Summary
Meting van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) is de gouden standaard voor de nierfunctie beoordeling. Hier beschrijven we een high-throughput methode die de bepaling van GFR in bewuste muizen met een enkele bolusinjectie, bepaling van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-inuline in plasma en berekening van GFR door een bifasisch exponentieel model laat.
Abstract
De meting van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) is de gouden standaard in de nierfunctie beoordeling. Momenteel, onderzoekers GFR bepalen door het meten van het niveau van het endogene creatinine biomarker of exogeen toegepaste radioaktief gemerkte inuline (3H of 14C). Creatinine heeft de aanzienlijke nadeel dat proximale tubulaire secretie goed voor ~ 50% van de totale renale uitscheiding van creatinine en daarom creatinine is geen betrouwbare GFR marker. Afhankelijk van het experiment uitgevoerd, kan inuline klaring bepaald worden door een intraveneuze injectie enkele bolus of continue infusie (intraveneus of osmotische minipomp). Beide benaderingen vereisen het verzamelen van plasma of plasma en urine. Andere nadelen van radioactief gelabeld inuline onder gebruik van isotopen, tijdrovende chirurgische voorbereiding van de dieren, en het vereiste van een terminal experiment. Hier beschrijven we een werkwijze die een enkele bolus injectie van toepassingenfluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) gelabeld inuline en het meten van de fluorescentie in 1-2 pl verdund plasma. Door een twee-compartimenten model met 8 bloedafname per muis, is het mogelijk GFR meten tot 24 muizen per dag met een speciale workflow protocol. Deze werkwijze vereist slechts korte isofluraananesthesie alle bloedmonsters werden verzameld in een niet-beheerste en wakker muis. Een ander voordeel is dat het mogelijk is om muizen te volgen over een periode van enkele maanden en behandelingen (bijvoorbeeld doet experimenten gecombineerd met dieet wijzigingen of drugtoepassingen). We hopen dat deze techniek van het meten GFR is nuttig om andere onderzoekers bestuderen muis nierfunctie en zal minder nauwkeurige methoden voor het schatten van de nierfunctie, zoals plasma creatinine en bloed ureum stikstof vervangen.
Introduction
De snelheid van de vorming van plasma ultrafiltraat op de glomerulus is uitgegroeid tot de basis voor de evaluatie nierfunctie (glomerulaire filtratiesnelheid, GFR). De ideale marker om GFR te bepalen moet vrij worden gefilterd, noch afgescheiden of geabsorbeerd en niet gemetaboliseerd. Een dergelijk gedrag bleek te gelden voor inuline en inuline klaring is een gouden standaard voor het bepalen van GFR 3. Overwegende dat de klaring van creatinine grote schaal wordt gebruikt als maat voor de GFR bij mens en dier, doet creatinine niet aan de vereisten van een ideaal GFR marker. Ongeveer 10-40% van de creatinineklaring bij mensen is het gevolg van actieve tubulaire secretie 1, 11 en renale uitscheiding van creatinine is prominent in muizen en ratten 4, 7, 9, 22. Nierfunctieverlies is bekend dat de tubulaire uitscheiding van creatinine dat zijn waarde als een marker van GFR 1, 2 beperkt verhogen. We hebben eerder aangetoond dat organische anion transporter isovorm3 (OAT3) draagt bij aan muizen renale creatinine secretie 22. Echter, inulineklaring vereist typisch het gebruik van radioactief gelabeld inuline (3H of 14C). De radioactieve bepaling van inuline kan worden gebruikt in zowel muizen verdoofd en bewuste, maar bergt de nadelen van talrijke veiligheidsvoorschriften en strikte handlingsvraagstukken inherent aan het gebruik van radioactieve isotopen. Langs deze lijnen, chirurgische klaring voorbereidingen voor de bepaling van de GFR zijn tijdrovend evenals terminal in de natuur. In 1999 Lorenz et al.. 12 geïntroduceerd FITC-inuline als een marker van enkele nefron GFR in verdoofde muizen. Vijf jaar later Qi et al.. 15 bepaald gehele nier GFR in bewuste muizen met behulp van FITC-inuline. Alternatieve protocollen zijn nu met behulp van FITC-inuline als een exogene marker om GFR te meten in bewuste en verdoofde muizen. Deze protocollen behouden gevoeligheid van radioactieve inuline met fluorescentie detectiop en het omzeilen van de nadelen van het werken met een radioactief gelabelde marker. De FITC-inuline assay werd gemodificeerd door anderen 7, 8 en ons 22, 23 om te profiteren van het vermogen van de microvolume NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Dit maakt het mogelijk het verminderen van de totale steekproef volume nodig om <100 ul bloed per GFR meting.
