Summary
En integrert microfluidic termoplastisk chip har blitt utviklet for bruk som en molekylær diagnostisk. Brikken utfører nukleinsyre utvinning, revers transkriptase, og PCR. Metoder for fremstilling og drift av brikken er beskrevet.
Abstract
Rask og effektiv diagnostikk spiller en viktig rolle i å kontrollere smittsomme sykdommer ved at effektiv pasientbehandling og behandling. Her presenterer vi en integrert microfluidic termoplast chip med evnen til å forsterke influensa A virus i pasientens nasofaryngeale (NP) kompresser og aspirates. Etter lasting pasientprøven bærer microfluidic enhet sekvensielt ut on-chip cellelyse, RNA rensing og konsentrering innenfor fastfase ekstraksjon (SPE), revers transkripsjon (RT) og polymerasekjedereaksjon (PCR) i RT-PCR kamre, henholdsvis. Endepunkt deteksjon er utført ved hjelp av en off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For eksterne enheter, brukte vi en enkelt sprøyte pumpe til å drive reagens og prøver, mens to tynne film ovner ble brukt som varmekilder for RT og PCR kamre. Brikken er designet for å være enkelt lag og egnet for høy gjennomstrømning industrien for å redusere fabricatipå tid og kostnad. Microfluidic chip gir en plattform for å analysere en rekke virus og bakterier, bare begrenset av endringer i reagens motivet nødvendig for å oppdage nye patogener av interesse.
Introduction
Millioner av dødsfall har blitt rapportert i løpet av tre influensapandemier i det 20. århundre en. Videre ble den siste influensa pandemi erklært av Verdens helseorganisasjon (WHO) 2 i 2009, og per 1. august 2010, ble 18 449 dødsfall rapportert av WHO 3. Denne pandemien demonstrert igjen høye byrden av smittsomme sykdommer, og behovet for hurtig og nøyaktig påvisning av influensa til aktivere raskt sykdom bekreftelse, hensiktsmessig folkehelseinnsats og effektiv behandling 4.
Det er flere metoder brukte for diagnostisering influensa, disse inkluderer raske immunologiske, direkte fluorescerende antigen testing (DFA) og viral kultur metoder. Rapid immunoanalyser dramatisk mangler sensitivitet 5-8, mens de andre to metoder er arbeidskrevende og tidkrevende 9. Molekylære tester tilbyr flere fordeler, blant annet en kort turn-around tid, høy SensITivity, og høyere spesifisitet. Flere kommersielle enheter har jobbet mot raske molekylære tester (også kalt nukleinsyre tester eller NATer) for smittsomme sykdommer, og flere har influensa analyser i sine rørledninger. Men de fleste av dem krever off-chip prøveopparbeidelse. Ingen av de Clinical Laboratory Improvement Endringer (CLIA) fravikes molekylære tester innlemme prøveopparbeidelse i analysen kassett eller modul.
Lab-on-a-chip-teknologi spiller en viktig rolle i utviklingen av point-of-care testing enheter. Etter innføringen av den første PCR-brikken i 1993 10, har mange forsøk blitt satt inn utvikle nukleinsyre test chips. Men bare et fåtall av disse har integrert råolje prøveopparbeidelse med nedstrøms forsterkning.
Vi har tidligere demonstrert miniatyrisering av en fast fase ekstraksjon kolonne (SPE) inn i en plast microfluidic chip 11 og utviklerment og optimalisering av en kontinuerlig flyt PCR chip 12. Her utvider vi tidligere arbeid for å integrere SPE med RT og PCR skritt inn i en enkelt brikke for klinisk diagnostikk og demonstrere sin evne til å forsterke nukleinsyrer fra pasientens nasofaryngeale (NP) kompresser og aspirates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip Fabrication 12
- Lag to plakk fra Zeonex 690R pellets: distribuere 8-9 gram Zeonex pellets jevnt i sentrum av en metallplate, forvarme på den oppvarmede presse ved 198 ° C i 5 min, og deretter påføre trykk langsomt til 2500 psi for en annen 5 min. For å fullføre dette trinnet, brukte vi en Carver varmpresset.
- Emboss microfluidic kanal i plakett med en epoxy mold. Detaljer på mold fabrikasjon er beskrevet andre steder 12 (kanal motivet i figur 2b): sette en plakk på epoxy mold, forvarme dem på den oppvarmede presse ved 157 ° C i 10 min og deretter bruke trykket sakte til 1000 psi for en annen 10 min . Fjerne plakk fra formen for hånd eller ved hjelp av en tang før den kjøler ned. (Merk: Bruk termiske hansker under dette trinnet.)
- Bore hull i det pregede chip ved innløpet, avfall port, og utløpet av den microfluidic kanalen. Vi brukte en 1,25 mm diamevige boret for å gjøre de tre hullene.
- Binde pregede chip med annen plakk (på toppen): Vask chips med IPA, RNase Borte og deionisert vann i rekkefølge, Lufttørk og forvarme dem på den oppvarmede presse ved 131 ° C i 10 min og deretter trykk ved 350 psi for en annen 10 min.
- Fest Nanoports ved innløpet, avfall, og utløpsporter separat ved hjelp JB Weld Epoxy, kur i 15 til 24 timer i henhold til produsentens instruksjoner.
- Skyll SPE kanal med 50 ul RNase Borte, fulgt med 100 ul nuklease fritt vann.
- Last SPE kanalen med 4 pl av pode oppløsningen (metylmetakrylat med 3% vekt / volum benzofenon) og deretter tverrbinde den metakrylat ved inkubering i 10 min i en UV-ovn under 365 nm UV-bølgelengde og 2000 mJ / cm 2. Fjerne rester pode løsning med vakuum. Vi brukte veggen vakuum. For best resultat, bør en ny løsning brukes. Det er vanligvis akseptable, men, for å lagre etfremstilte løsning ved 4 ° C i opp til en uke.
- Gjør SPE kolonne løsning (alle v / v%): 16% etylen dimetakrylat, 24% butylmetakrylat, 42% 1-dodekanol, 18% cykloheksanol, og tilsett 1% 2-dimetylamino-4-(metyl-fenylamino)-fenol som foto-initiator.
- Ta ut det samme volumet av silisiumoksyd mikrosfærer løsning som SPE kolonne løsning (for å lage en 1:1-blanding), og helt tørre det ved 70 ° C over natten i en vakuumovn. Bryte opp pellet ved å trykke på røret med lokket lukket. Legg SPE kolonne løsning i tørket silica mikrokule og vortex å blande.
- Last 4 pl av SPE løsningen inn i samme kanal, og deretter tverrbinde den ved UV bestråling i 2,5 min. Deretter snu brikken over og strålebehandling for en annen 2,5 min. Det polymeriserte SPE kolonnen skal være en ugjennomsiktig hvit faststoff.
- Vask kanalen med 500 pl 100% metanol for å skylle vekk overflødig reaktanter. Dette vask fjerner også intra-polymer porogenic løsemidler, og dermed skape åpen porestruktur av SPE kolonne når tørket i omgivelsesforholdene.
- Feste to tynn-film varmeovner til bunnen av brikken med termisk ledende tape. Sidene av varmeovner må være innrettet med kanten av de brede kanaler for denaturering og annealing separat (se figur 1).
- Plass fem termoelementer i brikken gjennom de døde endte åpne sidekanaler av hver chip (se figur 2b). De termoelementer bo i disse kanalene via presspasning. Tape ble brukt til ytterligere fikse plasseringen av termoelementer.
2. Solid Phase Extraction Method
- Forbered 96 ul 70% etanol med DEPC-behandlet og autoklaveres vann (deionisert eller Millipore-filtrert).
- Tilsett 4 pl 25x RNA Skaff til 96 ul av 70% etanol i en tube, og duplisere den samme blanding med 100% etanol i et separat rør.
- Forbered 300ul kanalbufferen ved å blande følgende: 75 ul 6 M guanidin tiocyanat (GuSCN), 150 pl av 2-propanol, 63 ul nuklease fritt vann, og 12 pl av 25x RNA Secure.
- Forbered 312 pl lysebuffer ved blanding: 100 ul av 6 M GuSCN, 200 ul 2-propanol, og 12 ul 25X RNA Secure.
- Varm 70% etanol, 100% etanol, kanalbufferen og lysering buffere ved 60 ° C i 10-20 min for å aktivere RNA Secure.
- Ekvilibrere microfluidic kanalen, kjøre kanalbufferen gjennom SPE kanal ved en strømningshastighet på 0,8 ml / time.
- Hurtig-tine testprøven i VTM ved 37 ° C i vannbad, og fjern prøven umiddelbart fra vannbad så snart den er tint.
- Sentrifuger prøve ved 13.000 rpm i 10 min, og overfør 100 pl av supernatanten i 300 pl av lyseringsbuffer. Fullfører blandingen ved tilsetning 6 pl av 1 ug / ul carrier RNA.
- Vortex å blande, og etter spin for5 sek, legger hele lysatet inn en Luer-lok 1 cc sprøyte.
- Kjør lysatet gjennom SPE kanal ved en strømningshastighet på 0,8 ml / time.
- Vask SPE kanalen med 100 pl 70% etanol, etterfulgt av 100 ul of100% etanol ved 1 ml / time. (Det er en 50 ul dødvolum i sprøytespissen som ikke vil bli presset ut, slik at faktisk bare 50 ul går gjennom kanalen.)
- Plasser en tom sprøyte på 0,5 ml-merket og skyv luft gjennom kanalen for å tørke den i 1 ml / time.
- Run 67,5 ul nuklease-fritt vann gjennom kanalen for å eluere de bundne nukleinsyrer ved 0,5 ml / time, og samle 13,5 pl fra den nanoport ved avfallet porten. (The væsketap skyldes 54 pl dødvolum i sprøytespissen og SPE kanalen.)
3. RT-PCR
- Forbered 36,5 ul av RT-PCR konsentrat-blanding under den lufttørke trinn (2,12) ved hjelp av reagensene i en Qiagen OneStep RT-PCR-sett.
- Last RT-PCR reagens i nanoport ved avfallet porten, og bland med RNA for å få følgende 50 ul RT-PCR-reaksjon: 13,5 ul eluerte RNA i nuklease fritt vann, 4 pl RT-PCR enzym mix, 10 pl Q løsning 10 μl1X en trinn buffer, 2 pl 25 mM MgCl 2, 1 pl 50 uM forover primer 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 ', 1 pl 50 pM omvendt primer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 pl dNTP, 0,75 pl 1,0% w / v BSA, 0,73 PEG8000 pl og 5,02 pl nuklease fritt vann.
- Laste RT-PCR blandingen i RT-kanalen ved forsiktig vakuum (vi brukte veggen vakuum) og forsegle Nanoport med en lukket montering.
- Påfør 35 V til varmeren 1. Oppbevar reagensene i RT kanalen for 30 minutter etter varmeren 1 equilibrates ved 50 ° C. Oppbevar reagensene i RT kanalen for 15 minutter etter varmeren 1 equilibrates ved 95 ° C.
- Påfør 27 V til varmeapparat 1 og 50 V til varmeapparat 2, vent omtrent tre minutter eller til varmeapparatet en equilibrates på 60 & deg, C og varmeapparatet 2 equilibrates ved 95 ° C.
- Skyv reagensene inn PCR kanal på 0,5 ul / min. Det tar omkring 20 minutter for reagensene til å strømme gjennom serpentin kanalen.
- Idet prøven gjør det til slutten av serpentin kanalen, samle de PCR-produkter ved utløpet ved hjelp av en passende størrelse pipetten og tips.
4. PCR Produkter Detection
- Vi bruker en Agilent Høy følsomhet DNA test for å oppdage produktene. Å kjøre denne testen ta ut Agilent Høy følsomhet DNA Kit fra kjøleskapet 30 min før testing.
- Slå på Bioanalyzer og åpne 2100 Expert programvare.
- Laste en ul av PCR produktene inn i testing og følg Agilent protokollen ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
- Analyser og registrere data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et typisk resultat er vist i figur 3 for et influensa A infisert nasofaryngeal vask prøven. På grunn av de forskjellige mengder av influensavirus i hver pasientprøve, vil den endelige konsentrasjonen av PCR-produkt variere. Et godt resultat bør ha lav støy, to klare stige toppene (35 og 10 380 bp) og et enkelt produkt topp på designet produkt størrelse (107 bp) for den positive prøven. Mens produktet peak bør teoretisk være fraværende for negative kontroller, gjorde vi observerer falske PCR topper i nærheten influensa-spesifikke locus fra primer-dimer dannelse i enkelte prøver. Flere produkt topper reflekterer potensiell forurensning av testen. Hvis dette skjer, bør en annen porsjon av prøven testes på nytt. Gelelektroforese kan brukes for ytterligere verifikasjon av testresultatene 13.
i "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Forenklet topp ned chip skjematisk. De røde skisserer viser plasseringen av kontaktstengene varmeovner på bunnen av brikken.
Figur 2. Microfluidic analysen flyt 13. (A) Bilde av to microfluidic chips med vedlagte tynnfilm varmeovner og to fat sprøytepumpe. Glassprøyter ble koblet til hver brikke med fleksibel slange å laste reagenser og prøver. Tre porter ble limt på inntakene av SPE kanalen og avfallet port, og utløpet av PCR kanal (b) kanaler med tre seksjoner:. Prøvepreparering (SPE), RT kammer og kontinuerlig strømning PCR kanal. To faste motstand varmeovner er festet via termisk tape til bunnen av brikken. Fluidstrøm mellom kanalene var laminær, og endringer i væskemotstand tillatt for ventil-mindre operasjon. Dybden er 500 mikrometer for SPE og RT-kanaler, og PCR-kanalen er 100 mikrometer dyp. Breddene er 500 mikrometer for SPE kolonne, 1 mm for RT kammer, og varierer 200-400 mikrometer for de brede og smale deler av den kontinuerlige strømmen PCR kanal. Brikken er 70 mm i lengde, 25 mm i bredden og 1,4 mm i høyde. (C) Microfluidic assay prosessflyten. Den nasopharyngeal prøven blandes med lyseringsbuffer, anvendt til chip, chip kjøre, og PCR-produkter leses ved hjelp av en kommersiell kapillær elektroforese chip. 13 Klikk her for å se større figur .
n "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig3highres.jpg "/>
Figur 3. På chip sluttpunkt diagnostisk resultat. PCR-produktet topp er midterste peak på størrelsen av 107 bp. Venstre (35 bp) og høyre toppene (10380 bp) er kontroll stigen toppene. Konsentrasjonen av produktene av hver topp er området under kurven. Disse er ordnet. (A) positivt resultat uten støy peak. (B) positivt resultat med primer-dimer på 42 bp. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den diagnostiske metoden presentert her demonstrert evnen til en integrert microfluidic plastbrikke å forsterke influensa A RNA fra pasientprøver med høy spesifisitet og en lav deteksjonsgrense 13 Vi laget denne chip for potensielle pleiestedet testing:. (A) temperatur og fluidic kontroll ble forenklet, (b) brikken er lave kostnader og egnet for høy gjennomstrømning fabrikasjon hjelp sprøytestøping, og (c) brikken er disponibel og beregnet for en gangs bruk, og dermed redusere bekymringen prøven krysskontaminering.
Selv om vår nåværende on-chip runtime av 3 hr, inneholder vår utvinning plattform god plass for prosessoptimalisering. For eksempel, kunne vaske og tørre ganger rett før eluering bli redusert med en kombinasjon av å øke strømningshastigheten og redusere vask volumer. Videre kan kostnadene bli trimmet ved å strømlinjeforme chip fabrikasjon prosessen og erstatte dyre eller tungvint peripherals, for eksempel sprøyte pumper, kraftforsyning, med alternativer som engangssprøyte infusjonspumper og små batteripakker åpne opp fast fase ekstraksjon kolonne geometri og porøsitet vil gi rom for betydelige reduksjoner i pumpen krav. Også, når den chip design er standardisert for høyt volum produksjon, vil mange av de termoelementer som benyttes i enheten utvikling bli eliminert.
Mer enn andre faktorer, avhenger robustheten av vår on-chip influensa deteksjonsmodul på både god temperaturkontroll og riktig prøven overlate. Liten forskjøvet fra den ønskede på brikken temperatur, samt utilsiktede flere fryse-tine sykluser av influensa prøven, kunne både redusere den endelige PCR avkastning. Bortsett fra disse faktorene, kan variasjoner i våre on-chip PCR resultater 13 fra ulike pasientprøver også tilskrives: Variasjon i virusmengde, ulike nivåer av forurensende humane celler og Blood, tilstedeværelse av PCR-inhibitorer etter nukleinsyre ekstraksjon, 14,15 og uventede kjemiske og / eller fysiske reaksjoner mellom prøvene og testen reagenser eller selve enheten 16.
Oppsummert har vi demonstrert muligheten av vår microfluidic chip å forsterke RNA fra influensa A virus i medisinsk-relevante nasofaryngeale prøver. Brikken har potensiale til å bli brukt til andre DNA-eller RNA-mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklært noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
