Summary
Con el fin de estudiar los cambios en las fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicos (IENFs) en neuropatías dolorosas (PN), hemos desarrollado protocolos que podrían examinar directamente los cambios morfológicos observados en tres dimensiones en IENFs nociceptivas. El análisis tridimensional de IENFs tiene el potencial para evaluar los cambios morfológicos de IENF en PN.
Abstract
Un punzón de biopsia de la piel se utiliza comúnmente para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos (IENFD) para el diagnóstico de 1,2 polineuropatía periférica. En la actualidad, es una práctica común para recoger biopsias de piel 3 mm a partir de la pata distal (DL) y el muslo proximal (PT) para la evaluación de las polineuropatías dependiente de la longitud 3. Sin embargo, debido a la naturaleza multidireccional de IENFs, es un reto para examinar superposición de estructuras nerviosas a través del análisis de formación de imágenes de dos dimensiones (2D). Alternativamente, imágenes en tres dimensiones (3D) podría proporcionar una mejor solución para este dilema.
En el presente informe, se presentan métodos para la aplicación de imágenes en 3D para estudiar la neuropatía dolorosa (PN). Con el fin de identificar IENFs, muestras de piel se procesan para el análisis de inmunofluorescencia de producto de gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal sartén. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD disuadirminada por inmunohistoquímica utilizando PGP microscopía de campo claro 4. En el estudio actual, se aplicó análisis de doble inmunofluorescencia para identificar IENFD total de, utilizando PGP, y IENF nociceptivo, a través del uso de anticuerpos que reconocen la tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A), el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento de los nervios 5. Las ventajas de IENF co-tinción con PGP y Trk A anticuerpos beneficia el estudio de la PN por tinción con claridad, fibras nociceptivas PGP-positivos. Estas señales fluorescentes se pueden cuantificar para determinar los cambios morfológicos y IENFD nociceptivas de IENF asociados con PN. Las imágenes fluorescentes se adquirieron por microscopía confocal y se procesaron para análisis en 3D. 3D-imagen proporciona capacidades de rotación seguir analizando los cambios morfológicos asociados a la PN. En conjunto, co-tinción fluorescente, la imagen confocal y análisis 3D se benefician claramente el estudio de la PN.
Introduction
En la actualidad, es una práctica común para los médicos para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos, (IENFD) a partir de biopsias de piel en sacabocados, que pueden ser utilizados para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas 3, 6-8. Las biopsias se toman de la pierna distal (DL), 10 cm por encima del maléolo lateral y el muslo proximal (PT), 20 cm por debajo de la espina ilíaca anterior 9. Todos IENF están etiquetados de usar el producto gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal bandeja 10-12. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD determinado por tinción de PGP con microscopía de campo claro 6. Además, varios grupos de investigación han utilizado protocolos de inmunofluorescencia para PGP inmunohistoquímica 7-9. Neuropatía de fibras pequeñas se asocia con el dolor neuropático. Para entender mejor el papel de IENF esencial para el procesamiento del dolor, se desarrolló una técnica para co-label total de IENF con fibras que generan dolor. Nocicepcióntiva IENF, específicamente Aδ y las fibras C, se pueden estudiar a través de la co-etiquetado de IENF con PGP y el marcador nociceptivo, tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A) 5. Trk A es el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso que es esencial para el desarrollo de la nocicepción. Las fibras nerviosas nociceptivas A-positivos Trk son fibras peptidérgicas que expresan la sustancia P (SP) y el péptido relacionado con el gen calcitonina (CGRP). Anteriormente, Lauria y sus colegas aplicaron la técnica de doble etiquetado para estudiar PN, co-etiquetado IENF PGP-positiva con un marcador de 10 nociceptivo. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que Trk IENF A positivo, pero no Trk IENF A negativo, se upregulated en un modelo animal de la neuropatía diabética dolorosa 5. Esta técnica de co-etiquetado proporciona la capacidad para comparar la cuantificación de IENFD nociceptivo al total de IENFD y la capacidad para estudiar los cambios morfológicos asociados con PN. La capacidad de visualizar nociceptivo IENF y compañerasre cuantificación de IENFD total a la IENFD nociceptivo podría proporcionar evidencia objetiva para la presencia de dolor, y, posiblemente, una idea de la severidad del dolor asociado con PN. Esta técnica es también aplicable a la piel de modelos animales. En comparación con estudios previos, el protocolo actual describe métodos para el análisis de imagen en 3D, la creación de la oportunidad de evitar errores que podrían ocurrir en el análisis de imagen 2D.
