Summary
Eine integrierte Mikrofluidvorrichtung thermoplastischen Chip zur Verwendung als molekulare Diagnostik entwickelt. Der Chip führt Nukleinsäureextraktion, reverse Transkriptase und PCR. Methoden zur Herstellung und den Betrieb der Chip beschrieben.
Abstract
Schnelle und effektive Diagnostik spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung Infektionskrankheit, die durch eine effektive Patienten-Management und Behandlung. Hier präsentieren wir einen integrierten mikrofluidischen thermoplastischen Chip mit der Fähigkeit zur Influenza-A-Virus bei Patienten Nasen-Rachen-(NP) Tupfer und saugt verstärken. Beim Laden der Patientenprobe, die Mikrofluideinheit sequentiell durchführt On-Chip Zelllyse, RNA-Reinigung und Konzentration in der Festphasenextraktion (SPE), die reverse Transkription (RT) und Polymerasekettenreaktion (PCR) in der RT-PCR-Kammern, jeweils. Endpunktbestimmung erfolgt mit einem außerhalb des Chips Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Für Peripheriegeräte, verwendeten wir ein einziges Spritzenpumpe, um Reagenz und Proben anzutreiben, während zwei Dünnschichtheizelemente als Wärmequellen für die RT und PCR Kammern wurden verwendet. Der Chip wurde entwickelt, um einzelne Schicht und geeignet für hohen Durchsatz, um die Fertigung zu reduzieren fabricatiZeit und Kosten. Der mikrofluidische Chip bietet eine Plattform für eine Vielzahl von Viren und Bakterien, die nur durch Änderungen im Reagenz-Design benötigt, um neue Krankheitserreger von Interesse erkennen beschränkt zu analysieren.
Introduction
Millionen von Todesfällen während der drei Influenza-Pandemien des 20. Jahrhunderts 1 berichtet. Darüber hinaus wurde die jüngste Influenza-Pandemie durch die Weltgesundheitsorganisation (WHO) zwei im Jahr 2009 erklärt, und zum 1. August 2010, 18.449 Todesfälle wurden von der WHO 3 angegeben. Diese Pandemie gezeigt erneut die hohe Belastung durch Infektionskrankheiten, und die Notwendigkeit für eine schnelle und präzise Erkennung von Influenza schnell Krankheiten Bestätigung entsprechende Reaktion des Gesundheitswesens und wirksame Behandlung 4 zu ermöglichen.
Es gibt mehrere Methoden häufig zur Diagnose von Influenza verwendet werden, umfassen diese schnelle Immunoassays, direkte Fluoreszenz-Antigen-Tests (DFA) und Viruskultur Methoden. Schnelle Immuntests drastisch fehlt Empfindlichkeit 5-8, während die beiden anderen Methoden arbeitsintensiv und zeitaufwendig 9 sind. Molekulare Tests bieten mehrere Vorteile, einschließlich einer kurzen Turn-around-Zeit, hohe Sensitduktivität und höhere Spezifität. Mehrere kommerzielle Einrichtungen haben zu schnellen molekularen Tests (auch als Nukleinsäure-Tests oder NATs) arbeitet für Infektionskrankheiten, und einige haben Influenza-Tests in ihren Pipelines. Doch die meisten von ihnen verlangen, Off-Chip-Probenvorbereitung. Keiner der Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) verzichtet molekularen Tests beinhalten Probenvorbereitung in die Testkassette oder Modul.
Lab-on-a-Chip-Technik spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Point-of-Care-Prüfgeräte. Nach der Einführung des ersten PCR-Chip 1993 10 wurden zahlreiche Anstrengungen in die Entwicklung Nukleinsäure Testchips gesetzt worden. Haben jedoch nur wenige davon integrierten rohe Probenvorbereitung mit nachgeschalteter Verstärkung.
Wir haben zuvor die Miniaturisierung einer Festphasenextraktion Säule (SPE) in einem Kunststoff mikrofluidischen Chip 11 demonstriert und die Entment und Optimierung eines kontinuierlichen Stroms PCR-Chip 12. Hier erweitern wir die bisherigen Arbeiten, die SPE mit RT-und PCR-Schritte integriert in einem einzigen Chip für die klinische Diagnostik und demonstrieren ihre Fähigkeit, Nukleinsäuren aus Patienten Nasen-Rachen-(NP) Tupfer und saugt verstärken.
