Summary
記事は容易に簡単に適応を説明
Abstract
記事では、マクロファージ分極を調査するためのin vitroモデルで容易に簡単に適応を説明しています。 GM-CSF/M-CSFの存在下で、骨髄からの造血幹/前駆細胞は、M1またはM2の刺激に続いて、単球分化に向けられる。活性化状態は、細胞表面抗原、遺伝子発現および細胞シグナル伝達経路の変化によって追跡することができる。
Introduction
古典的な炎症反応とは異なる、組織に浸潤したマクロファージは、多くの場合、宿主組織の生理機能を1-8の調節に重要な役割を果たしている偏光活性状態を表示します。刺激により、マクロファージの活性化は、古典的な（M1）および代替（M2）の活性化2,4,9に分類することができる。 M1マクロファージの活性化は、例えばTNF-αとし、炎症性サイトカインの産生をもたらす、Toll様受容体（TLR）および核因子カッパB（NFκB）/ c-Jun N末端キナーゼ1（JNK1）の活性化に依存するIL- 1β、例えば、窒化酸化物（NO）10、11などの反応性酸素種の産生増加をもたらすことのiNOSの活性化。対照的に、M2マクロファージ活性化リクルートPPARγ、PPARδ、またはIL-4-STAT6経路は、代替マンノース受容体CD206のアップレギュレーションと関連付けられ、抗炎症性（M2）活性化、およびアルギナーゼ1（Arg1の）6,12につながる- 14 </>（商標）。
骨髄由来マクロファージ（BMDM）は活性化マクロファージ15の偏光を制御するメカニズムを理解するためのin vitroモデル理想を提示する。 M2マクロファージの偏光IL-4および/またはIL-13によって誘導することができるながら具体的には、M1マクロファージの活性化は、リポ多糖（LPS）刺激によって誘導することができる。成熟した骨髄由来マクロファージおよび活性化マクロファージがCD11bを、F4/80、CD11cは、CD206、CD69、CD80およびCD86 9、16、17を含む表面抗原の発現についてフローサイトメトリー分析によって同定することができる。また、マクロファージ偏光に関連付けられたシグナル伝達経路のサイトカイン産生および細胞の変化は、それぞれ、定量的RT-PCRおよびウエスタンブロットによって測定することができる。要約すると、マウスの骨髄由来マクロファージは、in vitroでマクロファージ分極を研究するため、関連するモデルとしての役割を果たすことができます。
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Protocol
1。骨髄細胞の単離
- 6-8週齢のマウスからの大腿骨と脛骨の骨を分離し、髪を洗い流した後、骨を開いてカット。
- 冷PBS +2％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）（3-5 ML /マウス）に骨髄を洗い流すために21G針とを10mlのシリンジを使用してください。
- 細胞を解離するために21G針を4〜6回を通して骨髄を渡します。
- 細胞塊、骨、毛髪および他の細胞/組織を除去するために70μmのセルストレーナーを通して細胞を渡します。
- NH 4 Cl溶液（0.8％NH 4 Cl溶液、STEMCELL技術）の3つのボリュームを追加し、赤血球を除去するために10分間氷上でインキュベートする。
- 4℃で5分間500 xgで細胞をスピンダウン
- 冷PBS +2％FBS（20〜50ミリリットル、細胞の量に依存する）で細胞ペレットを再懸濁します。
2。誘導BMDM形成
- BMDM成長培地（2×10 6細胞/ mのに孤立した骨髄細胞を再懸濁しL）。
BMDM成長培地：
イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）+ 10％FBS + 15％、濾過（0.2μmの）L-929細胞（ATCC、CCL-1）培養上清（単球コロニー刺激因子、M-CSFを含む）または10 ngの/ mlのM -CSF。
注：L-929細胞上清は、M-CSF 18が含まれています。 5 X 10 5 L-929細胞は6-7日間T75センチ2フラスコに播種され、馴化培地の効果的活動を確保するために、馴化培地は、使用前にフィルター0.45μmの収集と渡されます。培地のアリコートを1〜2ヶ月のためにすぐに使用されるか、または-80°Cに保存することができます。