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Protocol
Parte A: La inmunohistoquímica
Preparación de la placa de 96 pocillos y la prevención de la tinción de fondo biopsias en sacabocados de piel se recogen a partir de sujetos humanos y se incubaron durante 12-24 h en solución fijadora (2% de paraformaldehído con una solución de L-Lisina 0,75 M (pH 7,4) y 0,05 mM de peryodato de sodio) a 4 ° C como se ha descrito previamente 8. Las muestras son entonces cryoprotected en tampón fosfato salino (PBS) con 20% de glicerol a 4 º C durante hasta 1 semana, incrustado en un medio de montaje de temperatura óptima de corte (OCT), a continuación, se seccionó en 50 micras de espesor secciones en un criostato. El protocolo se describe a continuación está diseñado para 8 secciones de piel, el número máximo de secciones de piel posible someterse a técnicas de inmunohistoquímica de flotación libre en una placa de 96 pocillos.
DÍA 1:
1. Prevención de la inmunorreactividad no específica en el estrato córneo
- Etiqueta de placa de 96 pocillos como se muestra en la Figura 1. Añadir 150 l de Imagen FX-TI de señal (Image-TI), eficaz para el bloqueo de la tinción de fondo 11,12, en cada pocillo en la fila 1 de la placa de 96 pocillos.
- Añadir 150 l de 1X PBS en cada pocillo en la fila 2 y 3 de la placa de 96 pocillos.
- Adquirir dos secciones de 50 micras por paciente: una sección de la biopsia tomada en DL, una sección de la biopsia tomada en PT. Un asa de inoculación (LeLoop) se utiliza para transferir secciones de un enjuague a la siguiente para evitar daño morfológico. Transferir suavemente cada sección de 50 m, con un asa de inoculación, en un individuo y de la fila 1, que contiene imagen-IT. Incubar las secciones de imagen-IT durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador plana.
- Enjuague secciones dos veces con PBS 1X (filas 2 y 3) durante 10 min a TA. Coloque la placa de bien en una mecedora plana entre enjuagues.
2. Preparación de 5% de BSA disolución de bloqueo y 1% de solución de enjuague
- Mientras que las secciones de biopsia están incubando en la imagen-IT, prepare 5% solución de bloqueoción (5% de BSA, TX-100, 0,3% solución 0,1 M de PBS-BSA al vórtice hasta que se disuelve completamente).
- Añadir 150 l de solución de bloqueo BSA al 5% en cada pocillo de la fila 4.
- El uso de un asa de inoculación, transferir secciones en pocillos individuales de solución de bloqueo BSA al 5%. Incubar las secciones de solución de bloqueo BSA 5% durante 1-2 horas a temperatura ambiente en un agitador plana.
3. Preparación de BSA al 1% solución de lavado y dilución de los anticuerpos primarios
- Mientras que las secciones están incubando en solución de bloqueo BSA al 5%, preparar la solución de enjuague 1% (1% de BSA, TX-100, solución de PBS-Vortex 0,1 M hasta 0,3% de BSA se disuelve completamente).
- Mientras que las secciones están incubando en solución de bloqueo BSA al 5%, se diluye anticuerpos primarios en 1% de solución de lavado.
- Durante ocho secciones (8 x 150 l = 1,200 l) Se necesita un total de 1.200 l. Los anticuerpos primarios se componen de 1,500 l (aproximadamente 20% del volumen extra).
- Las diluciones de los anticuerpos primarios: PGP, 1:500; Trk A,1:500 en BSA al 1% de solución de lavado.
4. La incubación de las biopsias seccionados en el anticuerpo primario
- Añadir 150 l de anticuerpos primarios diluidos en los pocillos designados de la placa de 96 pocillos (fila 5).
- Transferencia secciones de solución de bloqueo 5% (fila 4) en los pocillos de anticuerpos primarios designados (fila 5).
- Selle la placa de 96 pocillos con parafilm y papel de aluminio para evitar que se sequen y exposición a la luz.
- Incubar la placa de 96 pocillos O / N a 4 ° C en un agitador plana.