Met de werkwijze en high throughput protocol in deze publicatie, demonstreren we de uitvoerbaarheid van meet GFR in maximaal 24 bewuste muizen per dag. Deze techniek kan nuttig zijn voor andere onderzoekers bestuderen van muizen GFR te zijn en we hopen dat het zal minder nauwkeurige methoden als indices voor de nierfunctie, zoals creatinine en bloed ureum stikstof vervangen.
Protocol
1. Oplossingen
- 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l DDH 2 O (8,5 g / L).
- 0,5 mol / L HEPES pH 7,4 (los 59,6 g HEPES in 0,5 L van DDH 2 0 en pH op 7,4 met 10 N NaOH).
2. Bereiding van FITC-inuline Injection Solution
- Weeg FITC-inuline een 5%-oplossing te bereiden en los op in 0,85% NaCl (gewoonlijk 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) door verwarming tot 90 ° C tot het volledig opgelost.
- Weeg opgelost FITC-inuline-oplossing en noot gewicht.
- Knip een 20 cm stuk dialyse-membraan (moleculair gewicht cut-off: 1000) en zet in DDH 2 O gedurende 30 minuten om de resterende NaN 3 te verwijderen van het membraan en daarna spoelen een paar keer.
- Vul opgelost FITC-inuline in dialyse-membraan en verzegelen goed met sluitingen.
- Weeg hele dialyse-membraan.
- Zet de dialyse-membraan in 1 L 0,85% NaCl-oplossing en roer langzaam licht-beschermd gedurende 24 uur bij roOM temperatuur.
- Weeg hele dialyse-membraan weer en bereken de nieuwe concentratie (water zal osmotisch verplaatsen naar het membraan en ongebonden FITC, of gebonden FITC-inuline <1000 moleculair gewicht zal verhuizen uit het membraan, dus zal de concentratie van FITC-inuline wezenlijk verminderen) .
- De nieuwe FITC-inuline concentratie (c) wordt berekend volgens de formule: c = n / V, waarin n = initiële FITC-inuline bedrag, V = new volume (verschil in gewicht van dialysebuizen vóór en na dialyse plus volume van initiële FITC-inuline-oplossing).
- Voor gebruik steriliseren gedialyseerd FITC-inuline-oplossing door filtratie door een 0,22 urn spuitfilter.
- Blijf FITC-inuline beschermd tegen licht (aluminiumfolie) bij 4 ° C. Gedialyseerd en gesteriliseerd FITC-inuline kan worden gebruikt binnen 2 weken. Deelgenomen FITC-inuline kan worden opgelost door opnieuw verwarmen bij 90 ° C gedurende enkele minuten.
Opmerking: bij gebruik vanFITC-sinistrin 16-18, die geen dialyse nodig is, kunnen alle stappen die nodig zijn voor dialyse worden overgeslagen.
3. Injectie en bloedafname
- Neem lichaamsgewicht (bw) van de muizen voor het experiment.
- Verdoven muizen kort met isofluraan.
- Voor high-throughput van 6 muizen volg protocol gegeven in figuur 3.
- Injecteer 2 pi / g lichaamsgewicht van gedialyseerd FITC-inuline in de retro-orbitale plexus 24 met behulp van een G30 ½ in naald (verwijder luchtbellen uit 100 pi Hamilton spuit door eerst met behulp van een G26 ½ in de naald en vervolgens overschakelen naar een G30 ½ in naald voor injectie).
