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Immunology and Infection

अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग मैक्रोफेज ध्रुवीकरण की जांच

doi: 10.3791/50323 Published: June 23, 2013

Summary

लेख एक तत्काल आसान अनुकूली का वर्णन

Abstract

लेख बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण की जांच के लिए इन विट्रो मॉडल में एक तत्काल आसान अनुकूली का वर्णन करता है. GM-CSF/M-CSF की उपस्थिति में, अस्थि मज्जा से hematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं एम 1 या M2 उत्तेजना के द्वारा पीछा किया, monocytic भेदभाव में निर्देशित कर रहे हैं. सक्रियण स्थिति कोशिका की सतह प्रतिजनों, जीन अभिव्यक्ति और सेल संकेत दे रास्ते में परिवर्तन से लगाया जा सकता है.

Introduction

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शास्त्रीय भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, ऊतकों कि घुसपैठ मैक्रोफेज से अलग अक्सर मेजबान ऊतक शारीरिक कार्यों 1-8 विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ध्रुवीकृत सक्रियण स्थिति प्रदर्शित. उत्तेजना पर, बृहतभक्षककोशिका सक्रियण क्लासिक (एम 1) और विकल्प (M2) के सक्रियण 2, 4, 9 में हल किया जा सकता है. एम 1 बृहतभक्षककोशिका सक्रियण ऐसे TNF-α और के रूप में भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन करने के लिए अग्रणी टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs) और परमाणु कारक रूई बी (NFκB) / ग-Nov एन टर्मिनल काइनेज 1 (JNK1) की सक्रियता, पर निर्भर करता है, आईएल iNOS के 1β और सक्रियण कि ऐसे नाइट्राइड ऑक्साइड (सं) 10, 11 के रूप में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन में वृद्धि में परिणाम है. इसके विपरीत, M2 बृहतभक्षककोशिका सक्रियण रंगरूटों PPARγ, PPARδ, या आईएल-4-Stat6 रास्ते, वैकल्पिक mannose रिसेप्टर CD206 की upregulation के साथ जुड़ा हुआ है, विरोधी भड़काऊ (M2) के सक्रियण, और arginase 1 (arg1) 6, 12 के लिए अग्रणी - 14 </> समर्थन.

अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDM) सक्रिय मैक्रोफेज 15 के ध्रुवीकरण को नियंत्रित करने के तंत्र को समझने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक आदर्श प्रस्तुत करते हैं. M2 मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण आईएल -4 और / या आईएल -13 द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, जबकि विशेष रूप से, एम 1 मैक्रोफेज की सक्रियता, lipopolysaccharides (LPS) उत्तेजना के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. परिपक्व अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज और सक्रिय मैक्रोफेज CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 और CD86 9, 16, 17 सहित सतह एंटीजन की अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry विश्लेषण के माध्यम से पहचाना जा सकता है. इसके अलावा, cytokine उत्पादन और बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण के साथ जुड़े सेल संकेत दे रास्ते में परिवर्तन मात्रात्मक RT-पीसीआर और पश्चिमी क्रमशः, सोख्ता द्वारा मापा जा सकता है. सारांश में, माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज इन विट्रो में बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं.

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Protocol

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1. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के अलगाव

  1. 6-8 सप्ताह पुराने चूहों से फीमर और टिबिया हड्डियों को अलग, बाल कुल्ला और फिर हड्डी को काटा.
  2. ठंड पीबीएस 2% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (3-5 मिलीग्राम / माउस) में मज्जा बाहर निकलवाने के लिए एक 21G सुई और 10 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें.
  3. कोशिकाओं को अलग कर देना एक 21G सुई के माध्यम से 4-6 बार मज्जा गुजरती हैं.
  4. सेल clumps, हड्डी, बाल और अन्य कोशिकाओं / ऊतकों को हटाने के लिए एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं.
  5. एनएच 4 सीएल समाधान (0.8% एनएच 4 सीएल समाधान, stemcell प्रौद्योगिकी) की 3 मात्रा में जोड़ें, और लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं स्पिन
  7. ठंड पीबीएस + 2% FBS (20-50 मिलीलीटर, कोशिकाओं की मात्रा पर निर्भर करता है) में सेल गोली Resuspend.

