Summary
肾小球滤过率（GFR）是测量评估肾功能的金标准。在这里，我们描述了一种高通量的方法，该方法允许由一个两阶段的指数衰减模型，通过使用一个单一的大剂量注射，测定异硫氰酸荧光素（FITC）在血浆中菊粉和肾小球滤过率的计算肾小球滤过率的测定在有意识的小鼠。
Abstract
肾小球滤过率（GFR）的测量是肾功能评估的黄金标准。目前，研究确定GFR测量的内源性生物标志物的肌酐或外源性应用放射性标记的菊粉（3 H或14 C）的水平。肌酐〜50％，因此总肾功能肌酐排泄肌酐，近端肾小管分泌账户的主要缺点是不是一个可靠的GFR标记。根据上进行的实验中，菊粉清除率，可通过静脉注射单一剂量注射或连续输注（静脉或渗透微型泵）。两种方法都要求收集的血浆或血浆和尿液。放射性标记的菊粉的其它缺点包括使用同位素，耗时的手术准备的动物，和要求的终端实验。在这里，我们描述了一种方法，它使用一个单一的静脉注射异硫氰酸荧光素（FITC）标记的菊粉和1-2微升稀释的血浆中测量其荧光。通过施加二室模型，8每只小鼠的血液采集，它是可以测量肾小球滤过率的24只小鼠，每天使用一种特殊的工作流协议。此方法只需要短暂的异氟醚麻醉与所有的血液样品被收集在一个非受限制和清醒鼠标。另一个优点是，它有可能超过一段时间的数个月，处理（ 即进行配对实验饮食结构的改变或药物应用）按照小鼠。我们希望，这种技术是非常有用的测量GFR研究小鼠肾脏功能的其他研究者，将取代不太准确的方法，估计肾功能，如血浆肌酐和尿素氮。
Introduction
汇率形成血浆超滤液上面的肾小球已成为用于评估肾功能（肾小球滤过率，肾小球滤过率）的基础。 GFR理想的标记，以确定应自由过滤，既不分泌或重吸收和代谢。这样的行为被认为是真正的菊粉，菊粉清除已成为金标准测定肾小球滤过率3。肌酐清除率，而被广泛使用作为衡量在人类和动物的肾小球滤过率，肌酐不能满足这个要求的一个理想的GFR标记。人类的肌酐清除率大约10 - 40％的后果是肾小管主动分泌1，11，并在小鼠和大鼠4，7，9，22，肌酐是肾分泌也很突出。肾功能不全患者的肾小管分泌肌酐，这就限制了它的值作为GFR 1，2的标志物是已知会增加。我们先前已经表明，有机阴离子转运亚型有助于3（OAT3）小鼠肾肌酐分泌22。然而，菊粉清除率通常需要使用放射性标记的菊粉（3 H或14 C）。可使用的放射性测定菊粉在麻醉和有意识的小鼠，但藏着众多的安全规章和严格的处理问题，与使用放射性同位素的固有的缺点。沿着这些线路，手术间隙制剂测定肾小球滤过率的耗时以及终端的性质。 1999年洛伦兹等人 12介绍FITC-菊粉麻醉小鼠单肾GFR的标志物。五年后，齐等15确定的全肾GFR在清醒小鼠使用FITC-菊糖。现在替代协议使用FITC-菊粉作为外生光标测量GFR在清醒和麻醉小鼠。这些协议中保留的放射性菊糖的灵敏度通过使用荧光detecti，和绕过的缺点，使用放射性标记的标记。 FITC-菊粉法修改由其他7，8，22，23，利用微量的NanoDrop 3300 fluorospectrometer能力。这可以降低总样本量<100微升血每GFR测量所需。
随着本出版物中提供的方法和高吞吐量的协议，我们展示了24意识的小鼠每天测量GFR的可行性。其他研究者研究小鼠肾小球滤过率，这种技术可能是有用的，我们希望这将取代不太准确的方法，肾功能，如肌酐和尿素氮指数。
Protocol
1。解决方案
- 0.85％的氯化钠8.5克氯化钠/ 1负DDH 2 O（8.5克/升）。
- 0.5 mol / L的HEPES pH为7.4（在0.5 L的双蒸2 0，并调节pH值至7.4，用10 N的氢氧化钠溶解59.6克HEPES）。
2。的FITC-菊粉注射液的制备
- 称取FITC-菊粉制备5％的溶液和溶解在0.85％的氯化钠（通常为100毫克/ 2毫升0.85％的NaCl）中通过加热至90℃，直到完全溶解。
- 称量溶解FITC-菊粉的解决方案，并注意重量。
- 切20厘米一块透析膜（分子量截止：1000），并把在DDH 2 O 30分钟，以去除残留的膜和楠3冲洗几次之后。
- 填写溶解FITC-菊粉透析膜和密封关闭。
- 称量整个透析膜。
- 将1升0.85％NaCl溶液中的透析膜，光在RO的24小时保护，并慢慢搅拌OM温度。
- 整个透析膜的再次称重并计算新的浓度（水会渗透进入膜和未结合的FITC，或绑定FITC-菊粉<1000分子量出膜，因此，FITC-菊粉的浓度会大幅下降） 。
- FITC-菊粉浓度（C）使用下列公式计算：C = N / V，其中n =的FITC-菊粉初始金额，V =新的量（重量透析管透析前后加上初始体积的差异FITC-菊糖溶液）。
- 在使用前通过0.22μm的注射器过滤器，透析的FITC-菊糖溶液通过过滤消毒。
- 不断FITC-菊粉保护光（铝箔），在4℃下渗析和消毒的FITC-菊粉可用于长达2周。参加FITC-菊粉可以再加热溶解，在90℃下为几分钟。