- Snij 1 mm van muisstaart met schaar eenmaal verzamelen van bloed bij 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 en 75 min na injectie in Na-Heparine minicapillaries. Seal minicapillaries na bloedafname met Châ-afdichting.
- Houd monsters beschermd tegen licht.
- Zet verzegelde minicapillaries binnenkant hematocrit capillairen en centrifugeer gedurende 5 minuten.
- Breken minicapillaries met behulp van een diamantslijper en overdracht gehele plasma waarbij in een ml tube 0.2.
- Maak een 1:10 verdunning met 2 pl plasma en 18 pl 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4) in nieuwe 0,2 ml buis (monsters kan nachts voor fluorescentiemetingen worden bewaard bij 4 ° C).
- Maatregel 2 pl verdund monster met NanoDrop 3300 in duplo. De beschrijving en het gebruik van het instrument wordt hier 5 beschreven.
4. Bereiding van Standaarden
- Verzamel bloed van muizen van dezelfde stam achtergrond in heparine gecoate hematocriet haarvaten, spin down en verdund 1:10 met 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), meestal 80 gl plasma + 720 ul HEPES.
- Verdunnen FITC-inuline injectie oplossing met verdund muis plasma aan de volgende standaard verdunningen te krijgen:
1:10: 10 ul onverdund FITC-inuline-oplossing + 90 pl verdund muizenplasma
1:100: 10 & mu, L (01:10) oplossing + 90 pl verdund muizenplasma
1:1000: 10 pl (1:100) oplossing + 90 pl verdund muizenplasma
1:2000: 30 pl (01:01) oplossing + 30 pl verdund muizenplasma
1:10.000: 10 pl (01:05) oplossing + 40 pl verdund muizenplasma
1:20.000: 20 pl (01:01) oplossing + 20 pl verdund muizenplasma
1:100.000: 10 pl (01:05) oplossing + 40 pl verdund muizenplasma
De concentratie van de normen zal afhangen van de dialyse en zal altijd verschillend zijn voor elk preparaat van FITC-inuline. Het is noodzakelijk om de concentratie te voeren voor de standaardcurve nieuwe elke keer. - Analyseren van gegevens om GFR te berekenen met geschikte software (bijv. GraphPad Prism) met behulp van een twee-fasen exponentieel functie als beschreven in hier 15, 20 en getoond in representatieve resultaten sectie.
Representative Results
GFR berekend met de volgende formule:
GFR = n / (A/K1 + B/K2), waar
n = ingespoten hoeveelheid (n = c • V, waarbij c = FITC-inuline concentratie, V = geïnjecteerde volume)
A = Span1, y-snijpunt van eliminatie
K1 = vervalconstante voor eliminatie
B = Span2, y-snijpunt van de distributie
K2 = vervalconstante voor distributie
Opmerking: A, K1, K2 en B is afkortingen van de GraphPad Prism software elk kunnen analyseren bifasisch exponentieel verval kan worden gebruikt, maar andere wetenschappelijke software gebruikt men verschillende afkortingen.
Door toepassing van een bifasisch exponentieel verval curve fit, gebaseerd op plasma FITC-inuline concentratiebereik moet een curve vergelijkbaar met die in figuur 1 worden verkregen. Berekenen GFR door de bovenstaande formule (en zoals hierin beschreven <sup> 20) maakt het mogelijk om aantasting van de nierfunctie 15 of glomerulaire hyperfiltratie 8, 23 sporen zoals gevonden bij muizen met type 1 diabetes mellitus (Figuur 2).
Figuur 1. Om GFR te meten bij bewuste muizen, wordt kinetiek van FITC-inuline na een enkele dosis intraveneuze injectie gebruikt. Voor de berekening van de GFR, is een twee-compartimenten model toegepast. In de twee-compartimenten model, de eerste snelle verval fase vertegenwoordigt herverdeling van FITC-inuline uit het intravasculaire compartiment naar de extracellulaire vloeistof. De latere fase, met tragere verval in FITC-inuline concentratie, weerspiegelt in hoofdzaak systemische klaring uit het plasma.
