Summary
Опишем способ целевой препаратов на центральную нервную систему, или имплантации катетера или при выполнении болюсной инъекции в правый латеральный желудочек у мышей. Мы делаем ставку именно на доставке антисмысловых олигонуклеотидов. Этот метод можно легко адаптировать для других препаратов и крыс.
Abstract
В связи с невозможностью пересечь гематоэнцефалический барьер, некоторые препараты должны быть доставлены непосредственно в центральную нервную систему (ЦНС). Наши лаборатории особое внимание уделяется антисмысловых олигонуклеотидов (ССО), хотя методы показано на видео здесь также может быть использован для доставки множество других препаратов для ЦНС. Антисмысловые олигонуклеотиды (ССО) имеют возможность нокдаун последовательности конкретных целей 1, а также сдвиг изоформы соотношения специфических генов 2. Чтобы достичь широкого нокдаун гена или сплайсинг в ЦНС мышей, ССО может быть доставлен в мозг с использованием двух отдельных путей введения, оба из которых мы показали в видео.
Первое применение Alzet осмотические насосы, соединенные с катетером, который имплантируется в боковой желудочек. Это позволяет ASOs быть непрерывную инфузию в ЦНС в течение заданного периода времени. Второй включает в себя единичная инъекция из приветGH концентрацию КРМ в правый латеральный желудочек. Оба метода использовать мышь церебральный желудочковой системы для доставки ASO на весь мозг и спинной мозг, хотя в зависимости от потребностей исследования, один способ может быть более предпочтительным, чем другие.
Introduction
Некоторые наркотики, не могут пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), которым необходим прямой центральной нервной системы (ЦНС) доставки. Чтобы обойти BBB, наркотики могут быть доставлены непосредственно в мозг с использованием описанного метода. В то время как наши лаборатории и бумаги подробные фокус здесь на антисмысловые олигонуклеотиды (ССО), другие препараты, такие как малые молекулы, антитела, векторов генной терапии, и т.д.., Также могут быть доставлены через точно такой же подход.
Некоторые белки играют важную роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. Такие белки часто образуют токсичных видов и накапливаются в агрегаты, что приводит к возможному гибели нейронов и последующего неврологического заболевания 3-4. В попытке замедлить или даже остановить прогрессирование этих заболеваний, один терапевтический вариант может быть нацелены непосредственно и уменьшить причинный белка. Тем не менее, эти белки часто встречаются повсеместно через ЦНС, что затрудняет к электронной ffectively ориентироваться на них в глобальном масштабе.
В целях выявления генов по всей центральной нервной системы, мы управляем ASOs мыши в спинномозговой жидкости (ликвора) через боковой желудочек обойти BBB. Этот конкретный метод принимает преимущество системы мыши желудочка, который омывает весь мозг, спинной мозг, что позволяет широкое распространение ASOs. Мы используем ASOs, которые 18-20 мера РНК-подобные молекулы, которые непосредственно связывать последовательность мРНК-мишени и, в зависимости от модификации ASO химической, либо) набирать РНКазы-H деградировать мРНК приводит к нокдаун или B) сдвиг альтернативного сплайсинга один , 2,16,17. Следует отметить, что несколько молекул существуют для сбивание специфического белка в живом организме, в том числе ShRNA. Так как эти молекулы не являются предметом данной статьи, мы направляем читателя пересмотреть статьи, которые лучше подробно нокдаун механизмы действия и преимущества / недостатки каждого из них 5-6.
jove_content "> В предыдущей работе мы использовали ASOs целевой белок супероксиддисмутазы 1 (SOD1) в трансгенной модели крысы бокового амиотрофического склероза (ALS) +7 (рис. 4). Мутации в СОД1 наблюдается примерно у 2% всех ALS случаев 8, хотя это было недавно предположили, что SOD1 может играть важную роль в спорадических ALS, а 9-10. При уменьшении общей SOD1 уровни у крыс ALS трансгенных, выживание после начала была значительно увеличена 7. Эти важные данные были первыми показать, что лечение ASO в ЦНС может иметь глубокое положительное влияние на неврологическую модель болезни. С тех пор, больным СПИДом, ориентированные на человека СОД1 ввели и успешно завершили Фаза I клинических испытаний человека с минимальными побочными эффектами (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , представленный в 2012 году на 64-й ежегодной Американской Академии Неврологии. планирует переехать ASOs ждем второй этап испытаний в настоящее время в стадии реализации.Во всех этих исследованиях, больным СПИДом были доставлены в боковой желудочек для уменьшения общего уровня гена или изменить сплайсинга гена черезвсей ЦНС. Оба осмотические насосы и одной инъекции болюса может быть использован для доставки ASOs в CSF. Насосы позволяют медленно, непрерывной доставки, в то время как интрацеребровентрикулярный (ICV) болюсной является быстрым, одноразовые инъекции. Мы использовали оба этих метода с успехом, хотя мы не сообщается непосредственное сравнение между насосом и болюса в одном трансгенной линии.