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Protocol
Ein. Chipfertigungstechnologie 12
- Machen Sie zwei Plaques aus Zeonex 690R Pellets: verteilen 8-9 Gramm Zeonex Pellets gleichmäßig in der Mitte einer Metallplatte, heizen auf der beheizten Presse bei 198 ° C für 5 min, und wenden Sie dann langsam den Druck bis 2.500 psi für weitere 5 min. Um diesen Schritt abzuschließen, haben wir eine Carver Heißpresse.
- Prägen das mikrofluidischen Kanal in der Plaque mit einem Epoxy-Form. Einzelheiten zur Herstellung der Form an anderer Stelle 12 (Kanal Design in 2b) beschrieben: legte eine Plaque auf den Epoxid-Form; vorzuwärmen sie auf der beheizten Presse bei 157 ° C für 10 min und dann gelten Druck langsam auf 1000 psi für weitere 10 min . Entfernen Sie die Plaque von der Form von Hand oder mit einer Zange, bevor es abkühlt. (Hinweis: Tragen thermische Handschuhe während dieser Schritt.)
- Die Bohrungen in der geprägten Chip am Einlass, Abfall-Port und dem Ausgang des Mikrofluidkanals. Wir verwendeten eine 1,25 mm DurchmesserEter Bohrer, um die drei Löcher machen.
- Bond das geprägte Chip mit anderen Plaque (oben): Waschen Sie die Chips mit IPA, RNAse Auswärts-und VE-Wasser in der Reihenfolge; der Luft trocknen und wärmen sie auf der beheizten Presse bei 131 ° C für 10 min und dann bei 350 psi für eine andere 10 min.
- Bringen Nanoports am Einlass, Abfall und den Auslassöffnungen separat mit JB Weld Epoxy, Heilung für 15 bis 24 Stunden nach den Anweisungen des Herstellers.
- Spülen Sie die SPE-Kanal mit 50 ul RNAse Away, mit 100 ul Nuklease freiem Wasser folgte.
- Laden das SPE Kanal mit 4 ul der Pfropflösung (Methylmethacrylat mit 3% w / v Benzophenon) und dann Vernetzen des Methacrylat durch Inkubation für 10 min in einem UV-Ofen unter 365 nm UV-Wellenlänge und 2000 mJ / cm 2. Entfernen Sie die restliche Pfropfen Lösung mit Vakuum. Wir haben die Wand Vakuum. Für die besten Ergebnisse sollte eine frische Lösung verwendet werden. Es ist üblicherweise jedoch akzeptabel, zum Speichern eineshergestellten Lösung bei 4 ° C für bis zu einer Woche.
- Machen den SPE-Säule Lösung (alle v / v%): 16% Ethylendimethacrylat, 24% Butylmethacrylat, 42% 1-Dodecanol, 18% Cyclohexanol und fügen 1% 2-Dimethylamino-4-(methyl-phenylamino)-phenol Als der Photoinitiator.
- Nehmen Sie das gleiche Volumen von Silica-Mikrokugeln Lösung als SPE-Säule-Lösung (eine 1:1-Mischung zu machen), und vollständig trocknen bei 70 ° C über Nacht in einem Vakuumofen. Break up das Pellet durch Klopfen auf den Schlauch mit dem Deckel verschlossen. Fügen Sie die SPE-Säule Lösung in die getrocknete Kieselsäure Mikrosphären Rohr und Vortex mischen.
- Legen Sie 4 ul der SPE-Lösung in den gleichen Kanal und dann vernetzen sie durch UV-Bestrahlung für 2,5 min. Dann drehen Sie den Chip über und bestrahlen für weitere 2,5 min. Das polymerisierte SPE-Säule sollte eine undurchsichtige weiße Feststoff sein.
- Waschen Sie den Kanal mit 500 ul 100% Methanol zu spülen, das überschüssige Reaktanten. Dieser Waschvorgang entfernt auch intra-Polymer-porogenic Lösungsmittel, wodurch die offene Porenstruktur des SPE-Säule, wenn unter Umgebungsbedingungen getrocknet wird.
