Summary
В статье описана легко легко адаптивная
Abstract
В статье описана легко легко адаптивная в пробирке модель для исследования макрофагов поляризации. В присутствии GM-CSF/M-CSF, гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники из костного мозга направлены на дифференциацию моноцитов, а затем М1 или М2 стимуляции. Состояние активации можно отслеживать изменения в антигены на поверхности клеток, экспрессию генов и путей клеточной сигнализации.
Introduction
Отличной от классической воспалительной реакции, макрофаги, которые пропитывают ткани часто демонстрируют поляризованного состояния активации, который играет важную роль в регуляции тканей хозяина физиологические функции 1-8. При стимуляции, активации макрофагов можно разделить на классические (M1) и альтернативные (М2) активация 2, 4, 9. M1 активации макрофагов зависит от Toll-подобных рецепторов (TLR,) и активацию ядерного фактора каппа В (NFκB) / с-Jun N-концевой киназы 1 (JNK1), что приводит к продукции воспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL- 1β и активации иСОА, что приводит к увеличению образования активных форм кислорода, таких как нитрид азота (NO) 10, 11. В противоположность этому, M2 активации макрофагов новобранцев PPAR-, PPAR, или IL-4 STAT6 путей, что приводит к альтернативе, противовоспалительные (М2) активации, которая связана с активацией рецептора маннозы CD206 и аргиназа 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Вир>.
Костного мозга макрофагов (BMDM) представляют идеал в пробирке модель, чтобы понять механизмы, контролирующие поляризации активированными макрофагами 15. В частности, активация М1 макрофагов может быть индуцирована липополисахаридов (ЛПС) стимуляции, тогда поляризации M2 макрофагов может быть индуцирована IL-4 и / или IL-13. Зрелые костного мозга макрофаги и активированные макрофаги могут быть идентифицированы посредством анализа потока цитометрии экспрессии поверхностных антигенов, в том числе CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 и CD86, 9, 16, 17. Кроме того, изменения в продукции цитокинов и клеточных сигнальных путей, связанных с макрофагами поляризации можно измерить с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, соответственно. Таким образом, мыши костного мозга макрофаги могут служить соответствующие модели для изучения макрофаг поляризации в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение клеток костного мозга
- Изолировать бедра и голени кости от 6-8 недельных мышей, ополоснуть волосы, а затем разрезать кости.
- Используйте 21G иглу и шприц объемом 10 мл, чтобы избавиться от мозга в холодной PBS +2% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (3-5 мл / мышь).
- Передайте мозга через 21G иглу 4-6 раз для диссоциации клеток.
- Проход клеток через 70 мкм сито ячейка для удаления скопления клеток, костей, волос и других клеток / ткани.
- Добавить 3 объема раствора NH4Cl (0,8% раствора NH4Cl, Stemcell технологии), и инкубировать на льду в течение 10 мин для удаления красных кровяных телец.
- Спином вниз клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
- Ресуспендируют осадок клеток в холодном PBS + 2% FBS (20-50 мл, в зависимости от количества клеток).
2. Формирование Индукционная BMDM
- Ресуспендируют изолированных клеток костного мозга в питательной среде BMDM (2х10 6 клеток / мл).
BMDM питательной среде:
Исков, модифицированной по способу Дульбекко среды (IMDM) + 10% FBS + 15% фильтровали (фильтр 0,2 мкм) L-929 клетки (АТСС, CCL-1) культурального супернатанта (содержащего моноцитов колониестимулирующий фактор, M-CSF) или 10 нг / мл M -CSF.
Примечание: L-929 клетки супернатант содержит M-CSF 18. Для обеспечения эффективной активности кондиционированной среды, 5 × 10 5 L-929 клетки высевают в T75 см2 колбах в течение 6-7 дней, кондиционированную среду собирали и пропускали через 0,45 мкм фильтр перед использованием. Средний аликвоты можно использовать сразу или хранить в -80 ° С в течение 1-2 месяцев.
