Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

doi: 10.3791/50323 Published: June 23, 2013

Summary

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk adaptieve

Abstract

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk adaptief in vitro model om macrofaag polarisatie te onderzoeken. In aanwezigheid van GM-CSF/M-CSF worden hematopoietische stam / progenitorcellen uit het beenmerg gericht in monocytische differentiatie, gevolgd door M1 of M2 stimulatie. De activatie status kan worden gevolgd door veranderingen in celoppervlakteantigenen, genexpressie en signaaltransductie wegen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Onderscheiden van klassieke ontstekingsreacties macrofagen die weefsels infiltreren vertonen vaak gepolariseerd activeringsstatus die een cruciale rol in het regelen gastheerweefsel fysiologische functies 1-8 speelt. Na stimulatie kunnen macrofaagactivering worden gesorteerd in classic (M1) en alternatieve (M2) activering 2, 4, 9. M1 macrofaag activatie afhankelijk Toll-achtige receptoren (TLRs) en activering van nucleaire factor kappa B (NFKB) / c-Jun N-eindstandige kinase 1 (JNK1), wat leidt tot de productie van inflammatoire cytokines, zoals TNF-α en IL- 1β en activering van iNOS dat resulteert in verhoogde productie van reactieve zuurstofsoorten zoals nitride oxide (NO) 10, 11. Daarentegen M2 macrofaag activatie werft PPARy, PPARö of IL-4-STAT6 wegen, waardoor alternatieve, anti-inflammatoire (M2) activatie die is geassocieerd met verhoogde expressie van CD206 mannose receptor en arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.

Beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) presenteren een ideaal in vitro model om de mechanismen die polarisatie van geactiveerde macrofagen 15 begrijpen. Specifiek, kan de activering van macrofagen M1 worden geïnduceerd door lipopolysacchariden (LPS) stimulatie, terwijl polarisatie M2 macrofagen kunnen worden geïnduceerd door IL-4 en / of IL-13. Ouder beenmerg macrofagen en geactiveerde macrofagen kunnen worden geïdentificeerd aan flowcytometrie-analyse voor expressie van oppervlakte-antigenen, waaronder CD11b, F4/80, CD 11 c, CD206, CD69, CD80 en CD86 9, 16, 17. Bovendien kunnen veranderingen in cytokine productie en mobiele signaalwegen verbonden macrofaag polarisatierichting gemeten door kwantitatieve RT-PCR en Western-blotting, respectievelijk. Samenvattend kan muis beenmerg macrofagen dienen als een relevant model te bestuderen polarisatie macrofagen in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Isolatie van beenmergcellen

  1. Isoleer bovenbeen en onderbeen botten 6-8 weken oude muizen, afspoelen haar en vervolgens opengesneden het bot.
  2. Gebruik een 21G naald en 10 ml spuit voor het spoelen van merg in koud PBS 2% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) (3-5 ml / muis).
  3. Passeren merg door een 21G naald 4-6 keer om de cellen te scheiden.
  4. Passeren cellen door een 70 um cel zeef om celklonten, botten, haar en andere cellen / weefsels te verwijderen.
  5. Voeg 3 volume van NH4 Cl oplossing (0,8% NH4Cl-oplossing, Stemcell Technology) en incubeer op ijs gedurende 10 min om rode bloedcellen te verwijderen.
  6. Spin down cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  7. Resuspendeer de celpellet in koude PBS +2% FBS (20-50 ml, afhankelijk van de hoeveelheid cellen).

2. Inductie BMDM Formation

  1. Resuspendeer de geïsoleerde beenmergcellen in BMDM groeimedium (2x10 6 cellen / ml).

BMDM groeimedium:

Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) + 10% FBS + 15% gefiltreerd (0,2 urn) L-929 cellen (ATCC, CCL-1) kweek supernatant (dat monocyt-koloniestimulerende factor, M-CSF) of 10 ng / ml M -CSF.

Opmerking: L-929 celsupernatant bevat M-CSF 18. Om de effectieve activiteit van geconditioneerd medium, 5 zorgen X 10 5 L-929 cellen gezaaid in T75 cm2 kolven gedurende 6-7 dagen wordt het geconditioneerde medium verzameld en door een 0,45 uM filter voor gebruik. Medium aliquots kan onmiddellijk voor 1-2 maanden worden toegepast of opgeslagen in -80 ° C.

