Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов

doi: 10.3791/50323 Published: June 23, 2013

Summary

В статье описана легко легко адаптивная

Abstract

В статье описана легко легко адаптивная в пробирке модель для исследования макрофагов поляризации. В присутствии GM-CSF/M-CSF, гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники из костного мозга направлены на дифференциацию моноцитов, а затем М1 или М2 стимуляции. Состояние активации можно отслеживать изменения в антигены на поверхности клеток, экспрессию генов и путей клеточной сигнализации.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Отличной от классической воспалительной реакции, макрофаги, которые пропитывают ткани часто демонстрируют поляризованного состояния активации, который играет важную роль в регуляции тканей хозяина физиологические функции 1-8. При стимуляции, активации макрофагов можно разделить на классические (M1) и альтернативные (М2) активация 2, 4, 9. M1 активации макрофагов зависит от Toll-подобных рецепторов (TLR,) и активацию ядерного фактора каппа В (NFκB) / с-Jun N-концевой киназы 1 (JNK1), что приводит к продукции воспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL- 1β и активации иСОА, что приводит к увеличению образования активных форм кислорода, таких как нитрид азота (NO) 10, 11. В противоположность этому, M2 активации макрофагов новобранцев PPAR-, PPAR, или IL-4 STAT6 путей, что приводит к альтернативе, противовоспалительные (М2) активации, которая связана с активацией рецептора маннозы CD206 и аргиназа 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Вир>.

Костного мозга макрофагов (BMDM) представляют идеал в пробирке модель, чтобы понять механизмы, контролирующие поляризации активированными макрофагами 15. В частности, активация М1 макрофагов может быть индуцирована липополисахаридов (ЛПС) стимуляции, тогда поляризации M2 макрофагов может быть индуцирована IL-4 и / или IL-13. Зрелые костного мозга макрофаги и активированные макрофаги могут быть идентифицированы посредством анализа потока цитометрии экспрессии поверхностных антигенов, в том числе CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 и CD86, 9, 16, 17. Кроме того, изменения в продукции цитокинов и клеточных сигнальных путей, связанных с макрофагами поляризации можно измерить с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, соответственно. Таким образом, мыши костного мозга макрофаги могут служить соответствующие модели для изучения макрофаг поляризации в пробирке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Выделение клеток костного мозга

  1. Изолировать бедра и голени кости от 6-8 недельных мышей, ополоснуть волосы, а затем разрезать кости.
  2. Используйте 21G иглу и шприц объемом 10 мл, чтобы избавиться от мозга в холодной PBS +2% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (3-5 мл / мышь).
  3. Передайте мозга через 21G иглу 4-6 раз для диссоциации клеток.
  4. Проход клеток через 70 мкм сито ячейка для удаления скопления клеток, костей, волос и других клеток / ткани.
  5. Добавить 3 объема раствора NH4Cl (0,8% раствора NH4Cl, Stemcell технологии), и инкубировать на льду в течение 10 мин для удаления красных кровяных телец.
  6. Спином вниз клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
  7. Ресуспендируют осадок клеток в холодном PBS + 2% FBS (20-50 мл, в зависимости от количества клеток).

2. Формирование Индукционная BMDM

  1. Ресуспендируют изолированных клеток костного мозга в питательной среде BMDM (2х10 6 клеток / мл).

BMDM питательной среде:

Исков, модифицированной по способу Дульбекко среды (IMDM) + 10% FBS + 15% фильтровали (фильтр 0,2 мкм) L-929 клетки (АТСС, CCL-1) культурального супернатанта (содержащего моноцитов колониестимулирующий фактор, M-CSF) или 10 нг / мл M -CSF.

Примечание: L-929 клетки супернатант содержит M-CSF 18. Для обеспечения эффективной активности кондиционированной среды, 5 × 10 5 L-929 клетки высевают в T75 см2 колбах в течение 6-7 дней, кондиционированную среду собирали и пропускали через 0,45 мкм фильтр перед использованием. Средний аликвоты можно использовать сразу или хранить в -80 ° С в течение 1-2 месяцев.

  1. Семенной клеток в 6 или 12-луночных планшетах для культуры тканей (в зависимости от плана эксперимента) (Corning Costar).
  2. Изменение свежую среду роста BMDM на 3 день.
  3. На 7 день, образование зрелых BMDM оценивается с помощью анализа проточной цитометриии флуорофором конъюгированных антител для обнаружения клеток, экспрессирующих CD11b и F4/80.

3. BMDM поляризованные Активация

  1. На 7 день менять на свежую среду стимуляции: для активации M1, использовать IMDM, содержащей 10% FBS и 100 нг / мл ЛПС, или 100 нг / мл ЛПС с 50 нг / мл IFN-; для M2 активации использовать IMDM, содержащей 10% FBS с 10 нг / мл IL-4 и / или 10 нг / мл IL-13.
  2. Сбор стимулировали BMDMs путем отделения их от тарелки теплой 0,05% трипсин, с последующей промывкой клетки дважды ЗФР, содержащим 10% FBS.

Примечание: Для отсоединения и ресуспендируют зрелых макрофагов после дифференцировки, 0,05% трипсина раствора (содержащего 0,48 мМ ЭДТА, Invitrogen) или 2-5 мМ ЭДТА в Са и Mg, свободный PBS или сбалансированный буфера Хенкса (HBSS), могут быть использованы. При использовании пищеварительной среды, содержащей трипсин, клетки обрабатывают при 37 ° С в течение менее 10 мин, чтобы избежать потери SurЛицо белки из-за чрезмерной пищеварения.

  1. Использование антител к детекции экспрессии антигенов клеточной поверхности, включая CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 или CD86 в различные моменты времени с использованием стандартных методов проточной цитометрии окрашивания.
  2. Определить экспрессию генов, характерных активированного M1 и M2 макрофагов в том числе IL-1β, TNF-α и IL-6 (M1 активации) или IL-10, IL-13, arginase1 и PPAR-(M2 активации) с использованием QRT-PCR. Определите активацию сигнальных путей клетки участвуют в активации М1 или М2 макрофаги помощи вестерн-блоттинга анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Схематическое описание BMDM процедура генерации представлен (Рис. 1). Высокая чистота зрелых макрофагов можно наблюдать на 7-й день, когда они представляют от 95 до 99% + F4/80 CD11b + клеток (рис. 2). Поляризованные макрофаги могут анализироваться с помощью антител против CD11b, F4/80, CD11c и CD206 последующим анализом потока цитометрии. Как показано на рисунке 3, M1 макрофагов определяются как CD11b + F4/80 CD11c + CD206 +-клеток (Q2), а M2 макрофаги CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + клеток (Q4). BMDM статус активации может быть подтверждено повышение сотовой размер (фиг.4А сдвиг вправо на FSC-A) и повышенной обилие поверхностных антигенов CD69, CD80 или CD86 на макрофагах (Выход: CD11b + F4/80 +), как показано на рисунке 4В. Продукцию цитокинов, экспрессии генов и клеточных сигнальных путей активации в М1 или М2 макрофаги могут быть оценены с использованием количественной ОТ-ПЦР или вестерн-блоттинга.сек показано на рисунке 5, аргиназа 1 (Arg1) и PPAR, уровни были увеличены в М2 макрофагов на 10 нг / мл IL-4 стимуляции, тогда как IL-1β и TNF-производства были увеличены в макрофагах (M1) стимулировали 100 нг / мл ЛПС , который сопровождается активацией р65 (рис. 6).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема для изоляции, формирование и стимулирование мышь BMDMs. Шаг за шагом процедуры описаны в тексте. Короче говоря, бедра и голени кости собирают из 6-8 недель мышей и клеток костного мозга промыть использованием PBS с добавлением 2% инактивированную нагреванием FBS. После красные кровяные клетки лизируют раствором NH4Cl, клетки культивируют в питательной среде BMDM в течение 7 дней с последующим созреванием и анализ на чистоту клеточной популяции. Для анализа макрофаг ро поляризации, клетки стимулировали LPS или ЛПС + IFN, для M1, или IL-4 и / или IL-13 для M2 активации. Поляризованные макрофаги могут быть оценены на основе изменений в морфологии клеток, представление поверхностный маркер, продукции цитокинов и клеточного сигнального пути активированы.

