Summary
L'articolo descrive un semplice facilmente adattabile
Abstract
L'articolo descrive un adattamento prontamente semplice modello in vitro per studiare la polarizzazione dei macrofagi. In presenza di GM-CSF/M-CSF, cellule staminali / progenitrici ematopoietiche del midollo osseo sono dirette nella differenziazione monocitica, seguita dall'attivazione M1 o M2. Lo stato di attivazione può essere seguita da cambiamenti antigeni di superficie cellulare, espressione genica e le vie di segnalazione cellulare.
Introduction
Distinto da risposte infiammatorie classiche, macrofagi che infiltrano i tessuti spesso mostrano lo stato di attivazione polarizzato che gioca un ruolo cruciale nella regolazione delle funzioni fisiologiche del tessuto ospite 1-8. Dopo la stimolazione, l'attivazione dei macrofagi possono essere ordinati in classic (M1) e alternativi (M2) attivazione 2, 4, 9. Attivazione dei macrofagi M1 dipende da recettori Toll-like (TLR) e l'attivazione del fattore nucleare kappa B (NFκB) / c-Jun N-terminal chinasi 1 (JNK1), che porta alla produzione di citochine infiammatorie, come TNF-α e IL- 1β e l'attivazione di iNOS che si traduce in un aumento della produzione di specie reattive come ossido di nitruro (NO) 10, 11. In contrasto, M2 macrofagi attivazione reclute PPARy, PPARδ, o IL-4-STAT6 percorsi, portando a antinfiammatorio attivazione alternativa, (M2) che è associato con sovraregolazione di mannosio recettore CD206, e arginasi 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.
Midollo osseo macrofagi derivati (BMDM) presentano un ideale modello in vitro per capire i meccanismi che controllano la polarizzazione dei macrofagi attivati 15. Specificamente, l'attivazione dei macrofagi M1 può essere indotta da lipopolisaccaridi (LPS) stimolazione, mentre la polarizzazione dei macrofagi M2 può essere indotta da IL-4 e / o IL-13. Mature del midollo osseo macrofagi derivati e macrofagi attivati possono essere identificati attraverso l'analisi di citometria a flusso per l'espressione di antigeni di superficie, tra cui CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 9, 16, 17. Inoltre, i cambiamenti nella produzione di citochine e di vie di segnalazione cellulari connessi con polarizzazione dei macrofagi possono essere misurati mediante RT-PCR e western blotting, rispettivamente. In sintesi, il midollo osseo del topo macrofagi derivati possono servire da modello rilevante per studiare polarizzazione dei macrofagi in vitro.
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Protocol
1. Isolamento di cellule del midollo osseo
- Isolare femore e tibia ossa di 6-8 settimane di età i topi, risciacquare i capelli e poi tagliare aprire l'osso.
- Utilizzare un ago 21G e siringa da 10 ml per scovare midollo in PBS freddo +2% inattivato con il calore siero bovino fetale (FBS) (3-5 ml / mouse).
- Passare osseo attraverso un ago 21G 4-6 volte dissociare le cellule.
- Passate le cellule attraverso un colino cellula 70 micron per rimuovere grumi di cellule, ossa, capelli e altre cellule / tessuti.
- Aggiungere 3 volumi di soluzione di NH 4 Cl (0,8% soluzione di NH 4 Cl, Stemcell Technology), e incubare in ghiaccio per 10 minuti per rimuovere le cellule rosse del sangue.
- Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Risospendere il pellet di cellule in PBS freddo +2% FBS (20-50 ml, a seconda della quantità di cellule).
2. Induzione BMDM Formazione
- Risospendere le isolate cellule del midollo osseo in BMDM mezzo di crescita (2x10 6 cellule / ml).
Crescita BMDM media:
Piano di Iscove Modified Dulbecco (IMDM) + 10% FBS + 15% filtrata (0,2 micron) L-929 cellule (ATCC CCL-1) sovranatante di coltura (contenente monocito fattore stimolante le colonie, M-CSF) o 10 ng / ml M -CSF.
Nota: L-929 surnatante cella contiene M-CSF 18. Per garantire l'attività effettiva di mezzo condizionato, 5 x 10 5 L-929 cellule sono seminate in fiasche T75 cm 2 per 6-7 giorni, mezzo condizionato viene raccolta e fatta passare attraverso un filtro 0,45 micron prima dell'uso. Aliquote medie possono essere utilizzate immediatamente o conservate in -80 ° C per 1-2 mesi.