  1. Zaadcellen in 6 of 12 putjes weefselkweekplaten (afhankelijk van de proefopzet) (Corning Costar).
  2. Wijzig verse BMDM groeimedium op dag 3.
  3. Op dag 7, wordt de vorming van rijpe BMDM geëvalueerd middels flowcytometrie-analyseen fluorofoor geconjugeerde antilichamen te detecteren cellen die CD11b en F4/80.

3. BMDM gepolariseerde Activering

  1. Op dag 7, veranderen vers stimuleringsmedium: M1 voor activatie gebruikt IMDM dat 10% FBS en 100 ng / ml LPS of 100 ng / ml LPS bij 50 ng / ml IFNy, M2 voor activatie gebruikt IMDM dat 10% FBS met 10 ng / ml IL-4 en / of 10 ng / ml IL-13.
  2. Verzamel BMDMs gestimuleerd door deze los van de schaal met warm 0,05% trypsine, gevolgd door tweemaal wassen van de cellen met PBS bevattende 10% FBS.

Opmerking: Om los te maken en opnieuw in suspensie volwassen macrofagen na differentiatie, 0,05% trypsine-oplossing (bevattende 0,48 mM EDTA, Invitrogen) of 2-5 mM EDTA in Ca-en Mg-vrij PBS of gebalanceerde buffer Hank's (HBSS) kunnen worden gebruikt. Bij gebruik spijsvertering medium met trypsine worden cellen behandeld bij 37 ° C gedurende minder dan 10 min tot verlies sur voorkomengezicht eiwitten als gevolg van over-vergisting.

  1. Gebruik antilichamen voor expressie detecteren van celoppervlak antigenen, zoals CD11b, F4/80, CD 11 c, CD206, CD69, CD80 of CD86 op verschillende tijdstippen onder toepassing van standaard stroming cytometrie kleuringen.
  2. Bepaal expressie van genen kenmerkend geactiveerde M1 en M2 macrofagen waaronder IL-1β, TNF-α en IL-6 (M1 activering) of IL-10, IL-13, arginase1 en PPARy (M2 activatie) met qRT-PCR. Bepaal activering van cell signaling pathways betrokken bij de activering van de M1 of M2 macrofagen door western blotting analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een schematische beschrijving van de generatie procedure BMDM wordt weergegeven (figuur 1). Zuiver van volwassen macrofagen kunnen worden waargenomen op dag 7 wanneer deze hoeveelheden 95-99% van CD11b + F4/80 + cellen (Figuur 2). Gepolariseerde macrofagen kunnen worden onderzocht met behulp van antilichamen tegen CD11b, F4/80, CD11c en CD206 gevolgd door flowcytometrie-analyse. Zoals getoond in figuur 3, worden M1 macrofagen gedetecteerd als CD11b + F4/80 CD11c + CD206 +-cellen (Q2), terwijl M2 macrofagen CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + cellen (Q4). De BMDM activatie status kan worden bevestigd door verhoogde cellulaire formaat (figuur 4A, rechts verplaatsen in FSC-A) en grote overvloed van oppervlakte-antigenen CD69, CD80 of CD86 op macrofagen (Gate: CD11b + F4/80 +) zoals weergegeven in figuur 4B. Cytokineproductie, genexpressie en cell signaling pathway activatie M1 of M2 macrofagen kunnen worden geëvalueerd met kwantitatieve RT-PCR of Western blotting. Eens getoond in figuur 5, werden arginase 1 (Arg1) en PPARy stegen in M2 macrofagen bij 10 ng / ml IL-4 stimulatie; dat IL-1β en TNFa productie verhoogd in macrofagen (M1) gestimuleerd met 100 ng / ml LPS , wat gepaard gaat met p65 activatie (Figuur 6).

Figuur 1
Figuur 1. Stelsel voor de isolatie, vorming en stimulatie van muis BMDMs. Stapsgewijs worden beschreven in de tekst. In het kort, bovenbeen en onderbeen botten worden verzameld van 6-8 weken muizen en beenmergcellen uitgespoeld met PBS aangevuld met 2% warmte geïnactiveerd FBS. Na rode bloedcellen worden gelyseerd met NH4Cl-oplossing, worden de cellen gekweekt in groeimedium BMDM gedurende 7 dagen gevolgd door rijping en analysemethoden voor de zuiverheid van de celpopulatie. Voor de analyse van de macrofaag po satie, cellen werden gestimuleerd met LPS of LPS + IFNy voor M1 of IL-4 en / of IL-13 voor M2 activatie. Gepolariseerde macrofagen kunnen worden beoordeeld op basis van veranderingen in celmorfologie, oppervlakte marker presentatie cytokine productie cell signaling pathway geactiveerd.