- Befestigen zwei Dünnfilmerhitzer zur Unterseite des Chips mit wärmeleitfähigen Band. Die Seiten der Heizungen müssen mit dem Rand der breiten Kanäle für die Denaturierung und Annealing getrennt (siehe Abbildung 1) ausgerichtet werden.
- Platz fünf Thermoelemente in den Chip über den Toten endete offenen Seite Kanäle jeder Chip (siehe Abbildung 2b). Die Thermoelemente Aufenthalt in diesen Kanälen via Presspassung. Band wurde zur weiteren beheben Sie den Speicherort von Thermoelementen.
2. Solid Phase Extraction Method
- Bereiten Sie 96 ul 70% Ethanol mit DEPC-behandeltem und autoklaviert Wasser (deionisiertes oder Millipore-gefiltert).
- Add 4 ul 25X RNA Sichern auf 96 ul 70% Ethanol in ein Rohr, und duplizieren Sie die gleiche Mischung mit 100% Ethanol in einem separaten Röhrchen.
- Bereiten 300ul von Kanal-Puffer durch Mischen der folgenden: 75 ul 6 M Guanidin Thiocyanat (GuSCN), 150 &mgr; l 2-Propanol, 63 ul von Nuklease freiem Wasser und 12 ul 25X RNA Secure.
- Bereiten 312 ul Lysepuffer durch Mischen: 100 ul von 6 M GuSCN, 200 &mgr; l 2-Propanol und 12 ul 25X RNA Secure.
- Erwärmen der 70% Ethanol, 100% Ethanol, Kanalpuffer und Lyse Puffer bei 60 ° C für 10-20 min, um die RNA Sichere aktivieren.
- Um den Mikrofluidkanal äquilibrieren, führen Kanalpuffer durch den SPE-Kanal bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 ml / Std.
- Quick-tauen die Probe im VTM bei 37 ° C im Wasserbad, und entfernen Sie die Probe sofort aus dem Wasserbad sobald es aufgetaut ist.
- Zentrifuge Probe bei 13.000 rpm für 10 min und transferieren Sie 100 ul des Überstandes in 300 ul Lysepuffer. Füllen Sie die Mischung durch Zugabe von 6 ul 1 ug / ul Träger RNA.
- Vortex zu mischen, und nach Spin für5 sec, laden Sie das gesamte Lysat in einem Luer-lok 1 cc Spritze.
- Ausführen durch den SPE-Kanal bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 Lysat ml / Std.
- Waschen Sie die SPE-Kanal mit 100 ul 70% Ethanol und 100 ul OF100% Ethanol bei 1 ml / hr gefolgt. (Es gibt eine 50 ul Totvolumen in der Spitze der Spritze, die nicht aus wird geschoben bekommen, also eigentlich nur 50 ul wird durch den Kanal gehen.)
- Positionieren Sie eine leere Spritze in der 0,5 ml-Markierung und drücken Sie Luft durch den Kanal, um sie bei 1 trocknen ml / hr.
- Führen 67,5 ul Nuklease-freiem Wasser durch den Kanal, um die gebundenen Nukleinsäuren bei 0,5 eluieren ml / h, und sammeln 13,5 ul aus dem nanoport am Abfall-Port. (Der Fluidverlust ist auf die 54 ul Totvolumen in der Spritzenspitze und dem SPE Kanal.)
3. RT-PCR
- Bereiten 36,5 ul des RT-PCR-Master-Mix in der Luft trocknen Schritt (2,12) mit den Reagenzien in einem Qiagen OneStep RT-PCR-Kits.
- Legen RT-PCR Reagenz in der nanoport am Abfall-Port, und mischen sich mit RNA, die folgenden 50 ul RT-PCR-Reaktion erhalten: 13,5 ul eluierten RNA in Nuklease freiem Wasser, 4 ul RT-PCR Enzym-Mix, 10 ul Q-Lösung, 10 μl1X ein Schritt-Puffer, 2 ul 25 mM MgCl 2, 1 ul 50 uM Vorwärtsprimer 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 ', 1 ul 50 uM Rückwärtsprimer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 ul dNTP, 0,75 ul 1,0% w / v BSA, 0,73 und 5,02 ul PEG8000 ul Nuklease freiem Wasser.