- Cellule di semi in 6 o 12 piastre di coltura di tessuti e (a seconda del disegno sperimentale) (Corning Costar).
- Cambiare BMDM fresco mezzo di crescita al giorno 3.
- Il giorno 7, la formazione di BMDM maturo viene valutata utilizzando l'analisi di citometria a flussoe fluoroforo anticorpi coniugati per rilevare le cellule che esprimono CD11b e F4/80.
3. BMDM attivazione Polarized
- Il giorno 7, cambiare per mezzo di stimolazione fresco: per l'attivazione M1, utilizzare IMDM contenente 10% FBS e 100 ng / ml di LPS o 100 ng / ml LPS con 50 ng / ml di IFN-y, per l'attivazione M2, usare IMDM contenente 10% FBS con 10 ng / ml di IL-4 e / o 10 ng / ml di IL-13.
- Collect BMDMs stimolati da staccandoli dal piatto caldo utilizzando 0,05% tripsina, seguita da lavaggio le cellule due volte con PBS contenente 10% FBS.
Nota: Per staccare e sospendere nuovamente macrofagi maturi dopo la differenziazione, soluzione di tripsina 0,05% (contenente 0,48 mM EDTA, Invitrogen) o 2-5 mm a Ca-Mg e priva di PBS o tampone bilanciata di Hank (HBSS) EDTA può essere utilizzato. Quando si utilizza medie digestivo contenente tripsina, le cellule vengono trattate a 37 ° C per meno di 10 min per evitare la perdita di surProteine faccia a causa di sovra-digestione.
- Usare gli anticorpi per rilevare l'espressione di antigeni di superficie, tra cui CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 o CD86 in vari momenti che utilizzano procedure di colorazione di citometria a flusso standard.
- Determinare l'espressione di geni caratteristici di macrofagi M1 e M2 attivati compreso IL-1β, TNF-α e IL-6 (attivazione M1) o IL-10, IL-13, arginase1 e PPAR (attivazione M2) mediante RT-PCR quantitativa. Determinare l'attivazione delle vie di segnalazione cellulare coinvolti nella attivazione dei macrofagi M1 o M2 da western blotting.
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Representative Results
Una descrizione schematica del procedimento BMDM generazione è presentato (Figura 1). Elevata purezza dei macrofagi maturi può osservare il giorno 7, quando rappresentano il 95 al 99% di CD11b + F4/80 + cellule (Figura 2). Macrofagi polarizzati possono essere esaminati utilizzando anticorpi contro CD11b, F4/80, CD11c e CD206 seguiti da analisi di citometria a flusso. Come mostrato in figura 3, i macrofagi M1 vengono rilevati come CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-cellule (2T), mentre i macrofagi M2 sono CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + cellule (Q4). Lo stato di attivazione BMDM può essere confermata dalla maggiore dimensione cellulare (Figura 4A, spostamento a destra in FSC-A) e maggiore abbondanza di antigeni di superficie CD69, CD80, CD86 o sui macrofagi (Uscita: CD11b + F4/80 +) come mostrato in Figura 4B. Produzione di citochine, l'espressione genica e cellule di attivazione segnalazioni pathway in macrofagi M1 o M2 possono essere valutati mediante RT-PCR o Western blotting. As mostrato in figura 5, i livelli PPARy arginasi 1 (Arg1) e sono stati aumentati in macrofagi M2 su di 10 ng / ml di IL-4 stimolazione; che la produzione di IL-1β e TNFa sono stati aumentati in macrofagi (M1) stimolati con 100 ng / ml LPS , che è accompagnata da p65 attivazione (Figura 6).
Figura 1. Schema per l'isolamento, la formazione e la stimolazione di BMDMs mouse. Passo dopo passo le procedure sono descritte nel testo. In breve, femore e tibia ossa sono raccolte 6-8 settimane i topi e le cellule del midollo osseo spurgati utilizzando PBS integrato con il 2% di FBS inattivato. Dopo globuli rossi vengono lisati con soluzione di NH4Cl, le cellule sono coltivate in terreno di crescita BMDM per 7 giorni, seguiti da stagionatura e analisi per la purezza della popolazione cellulare. Per l'analisi dei macrofagi Po vascolarizzazione, le cellule sono state stimolate con LPS o LPS + IFNy per M1, o IL-4 e / o IL-13 per l'attivazione M2. Macrofagi polarizzati possono essere valutati sulla base dei cambiamenti della morfologia cellulare, presentazione marcatore di superficie, la produzione di citochine e cellule via di segnalazione attivata.
