Summary
Måling af glomerulære filtrationshastighed (GFR) er den gyldne standard for nyrefunktionen vurdering. Her beskriver vi en high-throughput metode, der tillader bestemmelse af GFR i bevidste mus ved hjælp af en enkelt bolusinjektion, bestemmelse af fluoresceinisothiocyanat (FITC)-inulin i plasma og beregning af GFR ved en tofaset eksponentiel henfald model.
Abstract
Målingen af glomerulære filtrationshastighed (GFR) er guld standard i nyrefunktionen vurdering. I øjeblikket efterforskere bestemme GFR ved at måle niveauet af det endogene biomarkør kreatinin eller eksogent anvendt radioaktivt mærket inulin (3H eller 14C). Kreatinin har den betydelige ulempe, at proximale tubulære sekretion udgør ~ 50% af den totale renale kreatinin udskillelse og dermed kreatinin ikke er en pålidelig GFR markør. Afhængig af den udførte eksperimentet kan inulin clearance bestemmes ved en intravenøs bolusinjektion eller kontinuerlig infusion (intravenøs eller osmotisk minipumpe). Begge tiltag kræver indsamling af plasma eller plasma og urin, hhv. Andre ulemper ved radioaktivt mærkede inulin omfatter brug af isotoper, tidskrævende kirurgisk forberedelse af dyrene, og kravet om en terminal eksperiment. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der anvender en enkelt bolusinjektion affluoresceinisothiocyanat-(FITC)-mærket inulin og måling af dets fluorescens i 1-2 pi fortyndet plasma. Ved at anvende en to-kompartment model, med 8 blod samlinger pr mus, er det muligt at måle GFR i op til 24 mus pr dag ved hjælp af en særlig work-flow-protokol. Denne metode kræver kun kortvarig isofluran anæstesi med alle de blodprøver, der er indsamlet i en ikke-tilbageholdende og vågen mus. En anden fordel er, at det er muligt at følge mus over en periode på flere måneder og behandlinger (dvs. gøre parrede eksperimenter med kostomlægning eller narkotika programmer). Vi håber, at denne teknik for måling GFR er nyttigt at andre forskere studerer musen nyrefunktion og vil erstatte mindre præcise metoder til estimering nyrefunktionen, såsom plasma kreatinin og urinstof.
Introduction
Satsen for dannelse af plasmaultrafiltrat ved glomerulus er blevet grundlaget for at vurdere nyrefunktionen (glomerulær filtrationsrate, GFR). Den ideelle markør til at bestemme GFR bør filtreres frit, hverken secerneres eller reabsorberes og metaboliseres ikke. En sådan adfærd viste sig at være sandt for inulin, og inulin clearance er blevet en gold standard for bestemmelse af GFR 3.. Hvorimod clearance af creatinin udstrakt grad bruges som et mål for GFR hos mennesker og dyr, er kreatinin ikke opfylder kravene i en ideel GFR markør. Omkring 10 - 40% af kreatininclearance hos mennesker er konsekvensen af aktiv tubulær sekretion 1, 11, og renal udskillelse af kreatinin er også fremtrædende i mus og rotter 4, 7, 9, 22. Renal dysfunktion vides at forøge den tubulære udskillelse af kreatinin, hvilket begrænser dens værdi som en markør for GFR 1, 2. Vi har tidligere vist, at organisk aniontransporter isoform3 (OAT3) bidrager til murine renal kreatinin sekretion 22.. Men inulin clearance typisk kræver brug af radioaktivt mærket inulin (3H eller 14C). Den radioaktive bestemmelse af inulin kan anvendes i både bedøvede og bevidst mus, men rummer ulemperne ved talrige sikkerhedsbestemmelser og strenge betjening.De er forbundet med brugen af radioaktive isotoper. Langs disse linjer, er kirurgiske clearance forberedelser til bestemmelse af GFR tidskrævende samt terminal i naturen. I 1999 Lorenz et al. 12. introducerede FITC-inulin som en markør for enkelt nephron GFR i bedøvede mus. Fem år senere Qi et al. 15. bestemmes hel nyre GFR i bevidste mus ved hjælp af FITC-inulin. Alternative protokoller er nu ved hjælp FITC-inulin som en udefrakommende markør til måling af GFR i bevidste og bedøvede mus. Disse protokoller bevarer følsomheden af radioaktivt inulin ved hjælp fluorescens detectipå og omgå ulemperne ved at arbejde med et radioaktivt mærket markør. FITC-inulin assay blev modificeret af andre 7, 8 og os 22, 23 for at tage fordel af den microvolume evne til NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Dette gør det muligt at reducere den samlede prøvevolumen nødvendig til <100 ul blod per GFR måling.
