입증으로 (C) subpleural microvasculature가 길이 방향으로 따라 할 수 있습니다. * P 시간 ANOVA로 = 0 분에 비해 <0.05.
영화 1. Glycocalyx 무결성이 subpleural microvasculature 내 안티 ICAM-1 microsphere의 준수에 대한 평가에 의해 결정될 수있다. 고속 공 촛점 현미경 (니콘 A1R)는 정맥 주사 LPS (kg의 체중 당 20 밀리그램) 후 점착성의 형광 마이크로 45 분을 보여줍니다. 순환 마이크로은 occasionall 될 수 있다는주의y는 microcirculation 통과이었다. (녹색 형광) microsphere 현지화의 시각화를 향상 시키려면 단계에서 6.1 마우스는 FITC-dextran 대신에 혈관 추적 TRITC-dextran (150 kDa, 6 %)과 pretreated되었습니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
생체 현미경에서의 확장 사용과 일치, ESL의 상당한 크기뿐만 아니라 혈관 기능에 수많은 공헌을 모두 증가 감사가 있습니다. 이 새로운 데이터는하지만, 주로 전신 vasculature의 연구에서 파생됩니다. 사실, 폐에 생체 현미경의 사용 기술적으로 주어진 중요한 폐와 심장 모션 유물은, 도전하고 있습니다.
여러 최근의 기술 진보는 폐 microcirculation 12, 13에 intravital 기술의 더 나은 응용 프로그램을 affording, 이동 마우스 폐의 안정화를 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 그러나, 잠재적으로 폐 부동의 physiologic 파급 효과에 의해 실마리를 못 찾고 있습니다. 폐는 teleologically 지속적으로 운동하기위한 기관으로, 폐 스테이 시스는 직관적으로 폐 생리를 변경합니다. 사실, 폐 스테이 시스는 내피 N의 변경과 관련된itric 산화 신호, 건강하고 부상당한 폐 14, 16 모두에서 많은 하류 결과와 경로. 또한, 환풍기의 "atelectrauma '특성과 일치 유해한 전단 세력에 폐포를 둘러싼 폐 과목 중 하나 지역의 고정은 폐 부상 19 유도. 이러한 및 기타 아직 - 투 - - 식별 폐 정지 결과는 폐 microvascular (patho) 생리학의 intravital 관찰 혼란 해석 가능성이 높다.
이러한 우려 감안할 때, 우리는 폐 ESL이 자유롭게 이동, 생체 내 마우스 폐에서 공부 할 수있는이 방법을 개발을 모색하고 있습니다. 우리는 타 부치와 Kuebler, 폐 부상 18을 선동하지 않고 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 길이 방향 시각화 할 수 있습니다 접근 방식의 기술을 적용하기로 결정했습니다. 중요한 것은, 우리의 접근 방식은 타 부치의 원래 프로토콜에서 몇 가지 미묘한 변경을 포함, 이러한 알테라저희 연구실 내에서 고유 한 조건을 수용하기 위해 필요에서 진화 tions. 마찬가지로, ESL 측정 우리의 모델을 채택는 다른 곳에서 마우스 혈류 역학의 안정성, 산화, 환기 및 폐 손상의 부재를 보장하기 위해 유사한 최적화가 필요합니다.
우리는 ESL 측정에 대한 우리의 주요 접근로 dextran 제외를 사용하기로 결정했습니다. ESL 측정은 폐와 심장 모션 유물을 negating, 시간에 하나의 순간부터 만들어 질 수로이 기술은 우리의 모델에 적합합니다. 전신 microvasculature의 이전 연구 dextran 제외 작은 혈관 (<15 μm 6) 만 정확 것을 제안하고 있지만, 우리는 직경 30 μm에 선박의 조화 된 ESL 변경을 언급했습니다. 이러한 불일치가 흉막 표면에 특정 광학 특성으로 인해 수 있습니다.