- Семенной клеток в 6 или 12-луночных планшетах для культуры тканей (в зависимости от плана эксперимента) (Corning Costar).
- Изменение свежую среду роста BMDM на 3 день.
- На 7 день, образование зрелых BMDM оценивается с помощью анализа проточной цитометриии флуорофором конъюгированных антител для обнаружения клеток, экспрессирующих CD11b и F4/80.
3. BMDM поляризованные Активация
- На 7 день менять на свежую среду стимуляции: для активации M1, использовать IMDM, содержащей 10% FBS и 100 нг / мл ЛПС, или 100 нг / мл ЛПС с 50 нг / мл IFN-; для M2 активации использовать IMDM, содержащей 10% FBS с 10 нг / мл IL-4 и / или 10 нг / мл IL-13.
- Сбор стимулировали BMDMs путем отделения их от тарелки теплой 0,05% трипсин, с последующей промывкой клетки дважды ЗФР, содержащим 10% FBS.
Примечание: Для отсоединения и ресуспендируют зрелых макрофагов после дифференцировки, 0,05% трипсина раствора (содержащего 0,48 мМ ЭДТА, Invitrogen) или 2-5 мМ ЭДТА в Са и Mg, свободный PBS или сбалансированный буфера Хенкса (HBSS), могут быть использованы. При использовании пищеварительной среды, содержащей трипсин, клетки обрабатывают при 37 ° С в течение менее 10 мин, чтобы избежать потери SurЛицо белки из-за чрезмерной пищеварения.
- Использование антител к детекции экспрессии антигенов клеточной поверхности, включая CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 или CD86 в различные моменты времени с использованием стандартных методов проточной цитометрии окрашивания.
- Определить экспрессию генов, характерных активированного M1 и M2 макрофагов в том числе IL-1β, TNF-α и IL-6 (M1 активации) или IL-10, IL-13, arginase1 и PPAR-(M2 активации) с использованием QRT-PCR. Определите активацию сигнальных путей клетки участвуют в активации М1 или М2 макрофаги помощи вестерн-блоттинга анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематическое описание BMDM процедура генерации представлен (Рис. 1). Высокая чистота зрелых макрофагов можно наблюдать на 7-й день, когда они представляют от 95 до 99% + F4/80 CD11b + клеток (рис. 2). Поляризованные макрофаги могут анализироваться с помощью антител против CD11b, F4/80, CD11c и CD206 последующим анализом потока цитометрии. Как показано на рисунке 3, M1 макрофагов определяются как CD11b + F4/80 CD11c + CD206 +-клеток (Q2), а M2 макрофаги CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + клеток (Q4). BMDM статус активации может быть подтверждено повышение сотовой размер (фиг.4А сдвиг вправо на FSC-A) и повышенной обилие поверхностных антигенов CD69, CD80 или CD86 на макрофагах (Выход: CD11b + F4/80 +), как показано на рисунке 4В. Продукцию цитокинов, экспрессии генов и клеточных сигнальных путей активации в М1 или М2 макрофаги могут быть оценены с использованием количественной ОТ-ПЦР или вестерн-блоттинга.сек показано на рисунке 5, аргиназа 1 (Arg1) и PPAR, уровни были увеличены в М2 макрофагов на 10 нг / мл IL-4 стимуляции, тогда как IL-1β и TNF-производства были увеличены в макрофагах (M1) стимулировали 100 нг / мл ЛПС , который сопровождается активацией р65 (рис. 6).
Рисунок 1. Схема для изоляции, формирование и стимулирование мышь BMDMs. Шаг за шагом процедуры описаны в тексте. Короче говоря, бедра и голени кости собирают из 6-8 недель мышей и клеток костного мозга промыть использованием PBS с добавлением 2% инактивированную нагреванием FBS. После красные кровяные клетки лизируют раствором NH4Cl, клетки культивируют в питательной среде BMDM в течение 7 дней с последующим созреванием и анализ на чистоту клеточной популяции. Для анализа макрофаг ро поляризации, клетки стимулировали LPS или ЛПС + IFN, для M1, или IL-4 и / или IL-13 для M2 активации. Поляризованные макрофаги могут быть оценены на основе изменений в морфологии клеток, представление поверхностный маркер, продукции цитокинов и клеточного сигнального пути активированы.