Med metoden og high throughput-protokol i denne publikation, viser vi muligheden for måling GFR i op til 24 bevidste mus per dag. Denne teknik kan være nyttige for andre efterforskere studerer murine GFR, og vi håber, at det vil erstatte mindre nøjagtige metoder som indeks for nyrefunktionen, såsom kreatinin og urinstof.
Protocol
1.. Løsninger
- 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l ddH2O (8,5 g / L).
- 0,5 mol / l HEPES pH 7,4 (opløse 59,6 g HEPES i 0,5 L af Hedeselskabet 2 0 og justere pH til 7,4 under anvendelse af 10 N NaOH).
2.. Fremstilling af FITC-inulin injektionsopløsning
- Afvej FITC-inulin at forberede en 5% opløsning og opløses i 0,85% NaCl (sædvanligvis 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) ved opvarmning til 90 ° C, indtil det er helt opløst.
- Afvejes opløst FITC-inulin løsning og note vægt.
- Skær en 20 cm stykke dialysemembran (molekylvægt cut-off: 1.000) og sat i ddH2O i 30 minutter for at fjerne resterende NaN3 fra membranen og skyl et par gange bagefter.
- Fyld opløst FITC-inulin i dialyse membran og forsegle ordentligt med lukninger.
- Afvej hele dialysemembran.
- Sæt dialysemembran i 1 L 0,85% NaCl-opløsning og omrøres langsomt lys-beskyttet i 24 timer ved roabout temperatur.
- Afvejes hele dialysemembran igen og beregne nye koncentrationer (vand vil osmotisk flytte ind i membranen og ubundne FITC eller bundet FITC-inulin <1,000 molekylvægt vil bevæge sig ud af membranen, og dermed vil koncentrationen af FITC-inulin falde betydeligt) .
- Den nye FITC-inulin koncentrationen (c) beregnes ved hjælp af følgende formel: c = n / V, hvor n = initial FITC-inulin beløb, V = nye lydstyrke (forskel i vægt dialyserør før og efter dialyse plus mængden af initial FITC-Inulin opløsning).
- Før brug sterilisere dialyseret FITC-inulin opløsningen ved filtrering gennem et 0,22 um sprøjtefilter.
- Holde FITC-inulin beskyttet mod lys (aluminiumfolie) ved 4 ° C. Dialyseres og steriliseret FITC-inulin kan bruges i op til 2 uger. Deltog FITC-inulin kan opløses ved genopvarmning ved 90 ° C i et par minutter.
Bemærk: hvis du brugerFITC-sinistrin 16-18, som ikke kræver dialyse kan alle nødvendige skridt for dialyse blive sprunget over.
3.. Injection og blodprøvetagning
- Tag legemsvægt (BW) af musene før forsøget.
- Bedøver mus kortvarigt med isofluran.
- For high-throughput af 6 mus følg protokol tilvejebragt i figur 3..
- Indsprøjtes 2 ul / g kropsvægt dialyseret FITC-inulin i retroorbitale plexus 24 ved hjælp af en G30 ½ i nål (fjerne luftbobler fra 100 ul Hamilton sprøjte ved først at bruge et G26 ½ i nål og så skifte til en G30 ½ i nål til injektion).