- Legen des RT-PCR-Mischung in die RT-Kanal durch leichtes Vakuum (verwendeten wir die Wand Vakuum) und Abdichtung des Nanoport mit einer geschlossenen Armatur.
- Übernehmen 35 V Heizung 1. Halten der Reagenzien in der RT-Kanal für 30 min nach der Heizer 1 äquilibriert bei 50 ° C. Bewahren Sie die Reagenzien im RT-Kanal für 15 min nach der Heizung 1 äquilibriert bei 95 ° C.
- Übernehmen 27 V Heizung 1 und 50 V am Heizgerät 2, etwa drei Minuten oder bis Heizung 1 äquilibriert warten bei 60 & deg, C und Heizer 2 äquilibriert bei 95 ° C.
- Schieben Sie die Reagenzien in die PCR-Kanal bei 0,5 ul / min. Es dauert etwa 20 min für die Reagenzien durch die Serpentinen Kanal fließen.
- Da die Probe ermöglicht es dem Ende der Serpentinenkanal, sammeln die PCR-Produkte am Austritt unter Verwendung eines entsprechend dimensionierten Pipette und Spitze.
4. PCR Produkte Detektion
- Wir verwenden ein Agilent High Sensitivity DNA-Test, um die Produkte zu erkennen. So führen Sie diesen Test nehmen Sie die Agilent High Sensitivity DNA Kit aus dem Kühlschrank 30 min vor dem Test.
- Schalten Sie den Bioanalyzer und öffnen Sie die 2100 Expert Software.
- Legen Sie die 1 ul der PCR-Produkte in der Erprobung und folgen Sie den Agilent-Protokoll ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
- Analysieren und die Daten aufzuzeichnen.
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Representative Results
Ein typisches Ergebnis ist in Abbildung 3 für eine Influenza A infizierten Nasen-Rachen-wash Probe gezeigt. Aufgrund der unterschiedlichen Mengen von Influenza-Virus in jeder Patientenprobe, wird die Endkonzentration des PCR-Produkts variieren. Ein gutes Ergebnis sollte geräuscharm, zwei klare ladder Gipfel (35 und 10380 bp) und ein einzelnes Produkt Peak bei der entworfenen Produkt-Größe (107 bp) für die positive Probe. Während das Produkt Peak theoretisch sollte für negative Kontrollen fehlen, haben wir beobachten, falsche PCR Gipfel in der Nähe der Grippe-spezifischen Locus aus Primer-Dimeren Bildung in einigen Proben. Mehrere Produktpeaks reflektieren mögliche Kontamination des Tests. Wenn dies der Fall ist, sollte ein anderes Aliquot der Probe erneut getestet werden. Gel-Elektrophorese zur weiteren Überprüfung der Testergebnisse 13 verwendet werden.
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Abbildung 1. Vereinfachte top down-Chip schematisch. Die roten Linien zeigen die Platzierung der Kontakt Heizungen auf der Unterseite des Chips.
Abbildung 2. Die mikrofluidischen Assay Flow 13. (A) Bild von zwei mikrofluidischen Chips mit angehängten Dünnschichtheizelemente und zwei Barrel Spritzenpumpe. Glasspritzen wurden zu jedem Chip mit flexiblen Schlauch an Reagenzien und Proben zu laden verbunden. Drei Ports wurden an den Einlässen der SPE-Kanal und der Waste-Port, und der Auslass des Kanals geklebt PCR (b) Kanal Design mit drei Abschnitten:. Probenvorbereitung (SPE), RT Kammer und kontinuierlichen Fluss PCR Kanal. Zwei feste Widerstandsheizungen über angebracht Thermoband zur Unterseite des Chips. Fluidstrom zwischen den Kanälen war laminaren und Änderungen der Fluidwiderstand zur ventillosen Betrieb erlaubt. Die Tiefe beträgt 500 um für die SPE und RT-Kanäle, und die PCR-Kanal ist 100 um tief. Die Breiten sind 500 um für die SPE-Säule, 1 mm für die RT Kammer und variieren von 200 bis 400 um zu den breiten und schmalen Abschnitten der kontinuierlichen PCR Kanal. Der Chip ist 70 mm Länge, 25 mm Breite und 1,4 mm in der Höhe. (C) Mikrofluidische Assay Prozessablauf. Der Nasen-Rachen-Probe mit Lysepuffer, angewandt auf dem Chip gemischt wird, wird der Chip laufen, und die PCR-Produkte werden gelesen, wobei eine kommerzielle Kapillarelektrophorese-Chip. 13 Klicken Sie hier, um größere Zahl anzuzeigen .