Рисунок 2. Проточной цитометрии анализа BMDM формирования. (A) BMDMs были первыми на закрытом FSC и SSC для удаления мусора и конъюгатов. (B) Пожилые BMDMs были определены как CD11b + + F4/80 субпопуляции (вверху справа) с чистотой показывается в процентах от родительской популяции закрытого на FSC / SSC.
s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3. . Макрофага поляризационный анализ тканей пропитанных макрофаги определяются как CD11b + F4/80 + клеток; M1 макрофаги CD11b + + F4/80 CD11c + CD206-клетки, в то время как М2 макрофаги CD11b + CD11c F4/80 + CD206 +-клеток.
Рисунок 4. Макрофаги активационного анализа методом проточной цитометрии. (A) При активации, размер макрофагов увеличить, о чем свидетельствует смещение FSC-М1 или М2 макрофаги через 24 часа после стимуляции по сравнению с M0 (необработанный) макрофагами. (В) активации связанных поверхностных маркеров были проанализированы с помощью проточной цитометрии после стимуляции IL-4 или ЛПС. Ранние отвечает маркером CD69 оценивалась в 5 или 24 ч после стимуляции; CD80 и CD86 МаркеRS анализировали через 48 часов после стимуляции. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. Альтернативные активации макрофагов. Макрофаги стимулировали 10 нг / мл IL-4 в течение 24 ч, собирают и общей РНК, экстрагированной. Повышенные аргиназа 1 (Arg1) и PPAR-выражение было обнаружено в М2 макрофагов по сравнению с необработанными макрофагами с использованием количественной ОТ-ПЦР анализа.
Рисунок 6. Классическая активации макрофагов. (А) Общую РНК экстрагировали из макрофагов стимулировали 100 нг / мл LPS в течение 24 ч и использованы в количественной ОТ-ПЦР. Выражение провоспалительных цитокинов, включая IL-1β и TNF-увеличилось М1 в макрофагах. (B) активация пути NFκB индуцировали ЛПС, как определено с использованием антител к p65 и p65 фосфорилированный в вестерн-блоттинг анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы сообщаем здесь простые и легко адаптируются в пробирке процедуры, чтобы вызвать активацию макрофагов, полученных из клеток костного мозга предшественников. Эта процедура может быть использована для исследования механизмов, ответственных за поляризации макрофагов. Чистота зрелых макрофагов, полученные с использованием этого протокола среднем от 95 до 99%, и никаких дополнительных процедур очистки не требуется. Для исследования функции специфических генов интересов в контексте макрофаг поляризации, эктопической экспрессии конкретного гена или нокдауна может быть проведена после трансфекции клеток на 7 день. Этот протокол также обеспечит 7-дневная культура окно исследовать воздействие определенных факторов или генов, которые влияют на формирование, созревание и фенотипа макрофагов.
Активированные макрофаги отображения сложных клеточных и молекулярных профилей с большой пластичностью в ответ на различные стимулы 3, 9, 19. ДляНапример, ЛПС вызывает мощный провоспалительных M1 ответов, которые могут быть дополнительно повышена в присутствии IFN-или фактора некроза опухоли (ФНО) и IL-4 и IL-13, как стимулировать M2 активации, однако, активация профили не полностью перекрываются 3, 4, 9, 15, 19, 20. Результаты, представленные в этом протоколе только представляют собой типичные результаты экспериментов с костного мозга макрофагов анализировали с помощью проточной цитометрии, ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга. Поверхность презентации антигена и путей передачи клеточных сигналов, связанных с активацией макрофагов зависят как отмечалось в обширной литературе по макрофагов поляризации 1-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при поддержке Американской Ассоциации Сердца (BGIA 7850037 доктору Beiyan Чжоу).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
