Summary
Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir açıklar
Abstract
Makalede, makrofaj polarizasyon araştırmak için in vitro model, kolayca kolayca uyarlanabilir açıklanmaktadır. GM-CSF/M-CSF varlığında, kemik iliği hematopoetik kök / progenitör hücrelerin M1 veya M2 uyarımı ile devam eden, monositik farklılaşma içine yönlendirilir. Etkinleştirme durumunu hücre yüzey antijenleri, gen ve hücre sinyal yolları değişiklikleri ile takip edilebilir.
Introduction
Klasik inflamatuar yanıtları, dokuların sızmak makrofajlar farklı genellikle konak doku fizyolojik fonksiyonları 1-8 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar polarize etkinleştirme durumunu görüntüler. Stimülasyon üzerine, makrofaj aktivasyonu klasik (M1) ve alternatif (M2) aktivasyon 2, 4, 9 içine sıralanabilir. M1, makrofaj aktivasyonu, TNF-α ve benzeri gibi enflamatuar sitokinlerin üretimine yol açan bir Toll benzeri reseptör (TLR), ve nükleer faktör kappa B (NFKB) / c-Jun N-terminal kinaz 1 (JNK1) aktivasyonu, bağlıdır, IL- iNOS 1β ve aktivasyon böyle nitrit oksit (NO), 10, 11 gibi reaktif oksijen türlerinin artan üretimi ile sonuçlanır. Bunun aksine, M2 makrofaj aktivasyonu işe PPARy, PPARd, veya IL-4-STAT6 yolları, alternatif manoz reseptörü CD206 upregülasyonunu ile ilişkili, bir anti-enflamatuar (M2) aktivasyonu ve arginaz 1 (Arg1) 6, 12, önde gelen - 14 </> Sup.
Kemik iliği kökenli makrofajlar (BMDM) aktive makrofajlar 15 kutuplaşma kontrol mekanizmaları anlamak için in vitro model ideal mevcut. M2 makrofaj polarizasyon, IL-4 ve / veya IL-13 ile indüklenen edilebilir ise Özellikle, M1, makrofajların aktivasyonu, lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılması sonucu meydana edilebilir. Olgun kemik iliği kökenli makrofajlar ve aktive makrofajlar CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ve CD86 9, 16, 17 de dahil olmak üzere yüzey antijenleri, ifadesi için flow sitometri analizi ile tespit edilebilir. Buna ek olarak, sitokin üretimi ve makrofaj kutuplaşma ile bağlantılı hücre sinyalizasyon yolları değişiklikler kantitatif RT-PCR ve Batı sırasıyla blot ile ölçülebilir. Özetle, fare kemik iliği kökenli makrofajlar in vitro makrofaj kutuplaşma incelemek için ilgili model olarak hizmet edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kemik İliği Hücreleri İzolasyon
- 6-8 haftalık farelerin femur ve tibia kemikleri izole, saç durulayın ve sonra kemik açık kesti.
- Soğuk PBS +% 2 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) (3-5 ml / fare) içine iliği dışarı atılması için bir 21G iğne ve 10 ml şırınga kullanın.
- Hücreleri ayırmak için bir 21G iğne ile 4-6 kez iliği Min.
- Hücre kümeleri, kemik, saç ve diğer hücre / doku kaldırmak için 70 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçmektedir.
- NH4CI çözeltisi (% 0.8 NH4CI çözeltisi, Kök Hücre Teknolojisi) 3 hacim eklemek ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri aşağı Spin
- Soğuk PBS +% 2 FBS (20-50 ml, hücre miktarına bağlı olarak) içinde hücre pelletini.
2. Indüksiyon BMDM Oluşumu
- BMDM büyüme ortamı içinde izole edilmiş kemik iliği hücreleri (2x10 6 hücre / a süspansel).
BMDM büyüme ortamı:
Iscove Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM) +% 10 FBS +% 15 süzüldü (0.2 um), L-929 hücresi (ATCC CCL-1) kültür yüzey (monosit-koloni uyarıcı faktör, M-CSF ihtiva eden) veya 10 ng / ml 'M -CSF verildi.
Not: L-929 hücre yüzer M-CSF 18 içerir. Koşullandırılmış ortam, 5 etkin aktivitesi sağlamak için 5 x 10 L-929 hücreleri 6-7 gün boyunca T75 cm2 şişelerde tohumlanmıştır, kıvamlandırılmış ortam maddesi kullanımdan önce filtre bir 0.45 mikron ile toplanmış ve geçirilir. Orta alikotları 1-2 ay için hemen kullanılabilir ya da -80 ° C'de saklanabilir.