注意：如果使用FITC-sinistrin 16-18，这并不需要透析，透析所需的所有步骤可以跳过。
3。注射和采血车
- 以体重（BW）的小鼠实验前。
- 简单异氟醚麻醉小鼠。
- 对于高吞吐量的6只小鼠，请按照图3中提供的协议。
- 使用G30半针（除去气泡从100微升汉密尔顿注射器首先使用G26半针，然后切换到G30半针，注入2微升/ g体重透析的FITC-菊粉到球后神经丛24注射）。
- 鼠标尾部用剪刀剪下1毫米的一次采集血液3，5，7，10，15，35，56和75分钟后钠肝素minicapillaries中注入。采血后CHA密封的密封minicapillaries。
- 保持避光样品。
- 将密封minicapillaries里面造血暴击毛细血管和离心5分钟。
- 通过使用金刚石切割器，并通过移液到0.2毫升管中转移整个等离子minicapillaries额。
- 1:10稀释，使用2微升血浆和18微升0.5摩尔/ L HEPES（pH7.4）中，在新的0.2毫升管（样品贮存过夜，在4℃下进行荧光测量）。
- 测量稀释样品2微升的NanoDrop 3300重复。的描述和使用的仪器是描述在这里5。
4。配制标准
- 将血液收集在相同的背景应变肝素涂层的血细胞比容毛细管老鼠，降速，用0.5 mol / L的HEPES（pH 7.4）中稀释1:10，通常为80μl血浆+ 720微升HEPES。
- FITC-菊粉注射液稀释的小鼠血浆稀释，得到以下的标准稀释：
1:10：10微升未稀释的FITC-菊粉溶液+ 90微升稀释鼠标的血浆
1:100：10亩，L（1:10）溶液+ 90微升稀释鼠标的血浆
1:1000：10微升（1:100）溶液+ 90微升稀释鼠标的血浆
1:2,000：30微升（1:1）溶液+ 30微升稀释鼠标的血浆
1:10,000：10微升（1:5）溶液+ 40微升稀释鼠标的血浆
1:20,000：20μL（1:1）溶液+ 20微升稀释鼠标的等离子
1:100000：10微升（1:5）溶液+ 40微升稀释鼠标的血浆
标准的浓度将取决于透析，将永远是不同的各制剂的FITC-菊粉。这是必须输入的浓度标准曲线每次新。 - 分析数据计算肾小球滤过率与通过使用适当的软件（ 例如 GraphPad棱镜）这里15，20中所描述的和所示的代表结果的第一个两阶段的指数衰减函数。
Representative Results
肾小球滤过率将使用下面的公式计算：
GFR = N /（A/K1 + B/K2），其中
N =注入量（N = C•V，C = FITC-菊粉浓度，V =注入量）
A = SPAN1时，y轴截距消除
K1 =衰变常数消除
B =跨度2，y轴截距分布
K2 =衰变常数为分配
注意：甲，乙，K1和K2是GraphPad棱镜，每一个软件能够分析两相呈指数衰减的缩写都可以使用，但是，其他的科学软件可能使用不同的缩写。
通过采用一个两阶段的指数衰减曲线拟合，这是基于在血浆中FITC-菊粉的浓度，在图1中所示的曲线与应获得。由上面所示的式（计算肾小球滤过率，在这里所描述<SUP> 20）可以发现在小鼠的1型糖尿病（ 图2），检测肾功能15或肾小球滤过8,23减值。
图1。来衡量GFR清醒小鼠血浆中动力学单剂量静脉注射FITC-菊粉是用来计算肾小球滤过率，二室模型。在双室模型，初始的快速衰减阶段表示FITC-菊粉从血管内室的细胞外液中的再分配。从血浆中后期阶段，在FITC-菊粉浓度的衰减越慢，主要反映全身清除。
图2。 Detection的野生型小鼠糖尿病高滤过，I型糖尿病引起的腹腔应用链脲佐菌素（STZ，50毫克/公斤，连续5天）。 GFR测定（基础）和5周后诱导的糖尿病。由于管球反馈，近端重吸收增加导致糖尿病早期高滤过21是重现这一发现在野生型小鼠组（n = 10，P <0.01基底相同的鼠标）。
图3。在一组6只小鼠的肾小球滤过率的测量为了测量整个肾脏的肾小球滤过率的单一大剂量注射法的流程图 ，8个血液样品必须被收集在3，5，7，10，15，35，56和75分钟后FITC-菊粉注射。数字表示的时间点。括号中的数字表示样本数。时间点的垂直红线表示注射时间点（在0，11，22，33，44和55分钟）。每只小鼠的标记具有不同的颜色。为了获得连续的血液采集，按照箭头。灰色框表示下鼠标时，异氟醚麻醉注射前必须准备。使用此协议2个血液采集来自不同小鼠之间的最短时间是1分钟。
Discussion
本研究中描述了一种技术，在有意识的小鼠的肾小球滤过率的测定由单一大剂量注射和8的血液样本中的荧光分析，通过两相指数衰减。 1鼠标的GFR测量需要75分钟。通过使用一个特殊的流程图，它是能够测量在130分钟6小鼠的肾小球滤过率。重复此流程图协议是可行的，每天1-4次，并测量在24只小鼠的肾小球滤过率。我们修改了这个方法，因此，它有可能从一条小尾巴剪断，而不是尾静脉穿刺，这是更快，更容易调查执行相比，尾静脉穿刺取血。通过使用10微升的血细胞比容毛细管和1:10稀释，这是可能的，以减少总的所需要的血液量<100微升。最后，荧光测量使用的NanoDrop 3300的fluorospectrometer，它允许在1-2微升稀释样品的荧光测定。此方法将得到感兴趣的调查官员岭真GFR值。相比之下，在小鼠体内的肌酐测量有一些弱点，包括“肌酐盲区”和困难相关的特异性和敏感性测定。 “肌酐盲区范围”限制了它的功能作为GFR的标记物，因为血清肌酐保持在正常范围内，直到50％的肾功能丢失19。由于一些研究者利用他们的研究转基因小鼠肾脏生理和病理生理学研究，承担以下问题：假设一个基因敲除小鼠基因X将有一个显着降低肾小球滤过率（40％）的野生型小鼠相比，通过比较简单的筛选血浆肌酐不会检测到这种差异。需要有一个良好的GFR测定准确的方法变得更为关键的肾小球滤过率的差异较小成为。
老鼠，非肌酐chromagens的高浓度，在他们的血浆和尿中的干扰与市售可用肌酐检测。作为一个结果，这是基于测定碱性苦味酸盐Jaffe反应进行高估肌酐在血浆中浓度相比，用高效液相色谱法（HPLC）测定6，13。另一个限制是，血清肌酐低于检测限相比，高效液相色谱法测定的一些市售的检测。然而，通过酶促反应调查能够确定血浆肌酐在小鼠10，22。
GFR在类似的范围内被发现在清醒小鼠使用可比单推注方法以及尿FITC-菊粉清除14。在他们的协议相比，我们的协议，使用尾剪断并不需要特别的预防措施，以保持血管的完整性相比，尾静脉或大隐静脉穿刺。 ，对于尿/等离子为基础的FITC-菊粉清除有必要手术植入两个渗透英里nipumps。有两个泵是要达到足够高的稳态等离子体FITC-菊粉浓度从背景有明显区别。这也需要使用一个完整的，定时的尿液收集代谢笼。网箱需要清洗占25-37％FITC-菊粉，不漂洗，否则发生的损失。
使用此FITC-菊粉方法的缺陷是有限的。主持人应注意下列：（一）保证有注射器用于注射的FITC标记的溶液中没有气泡，（ⅱ）的完整的球后注射必须被实现，因为注射量确定计算肾小球滤过率，及（ ⅲ）小鼠将最有可能在75分钟GFR实验溲，因此可避免污染的血液样本的尿液，这将产生一个非常高的FITC-菊粉的浓度为肾脏浓缩能力的结果。
一般优势Ø上本FITC-菊粉的方法，包括以下内容：（一），（ⅱ）有可能多次重复测量（iii）该法可在有意识的小鼠，进行相同的鼠标，它是一个非放射性技术（ iv）概无需要收集尿液，及（v），可以利用高通量选项。为单一的大剂量注射的缺点包括需要为FITC-菊粉透析，这是可以克服的使用FITC标记，FITC-sinistrin，这是现在使用一个特殊的小型化的移动设备18可以测量皮。即使肾小球滤过率的测量，这是不可能用这种方法测量流体或离子排泄分数。
两者合计，该方法提供了一种高通量的方法，测量在有意识的小鼠的肾小球滤过率的可行性。因此，这种技术可能感兴趣的其他调查那些有兴趣在确定肾功能的影响。
Disclosures
笔者收到的资金，以支付本出版物由赛默飞世尔科技。
Acknowledgments
我感谢，杰西卡Dominguez Rieg的博士批判性阅读这份手稿。支持这项工作是由美国心脏协会（科学家发展格兰特10SDG2610034），卡尔·戈特沙尔克研究资助的美国肾脏病学会，美国国立糖尿病，消化道和肾脏疾病奥布莱恩急性肾损伤研究中心（ P30DK079337）和退伍军人事务部。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
| Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
| Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
| 80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
| Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
| 10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
| Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
| Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
| Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
| Sealant | Châ-seal | 510 | |
| Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |
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