Figura 2. Analisi di citometria a flusso di formazione BMDM. (A) BMDMs erano prima gated su FSC ed SSC per rimuovere i detriti e coniugati. (B) BMDMs maturi sono stati definiti come CD11b + F4/80 + sottopopolazioni (in alto a destra) con la purezza visualizzata come percentuale della popolazione genitore gated su FSC / SSC.
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Figura 3. . Analisi di polarizzazione dei macrofagi tissutali macrofagi infiltrati sono definiti come CD11b + F4/80 + cellule, i macrofagi M1 sono CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-cellule, mentre i macrofagi M2 sono CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + cellule.
Figura 4. Macrofagi analisi per attivazione mediante citometria a flusso. (A) All'attivazione, la dimensione dei macrofagi aumentano come evidenziato dallo spostamento di FSC-A di M1 o M2 macrofagi a 24 ore dopo la stimolazione rispetto al M0 (non trattato) macrofagi. (B) L'attivazione relativi marcatori di superficie sono stati analizzati mediante citometria a flusso dopo stimolazione IL4 o LPS. I primi rispondono marcatore CD69 è stata valutata in 5 o 24 ore di post-stimolazione; CD80 e CD86 markers sono stati analizzati a 48 ore dopo la stimolazione. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. Attivazione alternativa dei macrofagi. Macrofagi stimolati con 10 ng / ml di IL-4 per 24 ore sono stati raccolti e RNA totale estratto. Arginasi elevata 1 (Arg1) e PPAR espressione è stata rilevata nei macrofagi M2 rispetto ai macrofagi trattati con RT-PCR quantitativa.
Figura 6. Attivazione dei macrofagi classica. (A) RNA totale è stato estratto da macrofagi stimolati con 100 ng / ml di LPS per 24 ore e utilizzato in analisi quantitative RT-PCR. Espressione di citochine proinfiammatorie tra cui IL-1β e TNFa aumentata in macrofagi M1. (B) L'attivazione della via NFκB stata indotta da LPS come determinato utilizzando anticorpi per p65 e p65 fosforilato nelle analisi Western blotting.
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Discussion
Riportiamo qui una procedura semplice e facilmente adattabile in vitro per indurre attivazione dei macrofagi derivati da midollo osseo cellule progenitrici. Questa procedura può essere utilizzata per le indagini di meccanismi responsabili per la polarizzazione dei macrofagi. La purezza dei macrofagi maturi ottenuti usando questo protocollo medie 95-99%, e non necessita di ulteriori procedure di purificazione. Per studiare la funzione dei geni specifici di interesse nel contesto di polarizzazione macrofagica, espressione ectopica o knockdown specifico gene può essere condotta seguente trasfezione delle cellule il giorno 7. Questo protocollo fornirà anche una finestra di cultura di 7 giorni per indagare l'impatto di alcuni fattori o geni che influenzano la formazione, la maturazione e fenotipo dei macrofagi.
Macrofagi attivati visualizzare profili cellulari e molecolari complicati con grande plasticità in risposta a vari stimoli 3, 9, 19. Peresempio, LPS suscita potenti risposte proinfiammatorie M1 che può essere ulteriormente migliorata in presenza di IFN-y o fattore di necrosi tumorale-(TNF) e IL-4 e IL-13 sia stimolare attivazione M2, tuttavia, i profili di attivazione non si sovrappongono completamente 3, 4, 9, 15, 19, 20. I risultati presentati in questo protocollo rappresentano solo risultati tipici di esperimenti con midollo osseo macrofagi derivati analizzati mediante citometria di flusso, RT-PCR e western blotting. Presentazione dell'antigene di superficie e vie di segnalazione cellulari associati con l'attivazione dei macrofagi variano come notato nella vasta letteratura sulla polarizzazione dei macrofagi 1-8.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (BGIA 7.850.037 al dottor Beiyan Zhou).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
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