- 6 veya 12 oyuklu doku kültürü plakaları (deney tasarımına bağlı olarak) (Corning Costar) tohum hücreleri.
- 3. günde taze BMDM büyüme ortamı değiştirin.
- 7. günde, olgun BMDM oluşumu akış sitometri analizi kullanılarak değerlendirilmiştirve fluorofor konjuge antikorlar CD11b ve F4/80 ifade hücreleri algılamak için.
3. BMDM Polarize Aktivasyon
- 7. günde taze ortam uyarılması değiştirin: M1 aktivasyonu için, IMDM 50 ng / ml, IFNy ile,% 10 FBS ve 100 ng / ml LPS ya da 100 ng / ml LPS içeren kullanımı, M2 aktivasyonu için,% 10 FBS içeren IMDM kullanmak 10 ng / ml IL-4 ve / veya 10 ng / ml IL-13.
- Sıcak% 0.05 tripsin kullanarak çanak bunların ayrılması ile uyarılan BMDMs toplayın, PBS% 10 FBS içeren hücreler iki kez yıkanması takip etti.
Not: farklılaşma sonra olgun makrofajlar,% 0.05 tripsin solüsyonu (0.48 mM EDTA, Invitrogen ihtiva eden) veya Ca ve Mg-içermeyen PBS veya Hank dengeli tamponu (HBSS) içerisinde 2-5 mM EDTA ayırmak ve yeniden süspanse etmek için kullanılabilir. Tripsin içeren sindirim orta kullanırken, hücrelerin sur kaybını önlemek için en az 10 dakika süreyle 37 ° C de tedavi ediliryüz aşırı sindirim nedeniyle proteinleri.
- CD11b F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ya da standart akış sitometrisi boyama işlemleri kullanarak, çeşitli zaman noktalarında CD86 dahil olmak üzere hücre yüzey antijenlerinin ekspresyonunu tespit etmek için antikorların kullanımı.
- QRT-PCR kullanılarak, IL-1β, TNF-α ve IL-6 (M1 aktivasyonu) veya IL-10, IL-13, arginase1 ve PPARy (M2 aktivasyonu) dahil olmak üzere, aktive edilmiş makrofajlar M1 ve M2 karakteristik genlerin ekspresyonunu belirlemek. Batı blot analizi ile M1 veya M2 makrofaj aktivasyonu ile ilgili hücre sinyal yollarının aktivasyonu belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMDM nesil prosedürün şematik bir açıklama (Şekil 1) sunulmuştur. Onlar CD11b + F4/80 + hücreler 95% 99 (Şekil 2) temsil zaman olgun makrofaj yüksek saflıkta 7. günde görülebilir. Polarize makrofajlar CD11b, F4/80 karşı antikor kullanılarak incelenebilir, CD11c ve CD206 akım sitometri analizi ile izledi. Şekil 3 'de gösterildiği gibi, M1 makrofajlar gibi tespit edilir CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-hücrelerinin (Q2), M2 makrofajlar CD11b oysa + + F4/80 CD11c-CD206 + hücreleri (S4). BMDM aktivasyon durumu artan hücresel boyutu (Şekil 4A, FSC-A sağa kaydırma) ve yüzey antijenleri artan bolluk CD69, CD80, veya makrofajlarda CD86 ile teyit edilebilir (Gate: CD11b + F4/80 +) Şekil gösterildiği gibi 4B. Sitokin üretimi, gen ekspresyonu ve M1 veya M2 makrofaj hücre sinyalleme yolunun aktivasyonu kantitatif RT-PCR ve western blotting ile değerlendirilebilir. Birs, Şekil 5'te gösterildiği gibi, arginaz 1 (Arg1) ve PPARy seviyesi 10 ng / ml IL-4 ile uyarılma sonucunda M2 makrofajlar artmıştır, IL-1β ve TNFa üretimi 100 ng / ml LPS ile stimüle makrofajlar (M1), artmıştır, oysa , hangi p65 aktivasyonu (Şekil 6) eşlik ediyor.
Şekil 1. Izolasyon, oluşumu ve fare BMDMs stimülasyonu için Şema. Prosedürlerinin adım adım metinde anlatılmıştır. Kısa, femur ve tibia kemikleri PBS 2% ısı inaktive FBS ile takviye kullanarak dışarı kızarmış 6-8 hafta fare ve kemik iliği hücreleri toplanır. Kırmızı kan hücreleri NH4CI çözeltisi ile lizlendi sonra, hücreler hücre popülasyonunun saflık için olgunlaşması ve analizi ile 7 gün boyunca BMDM büyüme ortamı içinde kültürlenmiştir. Makrofaj PO analizi için larization, hücrelerin aktivasyonu için M2 + IFNy M1, ya da IL-4 ve / veya IL-13 için LPS veya LPS ile stimüle edildi. Polarize makrofaj hücre morfolojik değişiklikler, yüzey işaretleyici sunumu, sitokin üretimi ve aktive edilmiş hücre sinyalizasyon yolunun temelinde değerlendirilir.