Figuur 2. Detection van diabetische hyperfiltratie in wild-type muizen. Type I diabetes mellitus werd geïnduceerd door intraperitoneale toepassing van streptozotocine (STZ, 50 mg / kg gedurende 5 opeenvolgende dagen). GFR werd bepaald vóór (basaal) en 5 weken na de inductie van diabetes. Vanwege tubuloglomerular feedback, een primaire toename van proximale reabsorptie veroorzaakt vroege diabetische hyperfiltratie 21 een bevinding die reproduceerbaar is in wild-type muizen (n = 10, p <0,01 versus basaal dezelfde muis).
Figuur 3. Stroomdiagram voor het meten van GFR in een set van 6 muizen. Meten hele nier GFR door de enkele bolus injectie methode, 8 bloedmonsters worden verzameld op 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 en 75 min na FITC-inuline injectie. Cijfers geven tijdstippen. Getallen tussen haakjes geven steekproefomvang. Tijdstippen links van de verticale rode lijn geven injectietijdstippen (bij 0, 11, 22, 33, 44 en 55 min). Elke muis is voorzien van een andere kleur. Om opeenvolgende bloed collecties krijgen de pijlen volgen. Grijze vakken aangeven wanneer de volgende muis moet voorbereid isofluraananesthesie voorafgaand aan de injectie. Met behulp van dit protocol de minimale tijd tussen 2 bloed collecties van verschillende muizen is 1 min.
Discussion
De huidige studie beschrijft een techniek voor de bepaling van GFR in bewuste muizen bij een enkele bolus-injectie en analyse van fluorescentie in 8 bloedmonsters door bifasisch exponentieel verval. Een GFR meting in 1 muis duurt 75 minuten. Door een speciale stroomdiagram is het mogelijk om de GFR van 6 muizen in 130 min meten. Het is onmogelijk dit stroomdiagram protocol herhalen tot 4 maal per dag en meet GFR in 24 muizen. We pasten deze methode waardoor het mogelijk is om bloed te verzamelen van een kleine staart knip plaats staartader punctie, die sneller en gemakkelijker voor onderzoekers te voeren vergelijking staartader punctie. Door 10 pl hematocriet haarvaten en een 1:10 verdunning is het mogelijk om de totale hoeveelheid bloed nodig <100 pl verminderen. Tenslotte wordt de fluorescentie gemeten met een NanoDrop 3300 fluorospectrometer, waarbij de vaststelling van fluorescentie laat in 1-2 pi van verdunde monster. Deze methode zal de geïnteresseerde investigato gevenra werkelijke GFR waarde. In tegenstelling, creatinine metingen in muizen hebben verschillende zwakheden waaronder "creatinine blind range" en problemen met betrekking tot specifieke en gevoelige vastberadenheid. De "creatinine blinde range" beperkt haar functie als een marker voor GFR omdat serum creatinine blijft in de normale range tot 50% van de nierfunctie verloren is gegaan 19. Aangezien verschillende onderzoekers maken gebruik van genetisch gemodificeerde muizen in hun onderzoek naar nier fysiologie en pathofysiologie bestuderen, deze van het volgende probleem: uitgaande van een knock-out muis van gen X zou een aanzienlijk lagere GFR (met 40%) in vergelijking met een wild-type muis, een hebben eenvoudige screening door het vergelijken van plasma creatinine zou dit verschil niet detecteren. De noodzaak van een goede nauwkeurige methode GFR bepaling kritischer hoe kleiner de verschillen in GFR worden.
Muizen hebben hoge concentraties niet-creatinine chromagens in hun plasma en urine die interfereren met commercieelbeschikbaar creatinine assays. Bijgevolg assays die gebaseerd zijn op de alkalische picraat Jaffe reactiemengsel overschatting creatinine-concentratie in plasma ten opzichte van high performance liquid chromatografie (HPLC) bepaling 6, 13. Een andere beperking is dat de serumcreatinine is beneden de detectielimieten van de verschillende commercieel verkrijgbare assays in vergelijking met HPLC-bepaling. Echter, door enzymatische reacties onderzoekers waren in staat om te bepalen plasma creatinine bij muizen 10, 22.