Figuur 2
Figuur 2. Flowcytometrieanalyse van BMDM formatie. (A) BMDMs waren eerste gated op FSC en SSC om vuil en conjugaten te verwijderen. (B) Volwassen BMDMs werden gedefinieerd als CD11b + F4/80 + subpopulaties (rechtsboven) met de zuiverheid weergegeven als percentage van het ouder bevolking gated op FSC / SSC.

s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. . Macrofaag polarisatie analyse Tissue geïnfiltreerde macrofagen worden gedefinieerd als CD11b + F4/80 + cellen; M1 macrofagen zijn CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-cellen, terwijl M2 macrofagen zijn CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + cellen.

Figuur 4
Figuur 4. Macrofaagactivering analyse door flowcytometrie. (A) bij activering van de grootte van macrofagen verhogen zoals blijkt uit de verschuiving van FSC-A van M1 en M2 macrofagen op 24 uur na stimulatie vergeleken met M0 (onbehandeld) macrofagen. (B) De activering -gerelateerde oppervlak markers werden geanalyseerd door flow cytometrie na IL4 of LPS stimulatie. De vroege reageren marker CD69 werd geëvalueerd bij 5 of 24 uur na stimulatie, CD80 en CD86 markers werden geanalyseerd op 48 uur na stimulatie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5
Figuur 5. Alternatieve activering van macrofagen. Macrofagen gestimuleerd met 10 ng / ml IL-4 gedurende 24 uur verzameld en totaal RNA geëxtraheerd. Verhoogde arginase 1 (Arg1) en PPARy-expressie werd gedetecteerd in M2 macrofagen in vergelijking met onbehandelde macrofagen met kwantitatieve RT-PCR analyse.

Figuur 6
Figuur 6. Klassieke activatie van macrofagen. (A) Totaal RNA werd geëxtraheerd uit macrofagen gestimuleerd met 100 ng / ml LPS voor 24 uur en gebruikt in kwantitatieve RT-PCR analyses. Expressie van pro-inflammatoire cytokines zoals IL-1β en TNFa verhoogd M1 macrofagen. (B) Activering van NFKB pathway werd geïnduceerd door LPS werd vastgesteld met antilichamen tegen gefosforyleerd p65 en p65 in western blot analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Wij rapporteren hier een eenvoudige en gemakkelijk aanpasbaar vitro procedure activatie van macrofagen afgeleid van beenmerg cellen. Deze procedure kan worden gebruikt voor het onderzoek van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor polarisatie van macrofagen. De zuiverheid van volwassen macrofagen verkregen met dit protocol gemiddeld 95-99%, en geen extra zuivering vereist zijn. Om de functie van specifieke genen van belang te onderzoeken in het kader van macrofaag polarisatie, ectopische expressie of genspecifieke knockdown kan worden uitgevoerd na transfectie van de cellen op dag 7. Dit protocol zal ook een 7-dagen venster cultuur aan de gevolgen van bepaalde factoren of genen die de vorming, rijping en fenotype van macrofagen invloed te onderzoeken.

Geactiveerde macrofagen geven gecompliceerde cellulaire en moleculaire profielen met grote plasticiteit in reactie op diverse stimuli 3, 9, 19. Voorbijvoorbeeld LPS opwekt krachtige pro-inflammatoire M1 reacties die worden versterkt in aanwezigheid van IFNy of tumor-necrose factor (TNF) en IL-4 en IL-13 zowel stimuleren M2 activatie, maar niet de activatie profielen niet volledig overlappen 3, 4, 9, 15, 19, 20. De in dit protocol alleen resultaten vertegenwoordigen typische resultaten van experimenten met beenmerg afgeleide macrofagen door stroomcytometrie geanalyseerd, kwantitatieve RT-PCR en Western-blotting. Oppervlakte-antigeen presentatie en cell signaling pathways geassocieerd met de activatie van macrofagen variëren, zoals vermeld in de uitgebreide literatuur over macrofaag polarisatie 1-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (BGIA 7.850.037 aan Dr Beiyan Zhou).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Thermo Scientific SH30259.01
Fetal bovine serum Invitrogen 10438-026
Murine GM-CSF PeproTech 315-03
NH4Cl StemCell Technologies 7850
L-929 ATCC CCL-1
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
10 x PBS Thermo Scientific AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC eBioscience 17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC eBioscience 11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE eBioscience 12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE eBioscience 12-0862-81
Propidium Iodine Invitrogen P3566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).More

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter