Summary
Un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico ha sido desarrollado para su uso como un diagnóstico molecular. El chip realiza la extracción de ácido nucleico, la transcriptasa inversa y la PCR. Los métodos para fabricar y ejecutar el chip se describen.
Abstract
Diagnósticos rápidos y eficaces desempeñan un papel importante en el control de enfermedades infecciosas al permitir la gestión eficaz del paciente y el tratamiento. Aquí, se presenta un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico con la capacidad de amplificar el virus en pacientes nasofaríngeas (NP) frotis y aspirados. Después de cargar la muestra del paciente, el dispositivo de microfluidos secuencialmente lleva a cabo en el chip lisis celular, la purificación del ARN y otra de concentración dentro de la extracción en fase sólida (SPE), transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en RT-PCR cámaras, respectivamente. Punto final de la detección se realizó usando un Bioanalyzer fuera de chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Por periféricos, se utilizó una bomba de jeringa de un solo reactivo para conducir y muestras, mientras que dos calentadores de película fina se utilizaron como fuentes de calor para la RT y PCR cámaras. El chip está diseñado para ser de una sola capa y adecuado para la fabricación de alto rendimiento para reducir la fabricatien tiempo y costo. El chip microfluídico proporciona una plataforma para analizar una amplia variedad de virus y bacterias, limitado sólo por cambios en el diseño de reactivos necesarios para detectar nuevos patógenos de interés.
Introduction
Millones de muertes han sido reportadas durante las tres pandemias de influenza en el siglo 20 1. Por otra parte, la pandemia de influenza más reciente fue declarada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), dos en 2009, y el 1 de agosto de 2010, 18.449 muertes fueron reportadas por la OMS 3. Esta pandemia ha demostrado una vez más la elevada carga de enfermedades infecciosas, y la necesidad de una detección rápida y exacta de la gripe a activar la confirmación de la enfermedad rápidamente, la respuesta de salud pública apropiada y un tratamiento efectivo 4.
Hay varios métodos utilizados para el diagnóstico de la gripe, que incluyen inmunoensayos rápidos, pruebas de antígeno fluorescente directa (DFA) y los métodos de cultivo viral. Inmunoensayos rápidos dramáticamente carecen de sensibilidad 5-8, mientras que los otros dos métodos son de trabajo intensivo y requiere mucho tiempo 9. Las pruebas moleculares ofrecen múltiples ventajas, incluyendo un vuelco corto tiempo, Sensit altoividad, y una mayor especificidad. Varias entidades comerciales han estado trabajando para pruebas moleculares rápidas (también llamadas pruebas de ácido nucleico o NAT) para las enfermedades infecciosas, y varios tienen pruebas de influenza en sus tuberías. Sin embargo la mayoría de ellos requieren fuera de chip preparación de la muestra. Ninguna de las Enmiendas de Mejoras de Laboratorio Clínico (CLIA) renunciaron pruebas moleculares incorporar preparación de la muestra en el cartucho de ensayo o módulo.
Lab-on-a-chip desempeña un papel importante en el desarrollo de dispositivos de prueba en el punto de atención. Después de la introducción de la primera chip de PCR en 1993 10, numerosos esfuerzos se han puesto en el desarrollo de chips de prueba de ácidos nucleicos. Sin embargo, sólo unos pocos de estos tienen preparación integrada muestra en bruto con la amplificación aguas abajo.
Hemos demostrado anteriormente la miniaturización de una columna de extracción en fase sólida (SPE) en un chip microfluídico de plástico 11 y desarrollar lación y optimización de un flujo continuo de chip PCR 12. Este sentido, ampliar el trabajo previo para integrar la SPE con RT y PCR medidas en un solo chip para el diagnóstico clínico y demostrar su capacidad para amplificar los ácidos nucleicos de los pacientes nasofaríngeo (NP) hisopados y aspirados.
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Protocol
1. Chip de fabricación 12
- Hacer dos placas de Zeonex 690R gránulos: distribuir 8-9 gramos gránulos Zeonex uniformemente en el centro de una placa de metal, precalentar en la prensa calentada a 198 ° C durante 5 min, y luego aplicar presión lentamente a 2.500 psi durante otros 5 min. Para completar este paso, se utilizó una prensa Carver caliente.
- Graba en relieve el canal microfluídico en la placa con un molde de epoxi. Los detalles sobre la fabricación de moldes se describen en otra parte 12 (diseño de canal en la figura 2b): ponga una placa en el molde de epoxi; precalentarlos en la prensa calentada a 157 ° C durante 10 min y después aplicar presión lentamente a 1.000 psi durante otros 10 min . Retire la placa del molde a mano o con una pinza antes de que se enfríe. (Nota: use guantes térmicos durante este paso.)
- Perforar los agujeros en el chip en relieve en la entrada, el puerto de residuos, y la salida del canal microfluídico. Se utilizó un diámetro de 1,25 mmeternos broca para hacer los tres agujeros.
- Bond el chip en relieve con otra placa (en la parte superior): Lavar las patatas fritas con IPA, RNAse Away y agua desionizada en secuencia; aire seco y precalentar ellos en la prensa calentada a 131 ° C durante 10 min y después se presiona a 350 psi para otro 10 min.
- Adjuntar Nanoports en la entrada, los residuos, y los puertos de salida por separado usando JB Weld Epoxy; curar durante 15 a 24 horas según las instrucciones del fabricante.
- Enjuague el canal SPE con 50 l de RNasa lejos, seguidos con 100 ml de agua libre de nucleasas.
- Cargar el canal SPE con 4 l de la solución de injerto (metacrilato de metilo con 3% w / v benzofenona) y luego reticular el metacrilato por incubación durante 10 min en un horno de radiación UV, en longitud de onda 365 nm UV y 2.000 2 mJ / cm. Retire la solución residual injerto con vacío. Se utilizó el vacío de la pared. Para obtener los mejores resultados, una solución fresca se debe utilizar. Por lo general es aceptable, sin embargo, para almacenar unsolución preparada a 4 ° C durante hasta una semana.
- Hacer la solución columna SPE (todos los% v / v): 16% dimetacrilato de etileno, 24% de metacrilato de butilo, 42% de 1-dodecanol, 18% de ciclohexanol, y añadir 1% de 2-dimetilamino-4-(metil-fenilamino)-fenol como el foto-iniciador.
- Sacar el mismo volumen de solución de sílice como microesferas de la solución columna SPE (para hacer una mezcla 1:1), y que se seque completamente a 70 ° C durante la noche en un horno de vacío. Romper la pastilla tocando en el tubo con la tapa cerrada. Añadir la solución de la columna SPE en el tubo de sílice de microesferas secas y vortex para mezclar.
- Carga 4 l de la solución SPE en el mismo canal y después reticular por irradiación UV durante 2,5 min. A continuación, darle la vuelta al chip de una y otra para irradiar min 2,5. La columna SPE polimerizado debería ser un sólido de color blanco opaco.
- Lavar el canal con 500 l de metanol al 100% para enjuagar el exceso de reactivos. Este lavado también elimina intra-po polímerodisolventes rogenic, creando así la estructura de poro abierto de la columna SPE cuando se seca en condiciones ambientales.
- Acople dos calentadores de película delgada a la parte inferior del chip con cinta térmicamente conductor. Los lados de los calentadores deben estar alineadas con el borde de los canales anchos para la desnaturalización y el recocido por separado (véase la Figura 1).
- Coloque cinco termopares en el chip a través de los muertos terminó abiertos los canales laterales de cada chip (véase la Figura 2b). Los termopares permanecer en estos canales mediante ajuste a presión. Cinta se utiliza para fijar aún más la ubicación de los termopares.
2. Método de extracción en fase sólida
- Preparar 96 l de etanol al 70% con agua tratada con DEPC y se autoclave (Millipore filtrada desionizada o-).
- Añadir 4 l de 25X ARN Asegure a 96 l de 70% de etanol en un tubo, y duplicar la misma mezcla con 100% de etanol en un tubo separado.
- Preparar 300l de tampón canal mezclando los siguientes: 75 l de 6 M de tiocianato de guanidina (GuSCN), 150 l de 2-propanol, 63 l de agua libre de nucleasa, y 12 l de ARN Aseguren 25X.
- Preparar 312 l de tampón de lisis mediante la mezcla: 100 l de 6 M de GuSCN, 200 l de 2-propanol, y 12 mu l de ARN Aseguren 25X.
- Calentar el etanol al 70%, etanol al 100%, tampón de canal y tampones de lisis a 60 º C durante 10-20 min para activar el seguro de ARN.
- Para equilibrar el canal microfluídico, ejecute el buffer del canal a través del canal de SPE a un caudal de 0,8 ml / hr.
- Rápida y descongelar la muestra en VTM a 37 ° C en baño de agua y retire inmediatamente la muestra del baño de agua tan pronto como se descongela.
- Se centrifuga la muestra a 13.000 rpm durante 10 min, y transferir 100 l del sobrenadante en 300 l de tampón de lisis. Completar la mezcla mediante la adición de 6 l de 1 mg / ARN mu l portadoras.
- Vortex para mezclar, y después de centrifugado5 segundos, cargue el lisado completo en una jeringa Luer-lok cc 1.
- Ejecutar el lisado a través del canal de SPE a un caudal de 0,8 ml / hr.
- Lavar el canal de SPE con 100 l de etanol al 70%, seguido por 100 l de etanol of100% a 1 ml / hr. (Hay un volumen de 50 l muertos en la punta de la jeringa que no será expulsado, por lo que en realidad sólo 50 l pasa por el canal.)
- Coloque una jeringa vacía en la marca de 0,5 ml y empujar el aire a través del canal para que se seque a 1 ml / hr.
- Ejecutar 67,5 l de agua libre de nucleasa a través del canal para eluir los ácidos nucleicos unidos a 0,5 ml / hr, y recoger 13,5 l de la NanoPort en el puerto de residuos. (La pérdida de fluido se debe al volumen de 54 l muerto en la punta de la jeringa y el canal de SPE.)
3. RT-PCR
- Preparar 36,5 l de la mezcla de RT-PCR maestro durante el paso de aire seco (2,12) utilizando los reactivos en un Qiagen OneStep RT-PCR kits.
- Cargar RT-PCR reactivo en la NanoPort en el puerto de residuos, y se mezcla con el ARN para obtener el siguiente 50 l de reacción RT-PCR: 13,5 mu l de ARN se eluyó en agua libre de nucleasa, 4 l de RT-PCR de mezcla de enzimas, 10 l solución Q, 10 μl1X uno tope graduado, 2 l 25 mM MgCl 2, 1 uL 50 mM adelante primer 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA 'C-3, 1 l 50 mM primers revertir 5'-AGG ACG TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 l dNTP, 0,75 l 1,0% w / v de BSA, 0,73 l PEG8000 y 5,02 l de agua libre de nucleasas.
- Cargar la mezcla de RT-PCR en el canal RT por vacío suave (se utilizó el vacío de la pared) y sellar la NanoPort con un accesorio cerrado.
- Aplicar 35 V al calentador 1. Mantener los reactivos en el canal TA durante 30 min después del calentador 1 se equilibra a 50 º C. Mantener los reactivos en el canal TA durante 15 min después del calentador 1 se equilibra a 95 º C.
- Aplicar 27 V al calentador 1 y 50 V al calentador 2, esperar alrededor de tres minutos o hasta que el calentador 1 se equilibra a 60 y deg; C y el calentador 2 se equilibra a 95 º C.
- Empuje los reactivos en el canal de PCR a 0,5 l / min. Se debe tomar alrededor de 20 min para los reactivos fluyan a través del canal de serpentina.
- Cuando la muestra llega a la final del canal de serpentina, recoger los productos de PCR en la toma de corriente mediante una pipeta y la punta de tamaño apropiado.
4. Productos de detección de PCR
- Usamos un Agilent DNA de prueba de alta sensibilidad para detectar los productos. Para ejecutar esta prueba saque el kit de ADN Agilent alta sensibilidad del refrigerador 30 minutos antes de la prueba.
- Encienda el Bioanalyzer y abra el software Expert 2100.
- Cargar el 1 l de los productos de PCR en la prueba y siga el protocolo de Agilent ( 20Manual.pdf http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% ).
- Analizar y registrar los datos.
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Representative Results
Un resultado típico se muestra en la Figura 3 para una gripe A muestra infectada lavado nasofaríngeo. Debido a las diferentes cantidades de virus de la gripe en cada muestra de paciente, la concentración final del producto de PCR puede variar. Un buen resultado debe tener bajo nivel de ruido, dos picos claros de escalera (35 y 10380 pb) y un pico de producto único en el tamaño del producto diseñado (107 pb) para la muestra positiva. Mientras que el pico del producto teóricamente debería estar ausente en los controles negativos, observamos picos espurios cerca de PCR del locus específico de la gripe-primer dímeros de formación en algunas muestras. Múltiples picos de productos reflejan la posible contaminación de la prueba. Si esto ocurre, otra alícuota de la muestra debe volver a analizar. La electroforesis en gel puede ser utilizado para la verificación posterior de los resultados de la prueba 13.
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Figura 1. Simplificado de arriba hacia abajo esquemática chip. Las líneas rojas muestran la colocación de los calentadores de contacto en la parte inferior del chip.