Рисунок 2
Рисунок 2. Проточной цитометрии анализа BMDM формирования. (A) BMDMs были первыми на закрытом FSC и SSC для удаления мусора и конъюгатов. (B) Пожилые BMDMs были определены как CD11b + + F4/80 субпопуляции (вверху справа) с чистотой показывается в процентах от родительской популяции закрытого на FSC / SSC.

s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3. . Макрофага поляризационный анализ тканей пропитанных макрофаги определяются как CD11b + F4/80 + клеток; M1 макрофаги CD11b + + F4/80 CD11c + CD206-клетки, в то время как М2 макрофаги CD11b + CD11c F4/80 + CD206 +-клеток.

Рисунок 4
Рисунок 4. Макрофаги активационного анализа методом проточной цитометрии. (A) При активации, размер макрофагов увеличить, о чем свидетельствует смещение FSC-М1 или М2 макрофаги через 24 часа после стимуляции по сравнению с M0 (необработанный) макрофагами. (В) активации связанных поверхностных маркеров были проанализированы с помощью проточной цитометрии после стимуляции IL-4 или ЛПС. Ранние отвечает маркером CD69 оценивалась в 5 или 24 ч после стимуляции; CD80 и CD86 МаркеRS анализировали через 48 часов после стимуляции. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 5
Рисунок 5. Альтернативные активации макрофагов. Макрофаги стимулировали 10 нг / мл IL-4 в течение 24 ч, собирают и общей РНК, экстрагированной. Повышенные аргиназа 1 (Arg1) и PPAR-выражение было обнаружено в М2 макрофагов по сравнению с необработанными макрофагами с использованием количественной ОТ-ПЦР анализа.

Рисунок 6
Рисунок 6. Классическая активации макрофагов. (А) Общую РНК экстрагировали из макрофагов стимулировали 100 нг / мл LPS в течение 24 ч и использованы в количественной ОТ-ПЦР. Выражение провоспалительных цитокинов, включая IL-1β и TNF-увеличилось М1 в макрофагах. (B) активация пути NFκB индуцировали ЛПС, как определено с использованием антител к p65 и p65 фосфорилированный в вестерн-блоттинг анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мы сообщаем здесь простые и легко адаптируются в пробирке процедуры, чтобы вызвать активацию макрофагов, полученных из клеток костного мозга предшественников. Эта процедура может быть использована для исследования механизмов, ответственных за поляризации макрофагов. Чистота зрелых макрофагов, полученные с использованием этого протокола среднем от 95 до 99%, и никаких дополнительных процедур очистки не требуется. Для исследования функции специфических генов интересов в контексте макрофаг поляризации, эктопической экспрессии конкретного гена или нокдауна может быть проведена после трансфекции клеток на 7 день. Этот протокол также обеспечит 7-дневная культура окно исследовать воздействие определенных факторов или генов, которые влияют на формирование, созревание и фенотипа макрофагов.

Активированные макрофаги отображения сложных клеточных и молекулярных профилей с большой пластичностью в ответ на различные стимулы 3, 9, 19. ДляНапример, ЛПС вызывает мощный провоспалительных M1 ответов, которые могут быть дополнительно повышена в присутствии IFN-или фактора некроза опухоли (ФНО) и IL-4 и IL-13, как стимулировать M2 активации, однако, активация профили не полностью перекрываются 3, 4, 9, 15, 19, 20. Результаты, представленные в этом протоколе только представляют собой типичные результаты экспериментов с костного мозга макрофагов анализировали с помощью проточной цитометрии, ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга. Поверхность презентации антигена и путей передачи клеточных сигналов, связанных с активацией макрофагов зависят как отмечалось в обширной литературе по макрофагов поляризации 1-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа выполнена при поддержке Американской Ассоциации Сердца (BGIA 7850037 доктору Beiyan Чжоу).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Thermo Scientific SH30259.01
Fetal bovine serum Invitrogen 10438-026
Murine GM-CSF PeproTech 315-03
NH4Cl StemCell Technologies 7850
L-929 ATCC CCL-1
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
10 x PBS Thermo Scientific AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC eBioscience 17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC eBioscience 11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE eBioscience 12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE eBioscience 12-0862-81
Propidium Iodine Invitrogen P3566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).More

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter