Summary
이 문서는 쉽게 쉽게 적응을 설명
Abstract
이 문서는 대식 세포 분극을 조사하기 위해 체외 모델에서 쉽게 쉽게 적응을 설명합니다. GM-CSF/M-CSF의 면전에서, 골수에서 조혈 줄기 / 전구 세포 M1 또는 M2 자극 한 다음, 단핵구 분화에 연결됩니다. 활성 상태는 세포 표면 항원 유전자 발현 및 세포 신호 전달 경로의 변화에 의해 추적 할 수 있습니다.
Introduction
고전적인 염증 반응, 조직을 침투 대식 세포의 구별은 종종 호스트 조직 생리 기능 1-8 조절에 중요한 역할을 편광 정품 인증 상태를 표시합니다. 자극에, 대식 세포 활성화는 고전 (M1) 및 대체 (M2) 활성화 2, 4, 9로 정렬 할 수 있습니다. M1 대 식세포의 활성화는 TNF-α와 같은 염증성 사이토 카인의 생산에 이르는 수신자 같은 수용체 (TLR은) 핵 인자 카파 B (NFκB) / C 6 월 N-말단 키나제 1 (JNK1)의 활성화에 따라 IL- iNOS의의 1β 및 활성화하는 등의 질화물 산화물 (NO) 10, 11와 같은 활성 산소 종의 생산 증가의 결과. 반면, M2 대식 세포 활성화 모집 PPARγ, PPARδ, 또는 IL-4-STAT6 경로는 대체 만노오스 수용체 CD206의 상향 조절과 연관되어, 항 염증 (M2) 활성화 및 arginase 1 (이며 Arg1) 6, 12로 이어지는 - 14 </>을 먹다.
골수 유래 대 식세포 (BMDM)는 활성화 된 대 식세포 15 편광을 제어하는 메커니즘을 이해하는 체외 모델의 이상을 제시한다. M2 대식 세포의 편광은 IL-4 및 / 또는 IL-13에 의해 유도 될 수 있지만, 특히 M1 대 식세포의 활성화는 리포 다당류 (LPS) 자극에 의해 유도 될 수있다. 성숙한 골수 유래 대 식세포 활성화 된 대 식세포는 CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 및 CD86 9, 16, 17 등의 표면 항원의 발현 유동 세포 계측법 분석을 통해 식별 할 수 있습니다. 또한, 시토 킨 생산 및 대식 세포 분극과 관련된 세포 신호 전달 경로의 변화는 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 각각 내듯 측정 할 수 있습니다. 요약하면, 마우스 골수 유래 대 식세포는 체외에서 대식 세포 분극을 연구하는 중요한 모델이 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 골수 세포의 분리
- 6-8주 오래된 마우스에서 대퇴골과 경골 뼈를 분리, 머리를 헹구어 낸 후 뼈를 자르면.
- 차가운 PBS 2 %의 열 비활성화 태아 소 혈청 (FBS) (3-5 ML / 마우스)에 골수를 플러시 21G 바늘과 10 ML의 주사기를 사용합니다.
- 세포를 해리 21G 바늘을 통해 4-6 번 골수를 전달합니다.
- 세포 덩어리, 뼈, 머리 및 다른 세포 / 조직을 제거하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다.
- NH 4 염소 용액 (0.8 % NH 4 망할 CIA 솔루션 스템 셀 기술) 3 볼륨을 추가하고, 적혈구를 제거하는 10 분 동안 얼음에 품어.
- 4 ° C.에서 5 분 500 XG에서 세포를 스핀 다운
- 차가운 PBS 2 % FBS (20 ~ 50 ml의 세포의 양에 따라)에있는 세포 펠렛을 resuspend.
2. 유도 BMDM 형성
- BMDM 성장 배지에서 분리 된 골수 세포 (2 × 10 6 세포 / M resuspend을L).
BMDM 성장 매체 :
Iscove의 수정 된 Dulbecco의 중간 (IMDM) + 10 % FBS + 15 % 여과 (0.2 μm의) L-929 세포 (ATCC, CCL-1) 문화 상층 액 (단핵구 콜로니 자극 인자, M-CSF를 포함) 또는 10 NG / ML M -CSF.
참고 : L-929 세포의 상층 액은 M-CSF 18이 포함되어 있습니다. 에어컨 중간, 5의 효과적인 활동을 보장하기 위해 X 10 5 L-929 세포 6-7일에 대한 T75 cm 2 플라스크에 씨앗을 품고 있으며, 에어컨 매체를 사용하기 전에 필터 0.45 μm의를 통해 수집하고 전달됩니다. 중간 분주은 1-2 개월 동안 즉시 사용할 또는 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 6 12 잘 조직 배양 플레이트 (실험 설계에 따라 다름) (코닝 공연자)의 씨앗 세포.