Использование ASOs в ЦНС является эффективным способом уменьшения уровня общего белка и / или изменения сплайсинга несколько белков. Хотя мы используем ASOs исключительно для лечения неврологических расстройств, мы признаем, что в других областях могут также воспользоваться этой техникой. Пока интерес белок экспрессируется в ЦНС и конечной целью является достижение CNS-широкий изменения в экспрессии генов, используя ASOs в продемонстрированы методы могут быть очень полезны.
Protocol
Протокол был ниже одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Университете Вашингтона в Сент-Луисе и в соответствии с Национальным институтом здоровья руководящих принципов для использования подопытных животных. Если это Ваше первое выступление операции, мы рекомендуем посмотреть на Юпитер статью о грызунах операций в качестве введения перед началом 14.
ССО может быть доставлен мыши ЦНС и через осмотическую инфузионный насос и один болюс ICV-инъекции. Из-за этого, процедуру, описанную ниже разбивается на две части. Плюсы и минусы для каждого метода будет затронуто в разделе обсуждения. Координаты, используемые в протоколах для взрослых и C57BL6 B6C3 мышей. Соответствующие координаты крысы можно найти в таблице 1.
ALZET осмотического насоса
1. Подготовка Alzet осмотические насосы
- Лягте стерильные DrapЕ и тщательно падение следующие пункты на него в то время, стараясь не трогать непосредственно для поддержания стерильности: осмотического насоса (ы), поток модулятор (ы), 1 мл стерильного шприца (ы), лезвие скальпеля, и секции труб (1 кусок трубы = 5 насосов). Для мышей, существует три варианта насоса: 14 дней, 28 дней и 42 дней (фиг. 2А).
- Открывать и разливают в стерильные 50 мл конические пробирки с 15-20 мл физиологического раствора. До 6 собранный насосы могут быть добавлены в коническую трубку.
- Заполните p60 чашку Петри со 100% этанола. Добавить соответствующее количество катетеры в этаноле. Для мышей, катетер длиной 2,5 мм.
- Фильтр каждый ASO на столько 1,5 мл пробирки Eppendorf при необходимости. Включите пробирку Эппендорфа заполнена стерильной 0,9% солевой раствор, чтобы заполнить трубопровод с.
- Как только все будет подготовлено, надеть стерильные перчатки. Убедитесь, что ничего не трогать, что не является стерильной. Меняйте перчатки по мере необходимости.
- Для каждого ASO, которые будут использоваться, заполнить шприц емкостью 1 мли loadpumps, поместив иглу в верхнее отверстие и медленно заполнения до избыточного просачивается. Продолжайте, пока все насосы не будут заполнены.
- Открывать поток-модуляторы и вставьте в насосах. Нажмите потока модулятор почти весь путь, оставляя 3-5 мм зазора.
- Используя лезвие скальпеля, разрезать каждый кусок трубы на 5 равных сегментов. Возьмем один кусок трубы, залить стерильного физиологического раствора с использованием 1 мл шприц и вставить в верхней части потока модулятор в один конец трубки. Затем принимают канюли из этанола и соединить его с другим концом трубки. Насос теперь полностью собранном виде.
- Поместите Готовый к подключению насос в стерильную 50 мл коническую трубку с солевым для грунтования. Грунтовки позволяет насосы, чтобы впитать жидкость инициировать доставки лекарственных средств, а также прийти к надлежащей температуре. Грунтовка: 14 день насосов: 4-6 ч, 28 насосов день: 40 часов, 42 насосов день: 60 час. После завершения сборки насосов, шапка конической пробирки и поместите в чистую37 ° С на водяной бане до операции.
2. Предварительно хирургической процедуры
- Протрите все вниз с 70% этанола для стерилизации зоны и уложить их стерильными пеленками на вершине таблицы и stereotax для создания стерильного поля. Важно помнить о стерильное поле на протяжении всего хирургического вмешательства. Включите следующее: шарик стерилизатор, грелку, Света, цифровой индикации и кислорода / Isoflurane системы (рис. 1).
- Следующие детали будут необходимы, если делать либо одно хирургии или целую партию операций, как мы обычно делаем: 1 пара щипцов, изогнутых кровоостанавливающего 1, 1 пара маленькие ножницы, 1 пара маленьких изогнутых затупленной ножницы, 1 крыса кости резак , 1 прямой кровоостанавливающего, нейлоновые швы 5-0, 1 конические пробирки с 70%-ным этанолом, 1 коническую пробирку с 95%-ным этанолом, 1 коническую трубку с йодом, 1 коническую трубку с перекисью водорода, упаковки стерильных ватных тампонов, 1 бутылка супер клей, 1 тюбик мази с антибиотиком, 1 тюбик глазсмазки, и одна электрическая бритва.
- Поместите кончики обе пары ножниц, щипцов, и изогнутые кровоостанавливающего в шарик стерилизатор на 15 сек. Удалите и место в 70% этанола. При выполнении более чем одной операции повторной стерилизации кончиков инструментов между животными.
- Поверните изофлурана до 4% и O 2 до 0,4 л / мин и прямого потока газа в камере. У нас есть изофлурана / кислородная система откалибрована по крайней мере один год, чтобы гарантировать, что мы поставляем необходимое количество анестезии. Мышь помещают в камеру и подождите, пока дыхание значительно замедлился. Снимите мыши и выполнить носок щепотку, чтобы обеспечить мыши полностью бессознательным.
- Бритья волос от верхней части плеча до между глазами. Если мышь начинает просыпаться, наведите курсор обратно в камеру, пока мышь не будет полностью бессознательном возобновится в подтверждение того с ног крайнем случае. Наведите мышь на анестезию stereotax и нажмите на носовой обтекатель на нос.Будьте нежны, как зубы и кости хрупкие.
- Прямая подача газа в stereotax держать мышь под наркозом. Важно время от времени проверять, чтобы убедиться, мыши полностью без сознания с ног щепотку всей операции. Закрепите голову с ухом баров. Мы предпочитаем выравнивания ухо баров, хотя целевой бокового желудочка, совершенно ровной черепа не является необходимым в связи с большим размером желудочка.
- Поверните изофлурана уровне до 2,0% на техническое обслуживание. Dab глазная мазь на каждый глаз. Как видно на видео, заложить стерильной драпировки с помощью мыши, так что только основанием шеи и головы подвергаются. Тогда дезинфекции хирургической области, протирая в верхней части головы и шеи круговыми движениями, начиная с центра выбритый участок и перемещение наружу первым ватным тампоном, смоченным в 95% этанола, а затем ватным тампоном, смоченным в йоде.
- Мы рекомендуем использовать ректального датчика обратной температуры регулируемая система отопления, которая обеспечиваеттемпература мышь остается стабильным 37 ° С. Если температура мыши уменьшается во время операции, после операции восстановления может занять больше времени и в результате переохлаждения может привести к аномальной активности белка, в том числе гиперфосфорилированию ассоциированный с микротрубочками белок Tau 15. После установки системы отопления, теперь вы готовы, чтобы начать операцию.
3. Имплантация Alzet осмотического насоса
- Перед началом операции, надеть новую пару стерильных перчатках. Затем, с помощью пинцета и небольшой ножницами надрезать кожу от основания шеи выше череп животного в между глазами
- Возьмем затупленных ножницы с кривой вверх и скользить под кожу на основании шеи назад по направлению к левой задней конечности. Там не должно быть никакого сопротивления. Если есть, удалите ножницами и повторите попытку. Это формирует подкожный карман для осмотического насоса.
- Wiре черепа чистой стерильным ватным тампоном, а затем ватным тампоном, смоченным в перекиси водорода для повышения темени.
- Протрите 50 мл конические пробирки, содержащие насосы для поддержания стерильности из насосов. Аккуратно выньте насос из конической трубки с помощью изогнутого кровоостанавливающего, особое внимание и заботу, что насос не касается стороны коническую трубку. Держа основании насоса пинцетом и нажать на поток модулятора в остальную часть пути с изогнутой кровоостанавливающего.
- Удерживая насос, где модулятор потока и труб встретиться с изогнутыми кровоостанавливающего. Установите насос под кожей на основании шеи и толкать ее назад к левой задней конечности, насколько она будет идти без сопротивления. Будьте осторожны, чтобы не допустить ничего катетер ощупь.
- С изогнутой кровоостанавливающего, захватите канюли в канавке, где верхняя отвечает пьедестала. Переместить канюли водитель подставку и закрепите на месте.
- Поместите одну каплю супер клей на основе канюли. Гнойч в верхней части канюли в водителя и положение, так что трубка направлена точно назад.
- Нажмите на кончике катетера брегмы и нулевой координаты на цифровом дисплее. Повышение катетера и перемещать 1,1 мм в поперечном направлении вправо и 0,5 мм кзади (рис. 2В). Держать кожу в сторону с изогнутой кровоостанавливающего.
- Привод тонкий катетер металла через череп, пока пластиковую основу канюли не будет надежно прижимается к верхней части черепа. Металлический катетер может управляться непосредственно через череп у мышей из-за относительно тонкий черепа. При использовании крыс, просверлить отверстие в черепе перед опусканием катетера.
- Потяните любую кожу, которая клея на его подальше от черепа. С водителем канюли проведения канюли / катетер на месте, подождать 1-2 мин, когда клей полностью высохнуть.
- При практике, оценить катетера, вводят 20-40 мкл 2,5% FastGreen краску через трубку (рис. 2С). Подождите 2-3 минуты, perfusэлектронной мышь с 1X PBS, 0,03% гепарина и удаление мозга. Вырезать коронки на катетера. Если катетер помещали в желудочек, краситель будет перфузии всей системе мышь желудочка (рис. 2D).
- Держите катетер с изогнутым кровоостанавливающего при повышении водителя. Медленно освободить кровоостанавливающего чтобы гарантировать, что канюли надежно закреплен в черепе.
- С помощью ватного тампона, надавите на верхнюю часть канюли. Установить кусачки крысы кости в роще между верхней и нижней полой иглы. Обрезать верхнюю часть канюли, продолжая удерживать Долой ватным тампоном. Постарайтесь держать ножницы уровне, с тем, чтобы не отделять канюли из черепа. Если канюли действительно прибывает слабины, быстро восстановить клеем и оказать давление с помощью ватного тампона в течение еще 2 мин.
- Использование 5-0 шва нить, регулярные кровоостанавливающего, и щипцы, вдоль шва полного открытия, внимательно следя за дорогой прямо над канюли. Мы используем бежатьг горизонтального шва матраса (см. рисунок 5) в связи с большой разрез по черепу.
- Нанесите каплю мазь с антибиотиком по голове и шее. Открутить ухо баров и ослабьте носовой конус. Отключив мышь от stereotax и место на потепление площадку для восстановления. Монитор мышей тесно на время восстановления, как правило, от 10-30 минут. Проверяйте каждые 2-3 минут, пока мышь не начинает ходить и уход за себя.
4. Послеоперационный уход
- Монитор мышей ежедневно после операции в течение первой недели.
- Если мышь, кажется, от боли или теснота, мы рекомендуем обеспечить мышь с 5 мг / кг подкожного введения Carprofen один раз каждые 24 часов в течение 5 дней для того, чтобы облегчить боль.
- Если, как представляется, инфекции, щедро применять мазь с антибиотиком в области ежедневно и обратитесь к ветеринару для того, чтобы должным образом рана заживает.
- Rалить 5-0 нейлоновой ниткой 7-10 дней после операции, чтобы предотвратить раздражение от шва нитью.
5. Изменение или удаление Alzet осмотического насоса
После насоса осуществляется активное инфузии ASO, он может быть либо изменены или полностью удалены.
- Выполните те же перед операцией процедуры, описанные выше, со следующими изменениями: 1) Вы не будете нуждаться в изогнутые ножницы, изогнутые кровоостанавливающего, резцы крысы кости, ни цифровой дисплей, и 2) вместо готовит глава мышь, побриться и дезинфекции задней части мыши на стыке насоса и труб.
- Сделать 1,5 см разрез на задней части мыши, перпендикулярной насос / трубопровод узел, с помощью пинцета и ножниц. Осторожно вытяните насос из разреза без значительного передвижка / нажатие на трубку, как это может сотрясать катетера.