GFR in een vergelijkbare reeks gevonden in bewuste muizen met een vergelijkbare enkelvoudige bolusinjectie werkwijze alsmede urine FITC-inulineklaring 14. In tegenstelling tot hun protocol, maakt ons protocol met staart snip geen speciale voorzorgsmaatregelen om de integriteit schip te behouden ten opzichte van de staart ader of vene punctie. Voor de urine / plasma gebaseerd FITC-inulineklaring noodzakelijk is chirurgisch implantaat twee osmotische minipumps. Twee pompen moeten hoog genoeg steady-state plasma FITC-inuline concentraties die duidelijk onderscheiden van de achtergrond te bereiken. Dit vereist ook het gebruik van metabole kooien voor een volledige en getimed urineinzameling. De kooien moeten worden doorgespoeld met een verlies van 25-37% van FITC-inuline, die anders optreedt zonder spoelen.
De valkuilen van het gebruik van dit FITC-inuline methode beperkt. Onderzoekers moeten zich bewust zijn van het volgende: (i) te verzekeren dat er geen luchtbellen in de spuit wordt gebruikt voor injectie van het FITC-oplossing, moet (ii) volledig retrobulbaire injectie worden bereikt omdat de hoeveelheid ingespoten bepaalt de berekende GFR, en ( iii) muizen hoogstwaarschijnlijk urineren tijdens de 75 min GFR experiment, zo verontreinigd bloedmonsters met urine, die een zeer hoge FITC-inuline concentratie tot gevolg hebben van de nieren concentratievermogen.
Algemene voordelen of dit FITC-inuline methode zijn de volgende: (i) het is een niet-radioactieve technieken, (ii) is het mogelijk om metingen meerdere keren herhalen in dezelfde muis, (iii) de assay kan worden uitgevoerd in bewuste muizen, ( iv) geen urine Daartoe is het nodig, en (v) een high-throughput optie kan worden gebruikt. Nadelen voor de enkele bolus injectie maatregelen dient dialyse van FITC-inuline, dat kan worden overwonnen door een betere FITC-marker, FITC-sinistrin, dat nu beschikbaar is en kan transcutaan bepaald met een speciale geminiaturiseerde inrichting 18. Hoewel GFR wordt gemeten, is het niet mogelijk om fractionele uitscheiding van vloeistof of ionen gemeten met deze methode.
Samengevat, deze methode de haalbaarheid van een high-throughput werkwijze voor het meten van GFR bij bewustzijn muizen. Zo zou deze techniek van belang zijn voor andere onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bepalen van de nierfunctie bij muizen.
Disclosures
De auteur ontving de financiering van de kosten van deze uitgave van Thermo Fisher Scientific dekken.
Acknowledgments
Ik dank Dr Jessica Dominguez Rieg voor het kritisch lezen van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), een Carl W. Gottschalk Research Grant van de American Society of Nephrology, het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases O'Brien Centrum voor Acute Kidney Injury Research ( P30DK079337) en het Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
| Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
| Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
| 80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
| Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
| 10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
| Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
| Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
| Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
| Sealant | Châ-seal | 510 | |
| Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |
References
- Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate. Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).
- Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases. Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).
- Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man. J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).
- Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).
- NanoDrop 3300 Fluorospectrometer - www.nanodrop.com [Internet]. , Thermo Scientific. Available from: http://www.nanodrop.com/Productnd3300overview.aspx (2013).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).
- Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).
- Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).
- FINGL, E. Tubular excretion of creatinine in the rat. Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).
- Keppler, A., Gretz, N., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).
- Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. Serum creatinine and renal function. Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).
- Qi, Z., Breyer, M. D. Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).
- Qi, Z., Whitt, I., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).
- Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).
- Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).
- Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).
- Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients. Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).
- Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses. J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).
- Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).
- Vallon, V., Eraly, S. A., et al. A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).
- Vallon, V., Schroth, J., et al. Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus. Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).
