Summary
本文介绍了一种自适应容易容易
Abstract
本文介绍了一种容易容易适应体外模型研究巨噬细胞极化。在存在下GM-CSF/M-CSF，从骨髓中的造血干/祖细胞定向分化成单核细胞，由M1或M2的刺激。激活状态可以跟踪的细胞表面抗原，基因表达和细胞信号转导通路的变化。
Introduction
有别于经典的炎症反应，巨噬细胞浸润组织通常显示的极化激活状态，起着至关重要的作用，在调节宿主组织的生理功能1-8。刺激后，巨噬细胞活化可以分为经典（M1）和替代（M2）激活2，4，9。 M1巨噬细胞活化取决于Toll样受体（TLRs）和激活核因子κB（NFκB）/ C-Jun氨基末端激酶1（JNK1），导致生产的炎性细胞因子，如TNF-α和IL- 1β，诱导型一氧化氮合酶的激活，导致产量增加的活性氧物种，如氮化氧化氮（NO）10，11。与此相反，M2巨噬细胞的招募的活化PPARγ，PPARδ，或IL-4-STAT6通路，导致替代，消炎（M2）的激活与甘露糖受体上调CD206和精氨酸酶1（Arg1的）6，12 - 14 </ SUP>。
目前骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM），的一个理想的体外模型中了解的机制，活化的巨噬细胞极化控制15。具体而言，M1巨噬细胞的激活可以由脂多糖（LPS）的刺激被诱导，而M2巨噬细胞，可诱导的IL-4和/或IL-13的偏振。成熟骨髓来源的巨噬细胞和活化的巨噬细胞，通过流式细胞术分析，可确定表面抗原的表达，包括F4/80的细胞CD11b，CD11c的，CD206，CD69，CD80和CD86的9，16，17。此外，在细胞因子的产生和细胞与巨噬细胞的极化相关的信号转导通路的变化可以测量通过定量RT-PCR和免疫印迹分别。总之，小鼠骨髓来源的巨噬细胞可以作为一个相关的模型来研究在体外巨噬细胞的极化。
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Protocol
1。骨髓细胞的分离
- 隔离6-8周龄小鼠的股骨和胫骨，用清水冲洗干净的头发和然后剖开骨头。
- 使用21G针和10毫升注射器，冲洗出来的骨髓成冷PBS +2％热灭活胎牛血清（FBS）（3-5毫升/鼠标）。
- 通过21G针4-6次通过骨髓细胞分解。
- 通过细胞通过一个70微米的细胞过滤去除细胞团块，骨骼，头发和其他细胞/组织。
- 加入3体积的NH 4 Cl溶液（0.8％NH 4 Cl溶液，干细胞技术），并在冰上孵育10分钟以除去红血细胞。
- 降速细胞在500 XG 5分钟，在4°C。
- 在冷PBS +2％胎牛血清（20-50毫升，根据细胞的数量），重悬细胞沉淀。
2。感应BMDM形成
- 重悬隔离BMDM生长培养基中的骨髓细胞（2×10 6个细胞/米升）。
BMDM生长培养基：
Iscove氏改性的Dulbecco的中等（IMDM）+ 10％FBS + 15％过滤（0.2微米）ł-929细胞（ATCC CCL-1）培养上清液（含有单核细胞集落刺激因子，M-CSF）或10纳克/毫升中号-CSF。
注意：L-929细胞上清液中包含M-CSF 18。 ，以确保有效的活性的条件培养基中，5×10 5 L-929细胞接种在T75厘米2烧瓶中6-7天，收集条件培养基，并通过0.45微米过滤器在使用前。介质的等分试样，可立即使用或储存在-80℃下1-2个月。
- 在6或12孔组织培养板（根据实验设计）（科宁Costar）中的种子细胞。
- 变更新鲜BMDM生长培养基，在第3天。
- 在第7天，形成成熟的BMDM使用流式细胞分析评价荧光标记的抗体检测细胞表达CD11b和F4/80的。
3。 BMDM极化激活
- 在第7天，改变新鲜刺激培养基：M1激活 ，用IMDM培养基含10％FBS和100 ng / ml的LPS或100 ng / ml的LPS与50毫微克/毫升IFNγ;为M2活化 ，使用含有10％FBS的IMDM与10 ng / ml的IL-4和/或10 ng / ml的IL-13。
- 收藏报错受激BMDMs的使用温暖的0.05％胰蛋白酶从盘分离，其次是含有10％FBS的PBS洗涤细胞两次。
注意：要分离，重悬后分化成熟的巨噬细胞，0.05％胰蛋白酶溶液（含有0.48 mM的EDTA，Invitrogen公司）或2-5 mM的EDTA钙和Mg的PBS或Hank氏平衡缓冲液（HBSS）中，都可以使用。当使用含胰蛋白酶消化培养基，细胞在37℃下处理小于10分钟，以避免丢失河畔脸蛋白由于过度消化。
- 使用抗体检测细胞表面抗原的表达，包括CD11b和F4/80的CD11c，CD206，CD69，CD80或CD86在不同时间点，使用标准的流式细胞仪染色程序。
- 确定M1和M2的巨噬细胞活化的特征，包括IL-1β，TNF-α和IL-6（M1激活）或IL-10，IL-13，精氨酸酵素和PPARγ（M2活化）使用定量RT-PCR的基因的表达。确定激活参与细胞信号转导通路激活M1或M2巨噬细胞的免疫印迹分析。