DÍA 2:
5. Enjuague biopsias en BSA al 1% de solución de enjuague
- Añadir 150 l de solución de lavado BSA al 1% en cada pocillo en la fila 6, 7, y 8.
- Enjuague secciones tres veces con solución de lavado BSA 1% (Filas 6, 7, y 8) durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente. Cubra el plato bien con papel de aluminio y colocar en rocker plano entre enjuagues.
6. La dilución de anticuerpos secundarios
<ol>- Durante ocho secciones (8 x 150 l = 1,200 l) Se necesita un total de 1.200 l. La secundaria de anticuerpos se preparan en 1500 l (aproximadamente 20% del volumen extra).
- Las diluciones de los anticuerpos secundarios: para PGP (Alexa Fluor 488 burro anti-conejo, 1:250), para Trk A (Alexa Fluor 647 burro anti-cabra, 1:250) en 1% BSA solución de lavado.
7. La incubación de las biopsias seccionados en el anticuerpo secundario
- Añadir 150 l de anticuerpos secundarios diluidos en sus pocillos designados de la placa de 96 pocillos (Fila 9).
- Transferencia secciones de solución de bloqueo 1% de BSA (Fila 8) en anticuerpo secundario bien (Fila 9).
- Selle la placa de 96 pocillos con parafilm y papel de aluminio para evitar que se sequen y exposición a la luz.
- Incubar las secciones de los anticuerpos secundarios designada O/ N a 4 ° C en un agitador plana.
8. Enjuague biopsias en BSA al 1% de solución de enjuague
- Añadir 150 l de solución de lavado BSA al 1% en cada pocillo en la fila 10, 11, y 12.
- Enjuague secciones tres veces con solución de lavado BSA 1% (filas 10, 11, y 12) durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente. Cubra el plato bien con papel de aluminio y colocar en una mecedora plana entre enjuagues.
9. Preparación de preparaciones microscópicas y montaje Biopsias seccionados
- Mientras que las secciones de biopsia están incubando en el último enjuague de solución de lavado BSA 1% (fila 12), preparar portaobjetos.
- Coloque 50 l de BSA al 1% de solución de lavado en una diapositiva a la vez.
- Retire las secciones del 1% BSA solución de lavado (Fila 12) y colocarlo en la 50 l gota de solución de lavado BSA al 1% en el portaobjetos de un microscopio designado. Después de la optimización de la posición de la sección, eliminar el exceso de solución de lavado BSA al 1% con una pipeta de vidrio abombada, tomando las precaucionespara evitar el contacto de la muestra.
NOTA: Asegúrese de que la sección no está doblada, la muestra debe ser plana contra la superficie del portaobjetos.
- Colocar 1 gota de reactivo prolongar Oro de montaje con DAPI cerca de la biopsia en el portaobjetos de un microscopio Antifade. Tome un microscopio mm cubreobjetos de 22x22 y suavemente colóquelo sobre una biopsia y una gota de prolongar antifade reactivo de oro con caída DAPI. Repita para cada sección.
- Vamos portaobjetos seco O / N a temperatura ambiente en la oscuridad.
NOTA: Quite las burbujas de aire utilizando una punta de pipeta. Limpie el exceso de prolongar Gold antifade reactivo.
Parte B: Confocal de imágenes
10. Confocal de imágenes
- Señales de fluorescencia de imagen utilizando una FluoView 500 microscopio confocal de barrido con una inmersión en aceite (1,3 NA) objetivo y zoom dos veces con software versión 5.0 FluoView 40X láser Olympus. Utilice Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647 para excitar el 543-nm HeNe láser verde y el 633-nm láser HeNe rojo, respectivamente. La señal de Alexa Fluor 488 está representado por una mirada verde tabla de consulta (LUT) y el Alexa Fluor 647 por una LUT rojo.
- Ajuste las aberturas confocal para cada detector a 400 micras para mejorar las señales. Exploraciones secuenciales deben ser tomadas con una resolución de 1024 x 1024 para maximizar la separación de señales.
- Captura tridimensional z-serie utilizando 1,2 micras intervalos de z a paso (sobre la base de la unidad de escaneado óptima calculada por el software FluoView) con Kalman promedio (dos marcos).
Parte C: La visualización tridimensional y animación
11. Tridimensional Visualización y animación (3D)
- Archivos Fluoview abiertas en software Imaris x64 (versión 7.3, Bitplane AG) para visualizar los conjuntos de imágenes en 3D.