2. प्रेरण BMDM गठन

  1. BMDM मध्यम विकास में पृथक अस्थि मज्जा की कोशिकाओं (2x10 6 कोशिकाओं / मी Resuspendएल).

BMDM मध्यम विकास:

Iscove के संशोधित है Dulbecco मध्यम (IMDM) + 10% FBS + 15% फ़िल्टर्ड (0.2 माइक्रोन) एल 929 सेल (ATCC, सीसीएल -1) संस्कृति तैरनेवाला (monocyte-कॉलोनी उत्तेजक कारक, एम सीएसएफ युक्त) या 10 एनजी / एमएल एम सी.एस.एफ..

नोट: एल 929 सेल तैरनेवाला एम सीएसएफ 18 होता है. वातानुकूलित माध्यम, 5 की प्रभावी गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए 10 एक्स 5 एल 929 कोशिकाओं 6-7 दिनों के लिए T75 सेमी 2 बोतल में वरीयता प्राप्त हैं, वातानुकूलित माध्यम उपयोग करने से पहले फिल्टर एक 0.45 माइक्रोन के माध्यम से एकत्र की है और पारित कर दिया है. मध्यम aliquots के 1-2 महीने के लिए तुरंत इस्तेमाल किया या -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है.

  1. 6 या 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट (प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है) (कोर्निंग Costar) में बीज कोशिकाओं.
  2. 3 दिन पर ताजा BMDM मध्यम विकास बदलें.
  3. दिन 7, परिपक्व BMDM के गठन के प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता हैऔर फ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी CD11b और F4/80 व्यक्त कोशिकाओं का पता लगाने के लिए.

3. BMDM फूट डालना सक्रियण

  1. दिन 7, ताजा उत्तेजना मध्यम को बदलने के लिए: एम 1 सक्रियण के लिए, IMDM 50 एनजी / एमएल IFNγ साथ 10% FBS और 100 एनजी / एमएल LPS या 100 एनजी / एमएल LPS युक्त का उपयोग करें, M2 के सक्रियण के लिए, के साथ 10% FBS युक्त IMDM उपयोग 10 एनजी / एमएल आईएल -4 और / या 10 एनजी / एमएल आईएल -13.
  2. गर्म 0.05% trypsin का उपयोग पकवान से उन्हें detaching से प्रेरित BMDMs लीजिए, पीबीएस 10% FBS युक्त के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने के द्वारा पीछा किया.

नोट: भेदभाव के बाद परिपक्व मैक्रोफेज, 0.05% trypsin समाधान (0.48 मिमी EDTA, Invitrogen युक्त) या सीए और मिलीग्राम मुक्त पीबीएस या हांक संतुलित बफर (HBSS) में 2-5 मिमी EDTA अलग और resuspend करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Trypsin युक्त पाचन माध्यम का उपयोग करते हैं, कोशिकाओं सुर के नुकसान से बचने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इलाज कर रहे हैंचेहरे पर पाचन के कारण प्रोटीन.

  1. CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 या मानक प्रवाह cytometry धुंधला प्रक्रियाओं का उपयोग कर विभिन्न बिंदुओं पर समय CD86 सहित सेल सतह एंटीजन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करें.
  2. QRT-पीसीआर का उपयोग आईएल 1β, TNF-α और आईएल -6 (एम 1 सक्रियण) या आईएल 10, आईएल -13, arginase1 और PPARγ (M2 के सक्रियण) सहित सक्रिय एम ​​1 और M2 मैक्रोफेज की विशेषता जीनों की अभिव्यक्ति का निर्धारण करते हैं. पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण द्वारा एम 1 या M2 मैक्रोफेज की सक्रियता में शामिल सेल संकेत दे रास्ते की सक्रियता का निर्धारण करते हैं.