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Representative Results
BMDM生成过程的示意说明，提出了（ 图1）。在第7天的CD11b + F4/80 +细胞占95％〜99％（ 图2）时，可以观察到成熟的巨噬细胞的高纯度。可以检查使用抗CD11b抗体，F4/80偏光巨噬细胞，CD11c和CD206随后通过流式细胞仪分析。 如图3所示，被检测为M1巨噬细胞细胞CD11b + F4/80 + CD11c +细胞CD206-细胞（Q2），而M2巨噬细胞细胞CD11b + F4/80 +的CD11c-CD206 +细胞（Q4）。可以确认的BMDM激活状态通过增加细胞大小（ 图4A，右移FSC-A）和增加大量的表面抗原CD69，CD80，CD86或巨噬细胞（门：细胞CD11b + F4/80 +）， 如图4B所示 。产生细胞因子，基因表达和细胞信号转导通路激活M1或M2巨噬细胞中，可评估使用定量RT-PCR或免疫印迹。一显示在图5中，精氨酸酶1（Arg1）将和PPARγ水平增加M2中的巨噬细胞后，10 ng / ml的IL-4的刺激而增加在100 ng / ml的LPS刺激的巨噬细胞（M1）的IL-1β和TNFα产生，这是伴随着p65的活化（ 图6）。
图1。文中所述的隔离，形成和鼠标BMDMs刺激计划一步一步程序。简单地说，股骨和胫骨的骨骼收集6-8周的小鼠骨髓细胞用PBS中，用2％热灭活的胎牛血清补充冲出。氯化铵溶液裂解红血细胞后，细胞BMDM的生长培养基中培养7天，其次是成熟和纯度分析的细胞群。分析巨噬细胞宝极化，将细胞用LPS或LPS刺激+IFNγ+ M1，或IL-4和/或IL-13的M2激活。偏振光的巨噬细胞的细胞形态的变化，表面标记上介绍，细胞因子的产生和细胞信号转导通路激活的基础上，可以进行评估。
图2。流式细胞仪分析BMDM形成（A）BMDMs的第一门FSC和SSC除去杂物和共轭（B）成熟BMDMs被定义为细胞CD11b + F4/80 +亚（右上）的百分比显示的纯度母体门FSC / SSC。
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图3。组织浸润的巨噬细胞， 巨噬细胞极化分析细胞CD11b + F4/80 +细胞被定义为M1巨噬细胞CD11b + F4/80 +的CD11c + CD206-细胞，，而M2巨噬细胞是细胞CD11b + F4/80 +的CD11c-CD206 +细胞。
图4。激活后巨噬细胞活化流式细胞仪分析（A），巨噬细胞的大小，增加证明了移FSC-M1或M2巨噬细胞刺激相比，M0（未处理）的巨噬细胞在24小时后。（B）激活IL4或LPS刺激后流式细胞仪分析相关的表面标志。初期响应标记CD69进行评价，5或24小时的刺激后，CD80和CD86马克RS刺激后48小时进行了分析， 点击这里查看大图 。
图5。替代激活巨噬细胞，用10 ng / ml的IL-4刺激的巨噬细胞24小时，收集提取总RNA。 M2巨噬细胞，比未经处理的巨噬细胞，采用定量RT-PCR分析检测高架精氨酸酶1（ARG1）和PPARγ表达。
图6。古典激活巨噬细胞（A）提取总RNA，从巨噬细胞中与100纳克/ ML LPS为24小时，并用定量RT-PCR分析。在M1巨噬细胞促炎细胞因子，包括IL-1β和TNF-α的表达增加（B）NFκB通路的激活LPS诱导的确定使用抗体p65的磷酸化p65的蛋白印迹分析。
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Discussion
我们在这里报告一个简单而诱导激活巨噬细胞来源于骨髓祖细胞在体外容易适应的过程。此过程可用于调查负责的巨噬细胞极化机制。成熟的巨噬细胞获得使用该协议平均为95％至99％的纯度，需要没有额外的纯化程序。要调查的特定基因的功能利益在巨噬细胞的极化，异位表达或基因特异性敲除的上下文中，可以进行以下的转染的细胞在第7天。此协议也将提供一个7天的培养窗口中的某些因素或影响形成，成熟和巨噬细胞的表型的基因的影响进行调查。
活化的巨噬细胞显示复杂的细胞和分子公司，具有很大的可塑性，响应各种刺激3，9，19。为例如，LPS诱发有效的亲炎症M1响应，可以进一步增强在IFNγ或肿瘤坏死因子（TNF）和IL-4和IL-13都刺激M2激活的存在下，但是，不完全重叠激活的档案3，4，9，15，19，20。在本协议中的结果仅代表了典型的实验结果与骨髓巨噬细胞通过流式细胞仪，荧光定量RT-PCR和免疫印迹分析。表面抗原呈递和相关的细胞信号转导通路激活巨噬细胞不同注意到大量文献对巨噬细胞极化1-8。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持这项工作是由美国心脏协会（BGIA 7850037周北雁博士）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
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