Summary
Artikkelen beskriver et lett enkelt adaptiv
Abstract
Artikkelen beskriver et lett enkelt adaptiv in vitro modell for å undersøke makrofag polarisering. I nærvær av GM-CSF/M-CSF, blir hematopoetiske stamceller / stamceller fra benmargen rettet inn i monocyttisk differensiering, etterfulgt av M1 eller M2 stimulering. Aktiveringsstatusen kan spores av endringer i celleoverflateantigener, genekspresjon og celle signalveier.
Introduction
Forskjellig fra klassiske inflammatoriske responser, makrofager som infiltrerer vev ofte vise polarisert aktivering status som spiller en avgjørende rolle i å regulere vert vev fysiologiske funksjoner 1-8. Ved stimulering, makrofag aktivering kan bli sortert i klassiske (M1) og alternativt (M2) aktivering 2, 4, 9. M1 makrofag aktivering avhenger av Toll-lignende reseptorer (TLR) og aktivering av kjernefysiske faktor kappa B (NFκB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), som fører til produksjon av inflammatoriske cytokiner, for eksempel TNF-α og IL- 1β og aktivering av iNOS som resulterer i økt produksjon av reaktive oksygenforbindelser slik som nitride oksyd (NO), 10, 11.. I kontrast, M2 makrofag aktivering rekrutter PPARγ, PPARδ, eller IL-4-STAT6 pathways, som fører til alternative, anti-inflammatoriske (M2) aktivering som er forbundet med oppregulering av mannose-reseptoren CD206, og arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.
Benmarg avledet makrofager (BMDM) presenterer en ideell in vitro modell for å forstå mekanismene som styrer polarisering av aktiverte makrofager 15. Nærmere bestemt, kan aktivering av makrofager M1 bli indusert av lipopolysaccharides (LPS) stimulering, mens polarisering av M2 makrofager kan induseres ved IL-4 og / eller IL-13. Modne benmarg avledet makrofager og aktiverte makrofager kan identifiseres gjennom flowcytometri analyse for uttrykk for overflateantigenene, inkludert CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 og 9 CD86, 16, 17. I tillegg kan forandringer i celle-cytokinproduksjon og signalveier assosiert med makrofag polarisering bli målt ved kvantitativ RT-PCR og western blotting, henholdsvis. Oppsummert kan mus benmarg avledet makrofager fungere som en relevant modell for å studere macrophage polarisering in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Isolering av benmargceller
- Isoler femur og tibia bein 6-8 uker gamle mus, skyll av hår og deretter kuttet åpne beinet.
- Bruk en 21G nål og 10 ml sprøyte til å skylle ut margen i kaldt PBS 2% varmeinaktivert Fetal Bovine Serum (FBS) (3-5 ml / mus).
- Pass marg gjennom en 21G nål 4-6 ganger for å distansere cellene.
- Passere cellene gjennom en 70 mikrometer celle sil for å fjerne celle klumper, bein, hår og andre celler / vev.
- Tilsett 3 volum av NH4Cl-løsning (0,8% NH4Cl-løsning, Stemcell Technology) og inkuber på is i 10 min for å fjerne røde blodlegemer.
- Spinn ned cellene ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender cellepelleten i kald PBS + 2% FBS (20-50 ml, avhengig av antallet av celler).
2. Induksjon BMDM Formation
- Resuspender de isolerte celler fra beinmargen i BMDM vekst medium (2x10 6 celler / ml).
BMDM vekstmedium:
Iscoves Modified Dulbeccos Medium (IMDM) + 10% FBS + 15% filtrert (0,2 mikrometer) L-929 celler (ATCC, CCL-1) kultur supernatanten (som inneholder monocyte-koloni stimulerende faktor, M-CSF) eller 10 ng / ml M -CSF.
Merk: L-929 celle supernatanten inneholder M-CSF 18. For å sikre en effektiv aktivitet av kondisjonerte medium, 5 X 10 5 L-929 celler utsådd i T75 kolber 2 cm i 6-7 dager, er kondisjonerte medium oppsamlet og sendt gjennom et 0,45 mikrometer filter før bruk. Medium alikvoter kan brukes umiddelbart eller lagres i -80 ° C i 1-2 måneder.
- Seed celler i 6 eller 12 brønns vevskulturplater (avhengig av eksperimentell design) (Corning Costar).
- Endre frisk BMDM vekst medium på dag tre.
- På dag 7, er dannelsen av modne BMDM evaluert ved hjelp av flowcytometri analyseog fluorophore konjugerte antistoffer til å påvise celler uttrykker CD11b og F4/80.
3. BMDM polarisert Activation
- På dag 7 skifte til friskt medium stimulering: M1 for aktivering, bruk IMDM inneholdende 10% FBS og 100 ng / ml LPS eller 100 ng / ml LPS med 50 ng / ml IFNγ; for M2 aktivering, bruk IMDM inneholdende 10% FBS med 10 ng / ml IL-4 og / eller 10 ng / ml IL-13.
- Samle stimulert BMDMs ved å løsne dem fra fatet ved hjelp av varm 0,05% trypsin, etterfulgt av vasking av cellene to ganger med PBS inneholdende 10% FBS.
Merk: For å demontere og resuspender modne makrofager etter differensiering, 0,05% Trypsin løsning (som inneholder 0,48 mM EDTA, Invitrogen) eller 2-5 mM EDTA i Ca-og Mg-free PBS eller Hank balanserte buffer (HBSS) kan brukes. Ved bruk av fordøyelsessystemet medium inneholdende trypsin, er celler behandlet ved 37 ° C i mindre enn 10 min for å unngå tap av suransikt proteiner på grunn av over-fordøyelsen.
- Bruk antistoffer å oppdage uttrykk for celleoverflateantigener, inkludert CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 eller CD86 på ulike tidspunkter med standard flowcytometri flekker prosedyrer.
- Bestem ekspresjon av gener som er karakteristiske for aktiverte M1 og M2 fra makrofager, inkludert IL-1β, TNF-α og IL-6 (M1-aktivering) eller IL-10, IL-13, arginase1 og PPARγ (M2 aktivering) under anvendelse QRT-PCR. Bestem aktivering av celle signalveier involvert i aktivering av M1 eller M2 makrofager av western blotting analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk beskrivelse av BMDM generasjon prosedyren er presentert (figur 1). Høy renhet av modne makrofager kan observeres på dag 7 når de representerer 95-99% av CD11b + F4/80 +-celler (Figur 2). Polariserte makrofager kan undersøkes ved hjelp av antistoffer mot CD11b, F4/80, etterfulgt CD11c og CD206 ved flowcytometri analyse. Som vist i figur 3, er M1 makrofager oppdaget som CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-celler (Q2), mens M2 makrofager er CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + celler (Q4). Den BMDM aktivering status kan bekreftes ved økt cellulær størrelse (Figur 4A, høyre shift i FSC-A) og økt overflod av overflateantigenene CD69, CD80, eller CD86 på makrofager (Gate: CD11b + F4/80 +) som vist i Figur 4B. Cytokin produksjon, genekspresjon og celle signalveien aktivering i M1 eller M2 makrofager kan evalueres ved hjelp av kvantitativ RT-PCR eller western blotting. Ens vist i figur 5, ble en arginase (Arg1) og PPARγ nivåene økte i M2 makrofager ved 10 ng / ml IL-4 stimulering, mens IL-1β og TNFa produksjon ble øket i makrofager (M1) stimulert med 100 ng / ml LPS , som er ledsaget av P65 aktivering (figur 6).
Figur 1. Ordningen for isolering, dannelse og stimulering av mus BMDMs. Steg for steg prosedyrer er beskrevet i teksten. I korte trekk, femur og tibia bein samles 6-8 uker mus og benmarg celler spyles ut ved hjelp av PBS supplert med 2% varmeinaktivert FBS. Etter røde blodceller lyseres med NH4CI-løsning blir celler dyrket in BMDM vekstmedium for 7 dager etterfulgt av modning og analyse for renheten av cellepopulasjonen. For analyse av makrofag po larisering, cellene ble stimulert med LPS eller LPS + IFNγ for M1, eller IL-4 og / eller IL-13 for M2-aktivering. Polariserte makrofager kan evalueres på grunnlag av endringer i celle morfologi, overflate markør presentasjon, cytokin produksjon og celle signalveien aktivert.
Figur 2. Flowcytometri analyse av BMDM formasjon. (A) BMDMs var første gated på FSC og SSC å fjerne rusk og konjugater. (B) Moden BMDMs ble definert som CD11b + F4/80 + subpopulasjoner (øverst til høyre) med renheten vises som andel av forelder befolkningen gated på FSC / SSC.
s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
Figur 3. . Macrophage polarisering analyse Tissue infiltrert makrofager er definert som CD11b + F4/80 + celler, M1 makrofager er CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-celler, mens M2 makrofager er CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + celler.
Figur 4. Macrophage aktivering analyse av flowcytometri. (A) Ved aktivering, størrelsen på makrofager øke noe som gjenspeiles av forskyvning av FSC-A av M1 eller M2 makrofager i 24 timer etter stimulering i forhold til M0 (ubehandlet) makrofager. (B) Aktiveringen -relaterte overflate markører ble analysert ved flowcytometri etter IL4 eller LPS stimulering. De tidlige reagerer markør CD69 ble evaluert på 5 eller 24 timers post-stimulering, CD80 og CD86 markers ble analysert på 48 timer etter stimulering. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Alternativt aktivering av makrofager. Makrofager stimulert med 10 ng / ml IL-4 i 24 timer ble samlet og total RNA ekstrahert. Forhøyet arginase 1 (Arg1) og PPARγ uttrykket ble oppdaget i M2 makrofager i forhold til ubehandlede makrofager ved hjelp kvantitativ RT-PCR analyse.
Figur 6. Klassiske aktivering av makrofager. (A) Totalt RNA ble ekstrahert fra makrofager stimulert med 100 ng / ml LPS i 24 timer og brukt i kvantitative RT-PCR-analyser. Uttrykk av proinflammatoriske cytokiner, inkludert IL-1β og TNF-alfa økte i M1 makrofager. (B) Aktivering av NFκB veien ble indusert av LPS som bestemmes ved hjelp av antistoffer mot p65 og fosforylert p65 i vestlige blotting analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer her en enkel og lett tilpasses in vitro prosedyre for å indusere aktivering av makrofager som stammer fra benmargsstamceller. Denne prosedyre kan benyttes for undersøkelse av mekanismene som er ansvarlige for polarisering av makrofager. Renheten av modne makrofager innhentet ved hjelp av denne protokollen gjennomsnitt 95-99%, og ingen ekstra rensing må utføres. For å undersøke funksjonen av spesifikke gener av interesse i sammenheng med makrofag polarisering, ektopisk ekspresjon eller genet spesifikk knockdown kan gjennomføres følgende transfeksjon av cellene på dag 7. Denne protokollen vil også gi en 7-dagers kultur vinduet for å undersøke virkningene av visse faktorer eller gener som påvirker dannelse, modning og fenotype av makrofager.
Aktiverte makrofager viser kompliserte cellulære og molekylære profiler med stor plastisitet i respons på forskjellige stimuli 3, 9, 19. Foreksempel utløser LPS potente proinflammatoriske M1 responser som kan være ytterligere forbedret i nærvær av IFNγ eller tumor-nekrose faktor (TNF) og IL-4 og IL-13 både stimulere M2 aktivering, men trenger aktivisering profiler ikke helt overlapper 3, 4, 9, 15, 19, 20. Resultatene presenteres i denne protokollen bare representerer typiske utfall av eksperimenter med benmarg avledet makrofager analysert ved flowcytometri, kvantitativ RT-PCR og western blotting. Surface antigen presentasjon og celle signalveier forbundet med aktivering av makrofager varierer som nevnt i den omfattende litteraturen om macrophage polarisering 1-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (BGIA 7.850.037 til Dr. Beiyan Zhou).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