- 3 일 신선한 BMDM 성장 매체를 변경합니다.
- 하루에 7, 성숙 BMDM의 형성은 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 평가됩니다및 형광 결합 항체는 CD11b 및 F4/80을 표현하는 세포를 감지합니다.
3. BMDM 편광 활성화
- 7 일째에 신선한 자극을 매체로 변경 M1 활성화, IMDM 50 NG / ML IFNγ와 10 % FBS, 100 NG / ML LPS 또는 100 NG / ML LPS를 포함한 사용, M2 활성화와 10 % FBS를 포함 IMDM을 사용 10 NG / ML IL-4 및 / 또는 10 NG / ML IL-13.
- 따뜻한 0.05 % 트립신을 사용하여 요리에서 그들을 분리에 의해 자극 BMDMs를 수집 PBS 10 % FBS를 포함한 두 번 세포를 세척 한 다음.
참고 : 차별화 후 성숙 식세포, 0.05 % 트립신 용액 (0.48 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), Invitrogen의를 포함) 또는 칼슘과 마그네슘이없는 PBS 또는 행크의 균형 버퍼 (HBSS)에 2-5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 분리하고 resuspend을 위해 사용할 수 있습니다. 트립신을 포함하는 소화 매체를 사용하는 경우, 셀 쉬르의 손실을 방지하기 위해보다 10 분 동안 37 ° C에서 처리됩니다얼굴에 소화에 의한 단백질.
- CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 또는 표준 유동 세포 계측법 염색 프로 시저를 사용하여 다양한 시간 지점에서 CD86를 포함하여, 세포 표면 항원의 발현을 검출하기 위하여 항체를 사용합니다.
- QRT-PCR을 이용하여 IL-1β, TNF-α와 IL-6 (M1 활성화) 또는 IL-10, IL-13, arginase1 및 PPARγ (M2 활성화) 등의 활성화 M1 및 M2 대식 세포의 특징적인 유전자의 발현을 확인합니다. 웨스턴 블롯 분석에 의한 M1 또는 M2 대식 세포의 활성화에 관련된 세포 신호 전달 경로의 활성화를 결정합니다.
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Representative Results
BMDM 생성 과정의 개략적 인 설명은 (그림 1) 표시됩니다. 그들은 CD11b + F4/80 + 세포의 95-99% (그림 2)를 나타냅니다 때 성숙한 대식 세포의 순도는 7 일에 관찰 할 수 있습니다. 편광 식세포가 CD11b, F4/80에 대한 항체를 사용하여 검사 할 수 있습니다, CD11c와 CD206는 유동 세포 계측법 분석에 의해 따랐다. 그림 3에서와 같이, M1 대 식세포는 다음과 같이 발견 된 CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-세포 (Q2), M2 대식 세포는 CD11b 반면 + F4/80 + CD11c-CD206 + 세포 (Q4). BMDM 활성화 상태가 증가 세포의 크기 (그림 4A, FSC-A에서 오른쪽으로 이동) 및 표면 항원의 증가 풍부한 CD69, CD80, 또는 대식 세포에서 CD86에 의해 확인 될 수있다 (문 : CD11b + F4/80 +) 그림에서와 같이 4B. 시토 킨 생산, 유전자 발현 및 M1 또는 M2 대식 세포의 세포 신호 전달 경로의 활성화는 정량적 RT-PCR이나 웨스턴 블로 팅을 사용하여 평가할 수 있습니다.의 그림 5와 같이 arginase 1 (이며 Arg1)와 PPARγ 수준은 10 NG / ML IL-4 자극에 M2 대식 세포에서 증가 하였다, IL-1β와 TNFα 생산이 100 NG / ML LPS로 자극 식세포 (M1) 증가 하였다 반면 , 어떤은 P65 활성화 (그림 6)에 의해 동반됩니다.
그림 1. 격리, 형성 및 마우스 BMDMs의 자극에 대한 계획. 단계 절차에 의해 단계는 텍스트에 설명되어 있습니다. 간단한, 대퇴골 및 경골 뼈 PBS가 2 % 열 불 활성화 FBS와 보충하여 플러시 6~8주 마우스 골수 세포에서 수집됩니다. 적혈구는 NH4Cl 용액으로 용해 된 후, 세포는 세포 인구의 순도 성숙과 분석에 의해 다음 칠일에 대한 BMDM 성장 배지에서 배양된다. 대식 포의 분석 larization, 세포 M2 활성화를 위해 + IFNγ M1, 또는 IL-4 및 / 또는 IL-13 LPS 또는 LPS로 자극 하였다. 극화 된 대 식세포는 세포 형태의 변화, 표면 마커 프레 젠 테이션, 시토 킨 생산 및 활성화 세포 신호 전달 경로의 기준으로 평가할 수 있습니다.