- 6または12ウェル組織培養プレート（実験デザインに応じて）（コーニングコスター）におけるシード細胞。
- 3日目に新鮮BMDM増殖培地を変更します。
- 7日目に、成熟BMDMの形成は、フローサイトメトリー分析を用いて評価されると蛍光体結合抗体の、CD11b及びF4/80を発現する細胞を検出する。
3。 BMDM偏アクティベ
- 7日目に、新鮮な刺激培地に変更：M1活性化のために、IMDM、50 ngの/ mlのIFNγと10％FBS、100 ngの/ mlのLPSまたは100 ngの/ mlのLPSを含む使用し、M2活性化のために、と10％FBSを含むIMDMを使用10 ngの/ mlのIL-4および/または10 ngの/ mlのIL-13。
- 暖かい0.05％トリプシンを用いて皿からそれらを取り外すことによって刺激さBMDMsを集め、PBS、10％FBSを含有する細胞を2回洗浄した。
注：差別、0.05％トリプシン溶液（0.48 mMのEDTA、Invitrogen社を含む）または2-5 mMのEDTAのCaおよびMgを含まないPBSまたはハンクス平衡緩衝液（HBSS）の後に成熟したマクロファージをデタッチし、再懸濁するために使用することができます。トリプシンを含む消化媒体を使用する場合、細胞はシュルの損失を避けるために10分未満、37°Cで処理する顔はオーバー消化のためにタンパク質。
- 標準的なフローサイトメトリー染色手順を使用して、様々な時点でのCD11b、F4/80、CD11cは、CD206、CD69、CD80またはCD86を含む細胞表面抗原の発現を検出する抗体を使用。
- 定量RT-PCRを用いたIL-1β、TNF-αおよびIL-6（M1の活性化）、またはIL-10、IL-13、arginase1およびPPARγ（M2活性化）を含む活性化M1とM2マクロファージの特徴的な遺伝子の発現を決定する。ウエスタンブロット分析によってM1またはM2マクロファージの活性化に関与する細胞のシグナル伝達経路の活性化を決定します。
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Representative Results
BMDM生成手順の概略的な説明は、（ 図1）提示される。彼らはCD11bを+ F4/80 +細胞の95〜99％（ 図2）を表す場合、成熟マクロファージの高純度は、7日目に観察することができる。偏マクロファージは、フローサイトメトリー分析を行ったCD11b、F4/80、CD11c陽性およびCD206に対する抗体を用いて調べることができる。 図3に示すように、M1マクロファージとして検出されたCD11b + F4/80 +のCD11c + CD206細胞（Q2）、M2マクロファージのCD11b +であるF4/80 +のCD11c-CD206 +細胞（Q4）。 図に示されているように：BMDMアクティベーションステータスが増加し、細胞サイズ（ 図4A、FSCイン右シフト）およびマクロファージの表面抗原CD69、CD80、またはCD86の増加豊富（のCD11b + F4/80 +門）で確認することができる4B。サイトカイン産生、遺伝子発現およびM1またはM2マクロファージ細胞シグナル伝達経路の活性化は、定量的RT-PCRまたはウェスタンブロッティングを用いて評価することができる。 Asは、図5に示すように、アルギナーゼ1（引数1）及びPPARγレベルは、10 ngの/ mlのIL-4刺激によりM2マクロファージに増加した、IL-1βおよびTNFα産生を100 ngの/ mlのLPSで刺激されたマクロファージ（M1）に増加したのに対し、p65の活性化（ 図6）が付属している。
図1。分離、形成、マウスBMDMsの刺激のためのスキーム。ステップ手順バイステップは、テキストで説明されています。要するに、大腿骨と脛骨の骨はPBSを用いて洗い流し6-8週マウスおよび骨髄細胞から収集され、2％熱不活性化FBSを補充した。赤血球を塩化アンモニウム溶液で溶解した後、細胞を細胞集団の純度成熟および分析を行っ7日間BMDM増殖培地で培養する。マクロファージ経口の分析のため larization、細胞を活性化M2 +IFNγM1、又はIL-4および/またはIL-13に対してLPS又はLPSで刺激した。偏マクロファージ細胞形態の変化、表面マーカープレゼンテーション、サイトカイン産生および活性化細胞シグナル伝達経路に基づいて評価することができる。