- Skær 1 mm mus hale med en saks gang og indsamle blod på 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 og 75 min efter injektion i Na-Heparin minicapillaries. Seal minicapillaries efter blodprøvetagning med CHA-segl.
- Hold prøver beskyttet mod lys.
- Put forseglet minicapillaries inde hematocrit kapillærer og centrifugeres i 5 min.
- Break minicapillaries ved hjælp af en diamantsliber og overførsel hele plasma afpipetteres en 0,2 ml rør.
- Lav en 1:10 fortynding ved anvendelse af 2 pi af plasma og 18 ul 0,5 mol / l HEPES (pH 7,4) i ny 0,2 ml rør (prøverne kunne opbevares natten over ved 4 ° C i fluorescens målinger).
- Mål 2 pi fortyndet prøve med NanoDrop 3300 i dubletter. Beskrivelsen og brugen af instrumentet beskrives her 5..
4.. Udarbejdelse af standarder
- Blodprøven fra mus af den samme baggrund stamme i heparin overtrukket hæmatokrit kapillærer, spin ned og fortyndes 1:10 med 0,5 mol / l HEPES (pH 7,4), sædvanligvis 80 pi plasma + 720 pi HEPES.
- Fortynd FITC-inulin injektion løsning med fortyndet museplasma at få følgende standardfortyndinger:
01:10: 10 pi ufortyndet FITC-inulin opløsning + 90 ul fortyndet museplasma
1:100: 10 & mu, L (1:10) opløsning + 90 ul fortyndet museplasma
1:1000: 10 pi (1:100) opløsning + 90 ul fortyndet museplasma
1:2.000: 30 pi (1:1) opløsning + 30 ul fortyndet museplasma
1:10.000: 10 pi (1:5) opløsning + 40 ul fortyndet museplasma
1:20.000: 20 pi (1:1) opløsning + 20 ul fortyndet museplasma
1:100.000: 10 pi (1:5) opløsning + 40 ul fortyndet museplasma
Koncentrationen af standarder vil afhænge af dialyse og vil altid være forskellig for hvert præparat af FITC-inulin. Det er nødvendigt at indtaste koncentrationen for standardkurven nyt hver gang. - Analysere data til at beregne GFR med passende software (f.eks GraphPad Prism) ved hjælp af en to-faset eksponentiel henfald funktion som beskrevet i her 15, 20 og vist i Repræsentative resultater afdeling.
Representative Results
GFR vil blive beregnet efter følgende formel:
GFR = n / (A/K1 + B/K2), hvor
n = indsprøjtet mængde (n = c • V, hvor c = FITC-inulin koncentrationen, V = injicerede volumen)
A = Span1, y-skæringspunktet for elimination
K1 = henfaldskonstant for eliminering
B = Span2, y-skæringspunktet for distributionen
K2 = henfaldskonstant til distribution
Bemærk: A, K1, B og K2 er forkortelser givet af GraphPad Prism, hver software, der kan analysere tofaset eksponentiel henfald kan bruges, dog kan andre videnskabelige software bruger forskellige forkortelser.
Ved anvendelse af en tofaset eksponentiel henfaldskurve pasform, som er baseret på plasma FITC-inulin koncentrationer, bør en kurve svarende til den, der vises i figur 1 opnås. Beregning GFR ved den ovenfor viste formel (og som beskrevet her <sup> 20) giver mulighed for at opdage nedsat nyrefunktion 15 eller glomerulær hyperfiltrering 8, 23, som findes i mus med type 1-diabetes mellitus (Figur 2).
Figur 1. For at måle GFR i bevidste mus er plasma kinetik FITC-inulin efter en enkelt dosis intravenøs injektion anvendes. Til beregning af GFR er en to-kompartment model benyttes. I to-kompartment model, repræsenterer den første hurtige henfald fase omfordeling af FITC-inulin fra det intravaskulære rum til den ekstracellulære væske. Den senere fase med langsommere henfald i FITC-inulin koncentrationen, overvejende afspejler systemiske clearance fra plasma.
Figur 2. Detection af diabetisk hyperfiltrering i vildtypemus. Type I diabetes mellitus blev induceret ved intraperitoneal anvendelse af streptozotocin (STZ, 50 mg / kg i 5 konsekutive dage). GFR blev bestemt før (basal) og 5 uger efter induktion af diabetes. Grundet tubuloglomerulær tilbagemelding, en primær stigning i proximale reabsorption forårsager tidlig diabetisk hyperfiltrering 21 en konstatering, der er reproducerbar i vildtypemus (n = 10, p <0,01 vs basal samme mus).
Figur 3. Flow-chart til måling af GFR i et sæt af 6 mus. At måle hele nyre GFR ved bolusinjektion metode, skal 8 blodprøver indsamles på 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 og 75 min efter FITC-inulin injektion. Tal angiver tidspunkter. Tal i parentes angiver antal stikprøver. Tidspunkter venstre for den lodrette røde linje indikerer injektiontidspunkter (efter 0, 11, 22, 33, 44 og 55 min). Hver mus er mærket med en anden farve. For at få sekventielle blod samlinger følg pilene. Grå kasser angiver, hvornår den næste mus skal være forberedt for isofluran anæstesi før injektion. Ved hjælp af denne protokol den minimale tid mellem 2 blod samlinger fra forskellige mus er 1 min.
Discussion
Den foreliggende undersøgelse beskriver en teknik til bestemmelse af GFR i bevidste mus ved en enkelt bolus-injektion og analyse af fluorescens i 8 blodprøver ved tofaset eksponentiel henfald. En GFR måling i 1 mus tager 75 min. Ved hjælp af en speciel rutediagram, er det muligt at måle GFR af 6 mus i 130 min. Det er muligt at gentage denne blokdiagrammet protokol op til 4 gange om dagen og måle GFR i 24 mus. Modificerede vi denne metode, således at det er muligt at opsamle blod fra en lille hale klip snarere end halevene punktering, der er hurtigere og lettere for efterforskerne at udføre i forhold til halevenen punktering. Ved hjælp af 10 pi hæmatokrit kapillærer og en 1:10 fortynding, er det muligt at reducere den samlede mængde blod er nødvendig for at <100 gl. Endelig fluorescens måles ved hjælp af en NanoDrop 3300 fluorospectrometer, som tillader bestemmelse af fluorescens i 1-2 pi fortyndet prøve. Denne metode vil give de interesserede investigatora sande GFR værdi. I modsætning hertil har kreatinin målinger i mus flere svagheder, herunder "kreatinin blind høns" og vanskeligheder i forbindelse med specifik og følsom beslutsomhed. Den "kreatinin blind range" begrænser sin funktion som en markør for GFR fordi serumkreatinin forbliver i normalområdet, indtil 50% af nyrefunktionen er tabt 19. Da flere efterforskere udnytte genetisk modificerede mus i deres forskning at studere renal fysiologi og patofysiologi, dette er forsynet med følgende problem: under forudsætning af en knockout mus gen X ville have en betydeligt lavere GFR (med 40%) i forhold til en vildtype-mus, en simpel screening ved at sammenligne plasma kreatinin ikke ville opdage denne forskel. Behovet for en god præcis metode GFR bestemmelse bliver mere kritisk mindre forskelle i GFR blive.
Mus har høje koncentrationer af ikke-kreatinin chromagens i deres plasma og urin, der interfererer med kommercielttilgængelige kreatinin assays. Som en konsekvens, sammenlignet assays, der er baseret på den alkaliske picrat Jaffé reaktion overvurdering kreatinin koncentration i plasma med højtydende væskekromatografi (HPLC) bestemmelse 6, 13. En anden begrænsning er, at serumkreatinin er under detektionsgrænsen for flere kommercielt tilgængelige assays sammenlignet med HPLC-bestemmelse. Men ved hjælp af enzymatiske reaktioner efterforskere var i stand til at bestemme plasma kreatinin i mus 10 22..
GFR i en række lignende blev fundet i bevidste mus på en sammenlignelig enkelt bolusinjektion metode samt urin FITC-inulin clearance 14. I modsætning til deres protokol, er vores protokol hjælp hale snip ikke kræver særlige forholdsregler for at bevare skibet integritet i forhold til hale vene eller saphenavene punkterer. For urin / plasma baseret FITC-inulin clearance er det nødvendigt at kirurgisk implantere to osmotisk minipumps. To pumper er nødvendige for at opnå høje nok steady-state plasma FITC-inulin koncentrationer, der klart adskiller sig fra baggrunden. Dette kræver også brug af metaboliske bure for en komplet og tidsbestemte urinopsamling. Burene skal skylles at tage højde for et tab på 25-37% af FITC-inulin, som ellers forekommer uden skylning.
Faldgruberne ved at bruge denne FITC-inulin metode er begrænsede. Efterforskere skal være opmærksom på følgende: (i) sikre, at der ikke er nogen luftbobler i sprøjten anvendes til injektion af FITC-løsningen, skal (ii) komplet retrobulbær injektion opnås på grund den injicerede mængde bestemmer den beregnede GFR og ( iii) mus vil sandsynligvis urinere i 75 min GFR eksperiment, så undgå forurening blodprøver med urin, som vil have en meget høj FITC-inulin koncentration som følge af nyrerne koncentrationsevne.
Generelle fordele of denne FITC-inulin-metode omfatter følgende: (i) det er en ikke-radioaktiv teknik, (ii) at det er muligt at gentage målingerne flere gange på samme mus, (iii) assayet kan udføres i bevidste mus, ( iv) ingen urin samling er påkrævet, og (v) en high-throughput option kan udnyttes. Ulemper for den fælles bolusinjektion omfatte behovet for dialyse af FITC-inulin, som kan overvindes ved hjælp af en bedre FITC-markør, FITC-sinistrin, som er tilgængelig nu, og kan måles transcutant hjælp af en speciel miniaturiseret anordning 18. Selvom GFR måles, er det ikke muligt at måle brøkdele ekskreter af væske eller ioner med denne metode.
Tilsammen denne metode giver muligheden for en high-throughput metode til måling af GFR i bevidste mus. Således kan denne teknik være af interesse for andre forskere, der er interesseret i at bestemme nyrefunktion hos mus.
Disclosures
Forfatteren modtaget støtte til dækning af omkostningerne ved denne publikation fra Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
Jeg takker Dr. Jessica Dominguez Rieg for kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), et Carl W. Gottschalk Research Grant i American Society of Nefrologisk, National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme O'Brien Center for akut nyreskade Research ( P30DK079337) og Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
| Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
| Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
| 80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
| Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
| 10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
| Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
| Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
| Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
| Sealant | Châ-seal | 510 | |
| Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |
References
- Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate. Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).
- Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases. Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).
- Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man. J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).
- Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).
- NanoDrop 3300 Fluorospectrometer - www.nanodrop.com [Internet]. , Thermo Scientific. Available from: http://www.nanodrop.com/Productnd3300overview.aspx (2013).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).
- Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).
- Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).
- FINGL, E. Tubular excretion of creatinine in the rat. Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).
- Keppler, A., Gretz, N., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).
- Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. Serum creatinine and renal function. Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).
- Qi, Z., Breyer, M. D. Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).
- Qi, Z., Whitt, I., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).
- Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).
- Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).
- Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).
- Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients. Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).
- Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses. J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).
- Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).
- Vallon, V., Eraly, S. A., et al. A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).
- Vallon, V., Schroth, J., et al. Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus. Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).