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Representative Results

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BMDM पीढ़ी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध वर्णन (चित्रा 1) प्रस्तुत किया है. वे CD11b + F4/80 + कोशिकाओं के 95 99% (चित्रा 2) का प्रतिनिधित्व करते हैं जब परिपक्व मैक्रोफेज के उच्च शुद्धता दिन 7 पर देखा जा सकता है. फूट डालना मैक्रोफेज CD11b, F4/80 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर जांच की जा सकती, CD11c और CD206 प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा पीछा किया. के रूप में 3 चित्र में दिखाया, एम 1 मैक्रोफेज के रूप में पाया जाता है CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-कोशिकाओं (क्यू 2), एम 2 मैक्रोफेज CD11b हैं जबकि + F4/80 + CD11c-CD206 + कोशिकाओं (Q4). BMDM सक्रियण स्थिति बढ़ा सेलुलर आकार (चित्रा -4 ए, एफएससी ए में सही बदलाव) और सतह एंटीजन की वृद्धि की बहुतायत CD69, CD80, या मैक्रोफेज पर CD86 से इसकी पुष्टि की जा सकती है (गेट: CD11b + F4/80) चित्र में दिखाया गया है 4 बी. Cytokine उत्पादन, जीन अभिव्यक्ति और एम 1 या M2 मैक्रोफेज में सेल संकेतन मार्ग सक्रियण मात्रात्मक RT-पीसीआर या पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. एकएस चित्रा 5 में दिखाया गया है, arginase 1 (arg1) और PPARγ का स्तर 10 एनजी / एमएल आईएल -4 उत्तेजना पर M2 मैक्रोफेज में बढ़ रहे थे, आईएल 1β और TNFα उत्पादन 100 एनजी / एमएल LPS के साथ प्रेरित मैक्रोफेज (एम 1) में वृद्धि हुई थी, जबकि , जो p65 सक्रियण (चित्रा 6) के साथ है.

चित्रा 1
चित्रा 1. अलगाव, गठन और माउस BMDMs की उत्तेजना के लिए योजना. कदम प्रक्रिया द्वारा कदम पाठ में वर्णित हैं. संक्षिप्त, फीमर और टिबिया हड्डियों में पीबीएस 2% गर्मी निष्क्रिय FBS के साथ पूरक का उपयोग कर बाहर प्लावित 6-8 सप्ताह चूहों और अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से एकत्र कर रहे हैं. लाल रक्त कोशिकाओं NH4Cl समाधान के साथ lysed रहे हैं, कोशिकाओं सेल आबादी की शुद्धता के लिए परिपक्वता और विश्लेषण के बाद 7 दिनों के लिए BMDM मध्यम विकास में सुसंस्कृत हैं. बृहतभक्षककोशिका पुलिस के विश्लेषण के लिए larization, कोशिकाओं M2 के सक्रियण के लिए + IFNγ एम 1, या आईएल -4 और / या आईएल -13 लिए LPS या LPS के साथ प्रेरित किया गया. फूट डालना मैक्रोफेज सेल आकारिकी में परिवर्तन, सतह मार्कर प्रस्तुति, cytokine उत्पादन और सक्रिय सेल संकेतन मार्ग के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. BMDM गठन के प्रवाह cytometry विश्लेषण. (ए) BMDMs मलबे और conjugates के दूर करने के लिए FSC और एसएससी पर पहली gated थे. (बी) परिपक्व BMDMs के रूप में परिभाषित किया गया CD11b के प्रतिशत के रूप में प्रदर्शित पवित्रता के साथ + F4/80 + subpopulations (ऊपरी दाएँ) एफएससी / एसएससी पर gated जनक जनसंख्या.

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चित्रा 3. . मैक्रोफेज ध्रुवीकरण विश्लेषण ऊतक घुसपैठ मैक्रोफेज CD11b + F4/80 + कोशिकाओं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, एम 1 मैक्रोफेज CD11b हैं + F4/80 + CD11c + CD206-कोशिकाओं, M2 मैक्रोफेज CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + कोशिकाओं रहे हैं जबकि.