움직이는 혈관 침대에서, 그것은 필수입니다 brightfield 및 형광 이미징 O이미지 획득에있어서 훨씬 간단한 지연 (연속 이미지 사이의 예를 들어 셔터 폐쇄)로 동시에 ccurs은 심각하게 ESL 두께의 측정 혼란 것입니다. 환기를 일시 중지하면이 혼란 감소 할 수 있지만, inspiratory 일시 정지 완전히 heterogeneously - 증가, 부상 폐의 가스 재배포의 심장 모션 아티팩트 또는 호흡기 아티팩트 ( "pendelluft") 20를 방지하지 않습니다. 우리는 동시에 하나의 CCD 카메라에 brightfield 및 형광 이미지를 보낼 수 있도록 이미지 스플리터를 사용하기로 선택하셨습니다. 대체 접근법은 잠재적으로 동시에 공 촛점 현미경 동안 반사 빛과 형광 이미지를 캡처 할 이색 성 거울의 사용을 포함 할 수 있습니다.
우리 모델의 추가로 중요한 수요가 전문 물 침지 목표를 사용하는 것입니다. 이러한 목표는 선박 폭의 작은 차이의 해상도가 여전히 maintainin 동안 수 있도록 충분히 큰 수치 구멍이 있어야합니다g 가슴 창 흉막 표면을 모두 관통하는 적절한 작동 거리. 이러한 목표는 가능한 반면, 매우 비싼입니다. DIC는 혈관 폭 측정의 정밀도를 개선 반영 빛 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경의 사용은 흠없는 조직 가장자리를 강조 brightfield 기술은, 추가로 바람직하다.
대체 기술은 폐 ESL 폭의 결정을 위해 존재합니다. microsphere의 velocimetry 정확하게 움직이는 혈관 침대에 수행 할 수는 없지만, microsphere 부착은 간접적으로 폐 glycocalyx 무결성을 테스트 할 고용 할 수 있습니다. 우리는 이전에 손상 ESL 함수는 내피 표면 부착 분자 2에서 마이크로을 순환 제외 것으로 나타났습니다. 내피 표면에 안티 ICAM-1 microsphere 부착의 존재는 따라서 glycocalyx / ESL 무결성의 손실을 나타냅니다. 이 기술은 동시 brightf을 필요로하지 않습니다ield / 형광 이미징이나 높은 수치 조리개 목표가 필요합니다. 그러나, 한 가지 중요한주의가 존재 : 증가 방지 ICAM-1 microsphere 부착에 대한 glycocalyx 손실을 나타 내기 위해, 제어 및 실험 그룹 간의 유사한 ICAM-1 세포 표면 표현식이 존재해야한다. ICAM-1 내피 표면 표현은 패혈증 유발 폐 손상 2 초 (<45 분) 안정 유지하지만, 표면 표현은 결국 NF-κB 의존 방식으로 21 증가 할 것이다. glycocalyx 무결성의 마커로 microsphere 부착 사용 따라서 만 초기 염증이 기간 동안 유효 할 수 있습니다.
우리의 외과 수술 및 현미경 기술은 폐 부상이를 유도하지 않는 동안 참고,이 실험 폐 손상 (intratracheal 산 기지에 의해 유도 예를 들면 상해) ESL 두께의 측정에 영향을 미치는를 진화하는 방법 불확실합니다. 폐 부종이 발전하는 것은 잠재적으로 선박 폭의 DIC 측정을 먹이고 수및 / 또는 영향을 dextran의 투자율. 이 불확실성은 폐 ESL에서 관찰 된 변경 사항을 확인하기 위해 여러 기술을 보완를 사용 (예 : dextran 제외, microsphere 부착뿐만 아니라 선박 glycosaminoglycan 내용 2의 확실한 histologic 평가)에 의해 완화 될 수 있습니다.
요약하면, 처음 타 부치와 Kuebler에서보고 수술 방법을 확장하여, 우리는 폐 ESL의 세부 관찰을 허용 실험 모델을 개발했습니다. 이 모델의 사용은 건강과 질병에 폐 혈관 생리학에 내피 glycocalyx의 중요성을 더 이해 할 수 있도록해야합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Drs 감사드립니다. Arata 타 부치와 intravital 현미경에 관한 교육을위한 볼프강 Kuebler (토론토 대학). 우리는 현미경 설계 및 구현에 도움을 앤드류 케이힐 (니콘 인스트루먼트)을 감사드립니다. 이 작품은 NIH / NHLBI 보조금 P30 HL101295와 K08 HL105538 (EPS로)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
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