図2。流れBMDM形成のサイトメトリー分析。（）BMDMsは破片と結合体を除去するためにFSCとSSCの最初のゲーティングされた。（B）熟BMDMsがのパーセンテージとして表示純度のCD11b + F4/80 +亜集団（右上）のように定義されたFSC / SSCにゲート母集団。
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図3。 。マクロファージ偏光解析組織浸潤マクロファージのCD11b + F4/80 +細胞として定義され、M2マクロファージのCD11b + F4/80 +のCD11c - CD206 +細胞であるのに対し、M1マクロファージは、のCD11b + F4/80 +のCD11c + CD206-細胞である。
図4。フローサイトメトリーによるマクロファージ活性化分析。（）活性化されると、マクロファージのサイズは、M0（未処理）マクロファージに比べ刺激後24時間におけるM1またはM2マクロファージのFSC-のシフトによって証明増やします。（B）活性化関連表面マーカーは、IL4又はLPS刺激後のフローサイトメトリーにより分析した。早い応答マーカーCD69 5または24時間刺激後に評価された; CD80およびCD86マルケRSは刺激後48時間で分析した。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5。 24時間10 ngの/ mlのIL-4で刺激代替マクロファージの活性。マクロファージを収集し、全RNAを抽出した。定量的RT-PCR解析を用いて未処理のマクロファージと比較して上昇したアルギナーゼ1（引数1）及びPPARγ発現はM2マクロファージで検出された。
図6。マクロファージの古典的な活性化、（A）全RNAを、100 ngの/ mlのLで刺激されたマクロファージから抽出された定量的RT-PCR分析で24時間、使用のためにPS。 IL-1βおよびTNFαを含む炎症性サイトカインの発現は、M1マクロファージにおいて増加した。P65に対する抗体を用いて決定し、ウェスタンブロット分析でのp65のリン酸化と（B）NFκB経路の活性化は、LPSにより誘導した。
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Discussion
ここでは、骨髄前駆細胞由来のマクロファージの活性化を誘導するためのシンプルかつインビトロで容易に適応手順を報告する。この手順は、マクロファージの偏光を担当するメカニズムの研究のために使用することができる。成熟したマクロファージの純度は、このプロトコルの平均値を95から99までパーセントを用いて得られ、追加の精製法が必要とされない。マクロファージ分極の文脈における利益の特定の遺伝子の機能を調べるために、異所性発現または遺伝子特異的ノックダウンは、7日目に細胞のトランスフェクション後に行うことができる。このプロトコルは、また形成、成熟およびマクロファージの表現型に影響を及ぼす特定の要因や遺伝子の影響を調査するために7日間培養ウィンドウを提供します。
活性化マクロファージは、様々な刺激3、9、19に対応して大きな可塑性を持つ複雑な細胞および分子のプロファイルを表示します。のためにしかしながら、活性化プロファイルが完全に重なっていない、例えば、LPSは、IFNγまたは腫瘍壊死因子（TNF）およびIL-4およびIL-13 M2活性化を刺激し、両方の存在下でさらに向上させることができる強力な炎症誘発M1応答を誘発する3、4、9、15、19、20。このプロトコルで示された結果は、フローサイトメトリー、定量的RT-PCRとウェスタンブロッティングにより解析した骨髄由来マクロファージと実験の典型的な結果を表しています。表面抗原提示およびマクロファージの活性化に伴う細胞のシグナル伝達経路は、マクロファージ偏1-8広範な文献に記載されて変化する。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
この作品は、米国心臓協会（博士Beiyan周にBGIA 7850037）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
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