- Ajuste mostrará cuando sea necesario para mejorar el contraste de la señal específica del nervio.
- Crear un surface para visualizar el límite dermo-epidérmica. Utilice la herramienta de contorno en el modo de dibujo para dibujar el contorno.
- Asignar una superficie semi-transparente a la frontera con el fin de ver las señales fluorescentes subyacentes.
- Captura imágenes fijas de las señales fluorescentes en 3D para crear imágenes instantáneas de la película en 3D.
- Utilice la función de animación para crear una película en 3D. Las imágenes se pueden girar 360 grados varias veces para mostrar cada señal por separado y combinado (Figuras 2, 3 y 4). Establezca la animación para crear películas que consta de 200 cuadros animados a 15 fotogramas por segundo. Guarde cada película como archivo AVI prima.
- Comprimir la última película AVI con el software VirtualDub (versión 1.9.4).
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Representative Results
Se aplicó el protocolo actual para estudiar la morfología de IENF en PT y DL biopsias de piel de pacientes con PN. La piel, a partir de tres sujetos, se recogió en la Universidad de Utah para demostrar la patomorfología asociado con PN. Los temas incluyen: Caso 1: varón de 51 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 14 meses, la puntuación de dolor: 51), y Caso 2: varón de 56 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 108 meses, la puntuación de dolor: 47), y Caso 3: varón de 66 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 42 meses, la puntuación de dolor: 46). La historia y la exploración neurológica, incluyendo las pruebas sensoriales cuantitativas y estudios de conducción nerviosa, se realizaron para evaluar la neuropatía periférica. Las puntuaciones de dolor se determinaron sobre la base de la escala analógica visual de dolor 0-100.
El uso de este protocolo, estamos en condiciones de estudiar la estructura 3D de IENFs en la piel humana (Figura 2). En la Figura 2 (Figura 3). Formación de imágenes 3D de inflamaciones axonales, presentados en la Figura 3, demuestra que estas inflamaciones son estructuras globulares distribuidas a lo largo IENFs. Además, estos métodos se pueden utilizar para estudiar ramificación en IENFs (Figura 4). Imágenes en 3D de ramificación presentada en la Figura 4 demuestran que los cambios morfológicos se llevan a cabo con la presencia de PN. Como se ha descrito anteriormente, la frontera dérmica-epidérmica se determinó sobre la base de la morfología y la orientación de los nervios y la diferencia de intensidad de los píxeles entre la dermis y la epidermis 8. El rastreo de azul, se muestra en las figuras 2, 3, y 4, Indica la unión dermo-epidérmica.
Figura 1. Esquema que representa la instalación de una placa de 96 pocillos de biopsia de piel inmunohistoquímica.
Figura 2. Imágenes tridimensionales (3D) de IENF. La imagen 3D de (A) IENF PGP-positivo, etiqueta verde, representando IENF totales (360 ° de rotación primero) y (B) Trk IENF A positivo, etiqueta roja, que representa IENF nociceptivo (segunda rotación de 360 °), y (C ) una imagen fusionada demuestra PGP-positivo, IENF nociceptivo (tercera rotación de 360 °) en una muestra de piel de la caja 1. Bar = 20 micras. Haz clic aquí para ver la película.
Figura3. Imagen tridimensional de protuberancias axonales en IENF de PN (3D). La imagen 3D de hinchazones axonal (puntas de flecha) a lo largo de IENFs, marcados por PGP con una señal verde, y en el plexo subdérmico en una muestra de piel de la caja 2. Bar = 10 micras. Haz clic aquí para ver la película.
La Figura 4. Imagen tridimensional de ramificación axonal en IENF de PN (3D). La imagen 3D de ramificación axonal (puntas de flecha) junto IENFs, marcado por PGP con una señal verde, en una muestra de piel de la caja 3. Bar = 20 micras. Haz clic aquí para ver la película.
| Componentes de 5% de BSA Solución de bloqueo: | Cantidad necesaria de 12,5 ml |
| 1X PBS | 8.125 ml |
| 0,1% de Triton X-100 (TX-100) [concentración final: 0,03%] | 3,75 ml |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | 0,625 g |
| Total | 12,5 ml |
La Tabla 1. 5% de BSA disolución de bloqueo.
| Componentes de 1% solución de lavado: | Cantidad necesaria de 12 ml |
| 1X PBS | 8.625 ml |
| 0,1% TX-100 [concentración final: 0,03%] | 3,25 ml |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | 0,125 g |
| Total | 12 ml |
Tabla 2. 1% de BSA disolución de bloqueo.
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Discussion
Medición de IENFD ha sido ampliamente utilizado para determinar el grado de neuropatías periféricas 13,14. En la actualidad, el protocolo más comúnmente utilizado sólo mide las densidades de las fibras nerviosas que penetran en la membrana basal de la epidermis; no toma en consideración de ramificación axonal y / o cambios morfológicos de los nervios. Además, no se ha demostrado el análisis IENFD actual para correlacionar IENFD con la presencia de dolor en PN 15.
Hemos informado anteriormente de que el aumento del número de IENFD nociceptivo se asocian con conductas de dolor en ratones db / db, un modelo de ratón de la diabetes tipo 2 5. En ese informe, se aplicó por primera vez un protocolo de doble inmunofluorescencia para estudiar IENF nociceptivo. En el estudio actual, ampliamos nuestro protocolo a la piel humana de pacientes con PN. El análisis de inmunofluorescencia doble proporciona mediciones de ambos IENF total y IENF nociceptivo, el subconjunto de IENFs que mediandolor. Estos nociceptivo IENF son en su mayoría positivas para Trk A y otros neuropéptidos nociceptivo 5. El análisis de inmunofluorescencia doble similares para neuropatías dolorosas ha sido descrito por Lauria y colegas 10. Informaron reducido IENFD para el receptor de potencial transitorio canal subfamilia miembro 1 (TRPV1) V ción en pacientes con neuropatías dolorosas. El protocolo actual podría proporcionar un enfoque alternativo para la medición de IENFD nociceptivo sobre la base de nuestros datos de animales 5.
El protocolo actual ofrece un enfoque 3D para el estudio de la estructura IENF. En combinación con el análisis de doble immunofluorecent, el actual protocolo proporciona métodos para examinar la morfología de IENFs nociceptivo. Los estudios anteriores no han reportado una asociación entre las densidades o ramificación de IENF nociceptivo con PN. Este sentido, demuestran un protocolo para el estudio de la ramificación axonal y la hinchazón en IENFs de la piel humana. Nuestro análisis 3D sugiere que esta método podría ser usado para estudiar los cambios morfológicos de IENF en PN. Además, las imágenes en 3D podría mejorar los protocolos actuales de medición IENFD evitando errores que se asocian con una reducción de visualización de las estructuras superpuestas asociados con la formación de imágenes 2D-.
Hinchazón axonal se define como una ampliación de una porción axonal con un diámetro mayor que dos veces la del calibre axonal original de 16. Esta estructura contiene fragmentos de citoesqueleto y los componentes de transporte axonal axonal. Hinchazón axonal se considera una característica temprana de la neuropatía axonal 6,16,17. Sin embargo, no se ha informado de análisis de las estructuras 3D de hinchamiento axonal en la literatura. Como se representa en la Figura 3, imágenes en 3D podría proporcionar la penetración importante para la inflamación axonal asociada con PN.
Es bien caracterizado que la ramificación axonal acompaña a la recuperación de una lesión del nervio 18. Sin embargo, lametodología disponible para la cuantificación de ramificación axonal es aún limitada basada en imágenes 2D. Como se describe en la Figura 4, la ramificación axonal podría ser complicado por la naturaleza tortuosa de los nervios en regeneración. Por consiguiente, los puntos de ramificación pueden ser oscurecidos por las fibras nerviosas cercanos a afectar a la exactitud de la cuantificación. El análisis de imágenes 3D de nuestro protocolo proporciona una mejor visualización de los detalles de los nervios ramificados.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones K08 NS061039-01A2, el Programa de Investigación de Neurología y descubrimiento, y el Instituto A. Alfred Taubman de Investigación Médica de la Universidad de Michigan. En este trabajo se utilizó la Morfología y Análisis de Imágenes Core del Michigan Diabetes Research and Training Center, financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención 5P90 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales. Los autores desean agradecer a Robinson Singleton y Gordon Smith (Universidad de Utah) por su generosa donación de muestras de piel humana para apoyar el desarrollo inicial de la técnica inmunohistoquímica biomarcador nociceptivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
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