그림 2. BMDM 형성 유동 세포 계측법 분석. (A) BMDMs 파편과 복합체를 제거하는 FSC와 SSC에 처음 문이었다. (B) 성숙한 BMDMs는 다음과 같이 정의 된 CD11b의 백분율로 표시되는 순도 + F4/80 + 모집단 (오른쪽) FSC / SSC에 문이 부모의 인구.
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그림 3. . 대식 세포 편광 분석 조직 침투 대식 세포는 CD11b + F4/80 + 세포로 정의되며, M1 대 식세포는 CD11b 있습니다 + F4/80 + CD11c + CD206-세포, M2 대식 세포는 CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + 세포 수 있습니다 반면.
그림 4. 유동 세포 계측법에 의한 대 식세포의 활성 분석. (A) 활성화되면, 대식 세포의 크기는 M0 (치료) 대 식세포에 비해 자극 후 24 시간에서 M1 또는 M2 대식 세포의 FSC-A의 변화에 의해 입증 증가한다. (B) 활성화 관련 표면 마커는 IL4이나 LPS 자극 후 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 초기 응답 마커 CD69는 5 또는 24 시간 후 자극에서 평가되었다 CD80 및 CD86 마르크RS는 자극 후 48 시간에서 분석 하였다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 대식 세포의 대안 활성화. 24 시간 동안 10 NG / ML IL-4로 자극 식세포를 수집하고 총 RNA가 추출되었다. 정량적 RT-PCR 분석을 사용하여 치료 대식 세포에 비해 높은 arginase 1 (이며 Arg1)와 PPARγ 발현 M2 대식 세포에서 발견되었다.
그림 6. 대 식세포의 고전 활성화. (A) 총 RNA 100 NG / ML L로 자극 대식 세포에서 추출 된24 시간 정량적 RT-PCR 분석에 사용을위한 PS. IL-1β와 TNFα 등의 염증성 사이토 카인의 발현은 M1 대식 세포에서 증가했다. P65에 대한 항체를 사용하여 결정하고 서양 블롯 분석에서 P65을 인산화로 (B) NFκB 경로의 활성화는 LPS에 의해 유도되었다.
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Discussion
우리는 여기에서 골수 전구 세포에서 유래 대 식세포의 활성화를 유도 할 수있는 간단하고 체외에서 쉽게 적응할 수있는 절차를보고합니다. 이 절차는 대식 세포의 편광에 대한 책임 메커니즘의 연구에 사용할 수 있습니다. 성숙한 대식 세포의 순도는이 프로토콜의 평균에게 95-99%을 사용하여 얻은하고 추가 정제 과정이 필요하지 않습니다. 대식 세포 분극, 자궁외 식 또는 유전자의 특정 최저의 맥락에서 이해 특정 유전자의 기능을 조사하려면 하루 7 세포의 다음과 같은 형질을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 형성, 성숙과 대식 세포의 표현형에 영향을 미치는 특정 요인이나 유전자의 영향을 조사하기 위해 7 일 문화의 창을 제공합니다.
활성화 된 대 식세포는 다양한 자극 3, 9, 19에 대한 응답으로 좋은 가소성을 가진 복잡한 세포 및 분자 프로파일을 표시합니다. 용그러나, 활성 프로파일이 완전히 중복되지 않는 예, LPS는 IFNγ 또는 종양 괴사 인자 (TNF)와 IL-4와 IL-13 M2 활성화를 자극 모두의 존재 더욱 강화 될 수있다 강력한 프로 염증성 M1 반응을 이끌어 3, 4, 9, 15, 19, 20. 이 프로토콜에 제시된 결과는 유동 세포 계측법, 정량적 RT-PCR과 웨스턴 블롯으로 분석 골수 유래 대 식세포와 실험의 일반적인 결과를 나타냅니다. 대 식세포의 활성화와 관련된 표면 항원 프레 젠 테이션 및 세포 신호 경로는 같은 대식 세포 분극 1-8 광범위한 문헌에 언급 달라집니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 (박사 Beiyan 저우에 BGIA 7,850,037)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
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