चित्रा 4
4 चित्रा. प्रवाह cytometry द्वारा बृहतभक्षककोशिका सक्रियण विश्लेषण. (ए) सक्रियण पर, मैक्रोफेज के आकार के रूप में एम 0 (इलाज) मैक्रोफेज की तुलना में उत्तेजना के बाद 24 घंटे में एम 1 या M2 मैक्रोफेज की एफएससी ए की पारी इसका सबूत वृद्धि हुई है. (बी) के सक्रियण से संबंधित सतह मार्करों IL4 या LPS उत्तेजना के बाद प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया. जल्दी जवाब देने मार्कर CD69 5 या 24 घंटे के बाद उत्तेजना में मूल्यांकन किया गया था, CD80 और CD86 markeरुपये उत्तेजना के बाद 48 घंटे में विश्लेषण किया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. मैक्रोफेज की वैकल्पिक सक्रियण. 24 घंटे के लिए 10 एनजी / एमएल आईएल -4 के साथ प्रेरित मैक्रोफेज एकत्र की है और कुल शाही सेना निकाले गए थे. मात्रात्मक RT-पीसीआर विश्लेषण का उपयोग इलाज मैक्रोफेज की तुलना में ऊंचा arginase 1 (arg1) और PPARγ अभिव्यक्ति M2 मैक्रोफेज में खोजा गया था.

चित्रा 6
6 चित्रा. मैक्रोफेज की शास्त्रीय सक्रियण. (ए) कुल शाही सेना के 100 एनजी / एमएल एल के साथ प्रेरित मैक्रोफेज से निकाला गया था24 घंटा और मात्रात्मक RT-पीसीआर विश्लेषण में इस्तेमाल के लिए पी एस. आईएल 1β और TNFα सहित proinflammatory साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति एम 1 मैक्रोफेज में वृद्धि हुई है. P65 के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके निर्धारित और पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण में p65 phosphorylated रूप में (बी) NFκB मार्ग के सक्रियण LPS के द्वारा प्रेरित किया गया था.

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Discussion

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हम यहाँ अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं से व्युत्पन्न मैक्रोफेज की सक्रियता को प्रेरित करने के लिए एक सरल और इन विट्रो में आसानी से अनुकूलनीय प्रक्रिया की रिपोर्ट. यह प्रक्रिया मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण के लिए जिम्मेदार तंत्र की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परिपक्व मैक्रोफेज की पवित्रता इस प्रोटोकॉल के औसत 95-99% का उपयोग कर प्राप्त है, और कोई अतिरिक्त शोधन प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं. बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण, अस्थानिक अभिव्यक्ति या जीन विशिष्ट पछाड़ना के संदर्भ में हितों का विशेष जीन के समारोह की जांच करने के लिए 7 दिन पर कोशिकाओं के निम्नलिखित अभिकर्मक का आयोजन किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का भी गठन, परिपक्वता और मैक्रोफेज के phenotype प्रभावित है कि कुछ कारक या जीन के प्रभावों की जांच के लिए एक 7 दिन की संस्कृति खिड़की प्रदान करेगा.

सक्रिय मैक्रोफेज विभिन्न उत्तेजनाओं 3, 9, 19 के जवाब में महान plasticity के साथ जटिल सेलुलर और आणविक प्रोफाइल प्रदर्शित करते हैं. के लिएहालांकि, सक्रियण प्रोफाइल को पूरी तरह से ओवरलैप नहीं है, उदाहरण के LPS, IFNγ या ट्यूमर परिगलन कारक (TNF) और आईएल -4 और आईएल -13 M2 के सक्रियण को प्रोत्साहित दोनों की मौजूदगी में आगे बढ़ाया जा सकता है जो प्रबल समर्थक भड़काऊ एम 1 प्रतिक्रियाओं elicits 3, 4, 9, 15, 19, 20. इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत परिणाम केवल प्रवाह cytometry, मात्रात्मक RT-पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता से विश्लेषण अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज साथ प्रयोगों के विशिष्ट परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं. मैक्रोफेज की सक्रियता से जुड़े सतह प्रतिजन प्रस्तुति और सेल संकेत दे रास्ते के रूप में बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण 1-8 पर व्यापक साहित्य में विख्यात बदलती हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (डॉ. Beiyan झोउ को BGIA 7850037) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Thermo Scientific SH30259.01
Fetal bovine serum Invitrogen 10438-026
Murine GM-CSF PeproTech 315-03
NH4Cl StemCell Technologies 7850
L-929 ATCC CCL-1
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
10 x PBS Thermo Scientific AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC eBioscience 17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC eBioscience 11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE eBioscience 12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE eBioscience 12-0862-81
Propidium Iodine Invitrogen P3566

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References

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Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).More

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).

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