Şekil 2. BMDM oluşumu akış sitometri analizi. (A) BMDMs enkaz ve konjugatlar kaldırmak için FSC ve SSC ilk kapılı idi. (B) Olgun BMDMs olarak tanımlandı CD11b'nin yüzdesi olarak görüntülenen saflık ile + F4/80 + alt popülasyonlar (sağ üst) FSC / SSC kapılanan ana nüfus.
s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
Şekil 3,. . Makrofaj kutuplaşma analizi dokusu süzen makrofajlar CD11b + F4/80 + hücreleri gibi tanımlanmıştır; M1, makrofajlar olan CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-hücreleri, makrofajlar M2 CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + hücreleri 'tir.
Şekil 4. Flow sitometri ile makrofaj aktivasyon analizi. (A) aktivasyon üzerine, makrofajlar büyüklüğü olarak M0 (işlenmemiş) makrofajlar göre stimülasyon sonra 24 saat de M1 veya M2 makrofaj FSC-A vardiya kanıtladığı artırmak. (B) aktivasyon ile ilgili yüzey belirteçleri IL4 veya LPS stimülasyon sonra akım sitometri ile analiz edildi. Erken yanıt işaretleyici CD69 5 veya 24 saat sonrası stimülasyon değerlendirilmiştir; CD80 ve CD86 markers stimülasyon sonra 48 saat de analiz edildi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. Alternatif makrofaj aktivasyonu. 24 saat süre ile 10 ng / ml IL-4 ile uyarılan makrofajlar toplandı ve toplam RNA ekstre edildi. Kantitatif RT-PCR analizi kullanılarak tedavi makrofajlara kıyasla arginaz 1 (Arg1) ve PPARy ekspresyonu M2 makrofajlarda tespit edildi.
6 Şekil. Makrofaj aktivasyonu Klasik. (A), toplam RNA 100 ng / ml 'lik L ile uyarılan makrofajlardan ekstre edildi24 saat ve kantitatif RT-PCR analizlerinde kullanılan için PS. IL-1β ve TNFa içeren pro-enflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu M1 makrofajlar artmıştır. P65 antikorları kullanılarak saptanmış ve Western blotting analizleri fosforile p65 (B), NFKB yolunun aktivasyonu, LPS ile uyarılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada kemik iliği projenitör hücrelerinden elde edilen makrofajların aktivasyonu uyarmak için basit ve in vitro olarak kolaylıkla adapte prosedür sunulmuştur. Bu prosedür, makrofaj polarizasyon sorumlu mekanizmalarının incelenmesi için de kullanılabilir. Olgun makrofajlar saflığı bu protokolü ortalama 95 ila 99% kullanılarak elde ve ek saflaştırma işlemleri gereklidir. Makrofaj polarizasyon, ektopik ifade veya gen spesifik demonte bağlamında özel ilgi genlerin işlevine araştırmak 7. günde hücrelerin transfeksiyonu takiben yapılabilir. Bu protokol aynı zamanda oluşumu, olgunlaşma ve makrofaj fenotipi etkileyen bazı faktörler veya genlerin etkilerini araştırmak için 7 günlük kültür penceresi sağlayacaktır.
Aktive makrofajlar, çeşitli uyarıcılara 3, 9, 19 karşılık olarak yüksek plastik ile karmaşık hücresel ve moleküler profil gösterir. IçinBununla birlikte, aktivasyon profilleri tamamen örtüşmeyen, örneğin, IFNy LPS ya da tümör nekroz faktörü (TNF) ve IL-4 ve IL-13 M2 aktivasyonunu uyaran hem mevcudiyetinde daha da geliştirilmiş olabilir güçlü bir pro-inflamatuar M1 tepkileri ortaya çıkarır 3, 4, 9, 15, 19, 20. Bu protokolde sunulan sonuçlar sadece akım sitometri, kantitatif RT-PCR ve batı blot ile analiz kemik iliği kökenli makrofajlar ile deneyler tipik sonuçlarını temsil eder. Makrofaj aktivasyonu ile ilişkili yüzey antijen sunumu ve hücre sinyal yolları olarak makrofaj polarizasyon 1-8 kapsamlı literatürde belirtildiği değişir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (Dr Beiyan Zhou için BGIA 7.850.037) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