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Abbildung 3. On-Chip Endpunkt diagnostische Ergebnis. Das PCR-Produkt Peak ist der mittlere Peak in der Größe von 107 bp. Left (35 bp) und rechts Gipfel (10380 bp) sind die Kontrolle ladder Gipfel. Die Konzentration der Produkte eines jeden Peaks ist die Fläche unter der Kurve. Diese werden tabellarisch dargestellt. (A) positives Ergebnis ohne Lärm Höhepunkt. (B) positives Ergebnis mit Primer-Dimeren bei 42 bp. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Die diagnostische hier vorgestellte Methode demonstriert die Fähigkeit eines integrierten mikrofluidischen Chip aus Kunststoff mit Influenza A RNA aus Patientenproben mit hoher Spezifität und eine niedrige Nachweisgrenze zu verstärken 13 Wir haben diesen Chip für potenzielle point of care testing:. (A) die Temperatur und Fluidik Steuerung vereinfacht wurden, (b) der Chip ist kostengünstig und eignet sich für einen hohen Durchsatz Herstellung im Spritzgussverfahren, und (c) der Chip ist ein Einwegartikel und beabsichtigte für den einmaligen Gebrauch, wodurch das Anliegen der Probe Kreuzkontamination.
Obwohl unsere aktuellen On-Chip-Laufzeit von 3 Stunden, enthält unsere Extraktion Plattform genügend Raum für die Prozessoptimierung. Zum Beispiel könnte die Wasch-und Trocknungszeiten rechts vor Elution durch eine Kombination der Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit und der Verringerung der Waschvolumina reduziert werden. Darüber hinaus können Kosten durch die Straffung der Chipherstellung Prozess und Austausch teuer oder umständlich peri getrimmt werdenpherals, wie die Spritzenpumpen, Stromversorgung, die mit Alternativen wie Einwegspritze Infusionspumpen und kleinen Akkus Öffnung der festen Phase Extraktionskolonne Geometrie und Porosität wird eine erhebliche Reduzierung der Pumpe Anforderungen ermöglichen. Auch, wenn der Chip-Design standardisiert für Großserienfertigung ist, werden viele der Thermoelemente in Geräteentwicklung verwendet eliminiert werden.
Um so mehr, als andere Faktoren, die Robustheit unserer On-Chip-Influenza Detektionsmodul sowohl gute Temperaturkontrolle und geeignete Probe Übergabe abhängt. Leichten Versatz von der gewünschten Temperatur auf dem Chip sowie unbeabsichtigte mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen des Influenza Probe konnte sowohl reduzieren die endgültige PCR Ausbeute. Abgesehen von diesen Faktoren können die Schwankungen in unserem On-Chip-PCR-Ergebnisse 13 aus verschiedenen Patientenproben auch zugeschrieben werden: Variation der Viruslast verschiedenen Ebenen von kontaminierenden menschlichen Zellen und blood; die Anwesenheit von PCR-Inhibitoren nach Nukleinsäure-Extraktion, 14,15 und unerwartete chemische und / oder physikalische Reaktionen zwischen den Proben und den Testreagenzien oder das Gerät selbst 16.
Zusammenfassend haben wir die Durchführbarkeit der Mikrofluidik-Chip, RNA aus den Influenza-A-Virus in medizinisch relevanten Proben nasopharyngealen amplifizieren demonstriert. Der Chip hat das Potential, mit anderen DNA oder RNA-Targets aufgebracht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) grant R01 EB008268 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
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