Figura 2. El ensayo de flujo microfluídico 13. (A) Imagen de dos chips de microfluidos con adjuntos calentadores de película delgada y de dos cilindros de la bomba de jeringa. Jeringas de vidrio estaban conectados a cada chip con un tubo flexible para cargar los reactivos y muestras. Tres puertos estaban pegados en las entradas de canal de SPE y el puerto de residuos, y la salida del canal de PCR (b) diseño de canal con tres secciones:. Preparación de la muestra (SPE), RT y cámara de flujo continuo PCR canal. Dos calentadores de resistencia fijas están unidas mediante enlaces cinta térmica para la parte inferior del chip. El flujo de fluido entre los canales era laminar, y los cambios en la resistencia del fluido permitida para el funcionamiento sin válvula. La profundidad es de 500 micras para SPE y canales RT, y el canal de PCR es de 100 micras de profundidad. Las anchuras son 500 micras para la columna SPE, de 1 mm para la cámara de RT, y varían desde 200 hasta 400 m para las secciones anchas y estrechas del canal de flujo continuo de PCR. El chip es de 70 mm de longitud, 25 mm de ancho y 1,4 mm de altura. (C) ensayo de Microfluidic flujo del proceso. La muestra nasofaríngea se mezcla con tampón de lisis, se aplica al chip, el chip se ejecuta, y los productos de PCR se leen utilizando un chip comercial electroforesis capilar. 13 Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Figura 3. El resultado chip de punto final de diagnóstico. El pico del producto de PCR es el pico medio en el tamaño de 107 pb. Picos de izquierda (35 pb) y derecho (10380 pb) son los picos de escalera de control. La concentración de los productos de cada pico es el área bajo la curva. Estos son tabulados. (A) sin ningún tipo de resultado positivo pico de ruido. (B) con resultado positivo-primer dímeros en 42 pb. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
El método de diagnóstico presentados aquí demuestran la capacidad de un sistema integrado de chip de plástico microfluídico para amplificar ARN influenza A partir de muestras de pacientes con alta especificidad y un bajo límite de detección 13 Se diseñó este chip para el punto de potencial de las pruebas de atención:. (A) la temperatura y fluídico el control se simplifica, (b) el chip es de bajo costo y adecuadas para la fabricación de alto rendimiento utilizando moldeo por inyección, y (c) el chip es desechable y previsto para un solo uso, reduciendo de este modo la preocupación de contaminación de la muestra transversal.
Aunque nuestro actual tiempo de ejecución en el chip de 3 horas, nuestra plataforma de extracción contiene un amplio margen para la optimización de procesos. Por ejemplo, el lavado y tiempos de secado derecho antes de la elución se podría reducir mediante una combinación de aumento de la velocidad de flujo y la reducción de los volúmenes de lavado. Por otra parte, el costo puede ser recortada por la racionalización del proceso de fabricación de chips y la sustitución de peri caro o complicadopherals, tales como las bombas de jeringa, fuente de alimentación, con alternativas como bombas de jeringa desechables de infusión y los pequeños, la apertura de la batería de extracción de fase sólida geometría de la columna y la porosidad permiten reducciones significativas en los requisitos de la bomba. Además, una vez el diseño del chip está estandarizada para alto volumen de fabricación, muchos de los termopares utilizados en el desarrollo de dispositivos será eliminado.
Más que otros factores, la solidez de nuestro on-chip módulo de detección de la influenza depende tanto de buen control de temperatura y entrega de muestra adecuado. Ligero desplazamiento de la deseada en el chip de temperatura, así como involuntarios múltiples ciclos de congelación-descongelación de la muestra de la influenza, podría reducir el rendimiento final de PCR. Aparte de estos factores, las variaciones en nuestros on-chip de los resultados de PCR de 13 muestras de pacientes diferentes también podría atribuirse a: Variación de la carga viral, los diferentes niveles de contaminación de las células humanas y Blood, la presencia de inhibidores de la PCR después de la extracción de ácido nucleico, 14,15 y no anticipados reacciones químicas y / o físicas entre las muestras y los reactivos de prueba o el propio dispositivo 16.
En resumen, hemos demostrado la viabilidad de nuestro chip microfluídico para amplificar el ARN del virus de influenza A en muestras nasofaríngeas médicamente relevantes. El chip tiene el potencial de ser aplicado a otro ADN o ARN objetivos.
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Disclosures
Los autores han declarado conflictos de intereses financieros.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
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