- Снять насос, клип трубки около 0,5 см выше потока модулятор и коснуться суперклеем к трубке тО уплотнение закрытое. Подождите 1-2 минуты для клея, чтобы высохнуть. Положите трубку обратно в закрытой разреза и шва. Нанесите мазь с антибиотиком на кожу и зашивают место мышью на площадку с подогревом восстановления.
- Замена насоса, были недавно сделаны насосы готовы вместе с 10 см блюдо заполнено 95% этанола. Катетеры не требуется для новых насосов.
- Возьмите новый насос с щипцами. Опустите пальцы в этаноле, взяться за насосом, и отбросить проточные-модулятор. Затем осторожно и медленно снять старый насос от потока модулятор прикреплены к трубке и канюли. Как только он выключен медленно протяните новый насос на, гарантируя, что поток модулятора никогда не касается внешней мыши.
- Вставьте новый насос через разрез обратно в пакет и подкожного шва кожи. Нанесите мазь с антибиотиком на рану и место мыши на восстановление площадки.
- Как и в случае имплантации насоса, следить за мышами в день после операции, чтобы проверить на райн / дискомфорт и инфекций. Обрабатывайте Carprofen и антибиотики по мере необходимости.
ICV BOLUS
6. Предварительно хирургической процедуры
- Выполните те же перед операцией процедуры, как выше в разделе 2, со следующими изменениями: 1) вам не нужно будет изогнутые ножницы, изогнутые кровоостанавливающего, или резцы крысы кости; 2) очистить 10 мкл Гамильтон шприц и иглу стерилизованной водой и с нагрузкой ASO и 3) прикрепить шприц и иглу для стереотаксического устройства, в котором водитель канюлю расположены.
7. Болюсного введения ASO
- Использование щипцов и небольшой ножницами, сделать разрез от основания шеи до между глазами.
- Протрите черепа чистой стерильным ватным тампоном, а затем ватным тампоном, смоченным в перекиси водорода для повышения темени.
- Переместить шприц / иглу в место, закрепите. Убедитесь, что скошенную часть иглы сталкивается задних. Опуститеиглу пока это касается темени. Нет все координат. Перемещения иглы сбоку на правой 1,0 мм и передняя 0,3 мм (рис. 3а).
- Медленно водить иглу через череп просто пока игла не отверстие на одном уровне с верхней части черепа. Опять же, это может быть сделано за счет малой толщины мыши черепа. Ноль координаты г и опустить иглу -3,0 мм при скорости 1 мм / сек (фиг. 3В). Подождите 2-3 минуты для мозга, чтобы запечатать вокруг иглы.
- Доставка полный 10 мкл АСО со скоростью 1 мкл в секунду. Подождите 2-3 мин. Мы используем 1 мкл скорость инфузии для ASOs в желудочек, хотя этот показатель может отличаться между различными препаратами. При практике, проверьте, правильное размещение иглы, обеспечивая 10-20 мкл 2,5% FastGreen краситель. Заливать мышь с 1X PBS 0,03% гепарина вскоре после инфузии красителем и сделать корональных участков мозга, чтобы убедиться, что краска в желудочковой системе (рис. 3в). <литий> Удержать ватным тампоном против черепа у основания иглы. Поднимите иглу со скоростью 1 мм в секунду. Как только игла из черепа, рулон ватным тампоном на иглу отверстие и удерживайте в течение 1 мин, чтобы предотвратить любые ASO от утечки.
- Шов кожи закрыты, применять мазь с антибиотиком, и место мыши на площадку с подогревом восстановления. В зависимости от концентрации ASO, это может занять 20 минут до пары часов, чтобы полностью восстановиться.
- Как и в случае имплантации насоса, контролировать мышей ежедневно после операции, чтобы проверить на боль / дискомфорт и инфекций. Обрабатывайте Carprofen и антибиотики по мере необходимости.
Representative Results
После инфузионного насоса или назначенного времени после болюсной инъекции ICV (мы обычно используем четыре недели), важно, чтобы проверить эффективность ASOs. Мы рекомендуем принимать различные регионы головного и спинного мозга для измерения уровня / изоформы гена-мишени, и на уровне мРНК с использованием количественной ПЦР в реальном времени, а также уровень белка с использованием либо вестерн-блоттинга и ELISA (рис. 4 для опубликованного пример ). Это поможет определить, ASO эффективность всей различных регионах ЦНС. Если период полураспада целевой белок долго, рекомендуем ожидания дольше после инфузии ASO, чтобы оценить максимальную нокдаун белка или сплайсинга.
Важно также, чтобы проверить олиго распределения. Насос вливания привести к распределению через обе ипсилатеральным и противоположной полушариях, хотя более высокие концентрации ASO часто видели в областях ближе к желудочковой системы 16. ICV болюсов получить более UnifoRM распределение олиго через ЦНС 16, при том, что эффекты не могут длиться долго. Мы читателя к Саутвелла соавт., Чтобы увидеть прямое сравнение по сравнению с насосом болюса олиго распределения 16.
Мы также рекомендуем тестирования нескольких доз, а также продолжительность действия ASOs ASO, так как каждый будет вести себя немного по-другому в естественных условиях. ASOs обычно имеют относительно большую продолжительность действия, с целью или нокдаун сплайсинга, длящихся несколько месяцев после ASO доставки. Кроме того, некоторые ASOs будет работать лучше, чем другие, и некоторые целей гена будет легче нокдаун, чем другие. Из-за этого, когда ASOs скрининга для определения выбранного руководства, рекомендуется тестирование по крайней мере 3-5 ASOs в естественных условиях с п = 4-6 взрослых мышей на ASO в качестве первого прохода.
При использовании лекарственного средства, вместо ASOs, он также будет иметь важное значение для пилота идеальная концентрация лекарство, лекарство продолжительность действия и ЦНС наркотиковраспределение для конкретного соединения.
Таблица 1. Хирургия координат. Координат, используемый для ударил правого бокового желудочка у мышей и крыс при имплантации осмотических насосов, а также выполнять интрацеребровентрикулярный (ICV) болюса. Обе координаты, для насосов и ICV болюса, целевой правого бокового желудочка. Мы используем два различных набора, потому что это то, что мы имеем наибольший опыт и ноу обеспечивают отличное распределение ASO.
Рисунок 1. Стереотаксической установки. (А) необходимые оборудование для стереотаксической Alzet насоса и Bolus операции инъекции. I) бисер Стерилизоватьр. II) цифровой индикации. III) Стереотаксические базы с движущимися оружия. IV) с регулятором температуры грелку. V) Isoflurane / кислородная система. VI) Isoflurane палаты. (B) Закройте конус для носа и ушей баров. (C) Два вложения требуются. Левая: шприц / иглу держатель для ICV инъекции болюса. Справа: Канюля Драйвер для имплантации осмотического насоса.
Рисунок 2. Alzet Осмотический Имплантация насоса. (A) Alzet осмотического насоса вариантов для мышей. . 14 день насосы (0,25 мкл / ч), 28 день насосы (0,25 мкл / ч), 42 день насосы (0,15 мкл / ч) (B) Координаты для имплантации насоса от темени: -0,5 мм Задняя, -1,1 мм Боковые ( справа) и -2,5 мм вентрально (длина катетера). (C) После вождения катетер черезчерепа и склеивание канюли, краситель пропускают через катетер для оценки надлежащее размещение катетера в боковой желудочек. (D) перфузировались мозг сразу же после краситель вводят в виде в (С). Если катетер успешно разместил в желудочке, краситель будет распространяться по всей желудочковой системы мыши.
Рисунок 3. Интрацеребровентрикулярное болюсной инъекции. (A) Координаты для болюсной инъекции брегмы: 0,3 мм впереди, -1,0 мм боковая (справа) и -3,0 мм вентрально (B) После вождения иглу через череп -3,0 мм вентрально, краситель выталкивается через шприц. оценить правильное размещение иглы в более поздних желудочка. (C) перфузировались мозга вскоре после краситель вводят в виде в (B). Если игла успешно разместил в желудочке,красителя будет распространяться по всей желудочковой системы мыши.
Рисунок 4. Антисмысловые олигонуклеотиды уменьшить крыс SOD1 в естественных условиях (рисунок взят непосредственно из Смит и др.. 7). (AD) Антисмысловые олигонуклеотиды SOD1 SOD r146192 или SOD яичницу вводили в течение 28 дней в правый латеральный желудочек нормальных крыс при концентрации 100 мкг / сутки. (A) Эндогенные SOD1 уровни мРНК из мозга и спинного мозга как измерено QRT-PCR. ( B) и SOD1-тубулина белка после ASO инфузии. (С и D) Уровень белка для тубулина и SOD1 количественно для различных областей мозга после инфузии. (Е) ASOs против пресенилина 1 или GSK-3-бета; Вводили в течение 2 недель в правом боковом желудочке нетрансгенных мышей и уровня мРНК оценивали в правой лобной / височной коре. Воспроизводится с разрешения Американского общества клинических исследований. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. Запуск Горизонтальные Матрас шва. 5-0 нейлоновой ниткой резьбы соткан в и из кожи, начиная передним и задним рабочим, концентрируясь больше на канюли. Однажды достигнув самого заднего точки, шовные нити затем привез и резьбой по канюли еще раз. Это обеспечивает правильную закрытия ран и предотвращает канюли / трубопровод от работы через кожу.
Discussion
Возможность доставки наркотиков на глобальном уровне в центральной нервной системе, как показано на видео является чрезвычайно мощная техника, которая легко и освоении и использовании. С практикой одного имплантации насоса или ICV болюса может быть завершена в течение 10 мин, что обеспечивает большой популяции мышей, подлежащего лечению, в то же время. Это особенно полезно для исследования с поведенческими считывания, а для большего числа поведение мыши имеют решающее значение, чтобы помочь увидеть существенные различия.
Основываясь на нашем опыте предоставления услуг больным СПИДом с помощью насосов и болюсов, мы наблюдали некоторые преимущества и недостатки каждого метода. Следует отметить, что это мнение в нашей лаборатории, и не может быть верно для всех мышей и крыс моделей.
Мы находим Преимущество использования насосов является их способность обеспечивать высокое количество ASO с ASO распространяется на гораздо более длительный период времени. Как правило, это приравнивается к более устойчивой нокдаун или после активного сращиванияASO вливания, хотя это не всегда может быть дело. Насосы также позволяют какие-либо конкретные сроки поставки ASO (14 дней, 28 дней или 42 дней), и насосы могут быть установлены только, чтобы еще дольше активного вливания ASO. Тем не менее, мы заметили, что изменение насосов более одного раза увеличивает изменчивость в связи с образованием волокнистого кармана вокруг насоса, которые предотвращают насоса от должным образом поглощать жидкость. Недостатком насосов является то, что некоторые мыши не переносят насоса, а также другие. Если трансгенной линии вы работаете с более хрупкая, насос может быть слишком громоздким. Насосы также должны быть удалены после окончательного вливания, подвергая мышей в другой операции и добавленной анестезии. Если поведение делает работу, это особенно важно, чтобы удалить насоса и позволяют по крайней мере 1-2 недель восстановления, поскольку присутствие насоса будет влиять некоторые поведения у мышей.
С ICV болюсной инъекции, одним из преимуществ является стоимость. Существуетпервоначальные вложения приобрести шприцы и иглы, но с течением времени, болюсов являются более экономически эффективным, так как нет никаких насосов / труб / катетеры для покупки. В целом, существует меньше вверх сохранить с ICV-инъекции болюса из-за отсутствия канюли и насосов. Мы также обнаружили, что ICV болюс может быть использован для доставки ASOs молодым и / или более хрупкими мышей. Недостатком ICV болюса является то, что одной инъекции. Не так много общего ASO могут быть доставлены по этому маршруту, и если продолжительность действия ASO используется короткая, нокдаун / сращивания эффект также будет недолгим.
Оба осмотические насосы, а также БМП болюса иметь возможность доставить больным СПИДом, что может Нокдаун белки или изменить сплайсинг генов во всей ЦНС грызунов, техника, которая имеет широкое применение в неврологии нескольких смежных областях. Мы предлагаем пилотирования обоих методов доставки, если вы не уверены, какой путь введения лучше всего подходит для вашего ыpecific исследования.
Disclosures
Авторы получают антисмысловые олигонуклеотиды от Isis Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Курта Мазер от Isis Pharmaceuticals за оказание консультативных услуг, относящихся к операции ICV болюса, а также Isis Pharmaceuticals в целом для подачи нашей лаборатории с больным СПИДом. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Кэри Shaner за рецензирование этой статьи. ТММ и SLD поддерживается NIH гранты P50AG005681, K08NS074194 и R01NS078398.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
