Summary
For å studere endringer av nociceptive intraepidermal nervefibre (IENFs) i smertefulle nevropatier (PN), utviklet vi protokoller som kan direkte undersøke tredimensjonale morfologiske endringer observert i nociceptive IENFs. Tredimensjonal analyse av IENFs har potensial til å vurdere morfologiske endringer av IENF i PN.
Abstract
En punch biopsi av huden er vanlig å kvantifisere intraepidermal nerve fiber tettheter (IENFD) for diagnostisering av perifer polynevropati 1,2. I dag er det vanlig praksis å samle inn 3 mm hud biopsier fra den distale benet (DL) og proksimale lår (PT) for evaluering av lengde-avhengige polynevropatier tre. Imidlertid, på grunn av arten av IENFs retninger, er det en utfordring å undersøke overlappende nervestrukturer gjennom analyse av to-dimensjonale (2D) avbildning. Alternativt kan tre-dimensjonale (3D) avbildning gi en bedre løsning på dette dilemma.
I dagens rapport presenterer vi metoder for å bruke 3D avbildning å studere smertefull nevropati (PN). For å identifisere IENFs, blir Hudprøvene behandlet for analyse av immunofluorescent protein genprodukt 9,5 (PGP), et pan neuronal markør. I dag er det vanlig praksis å diagnostisere små fiber nevropati med IENFD avskrekkeminelagt av PGP immunhistokjemi hjelp lysfelt mikroskopi fire. I denne studien, søkte vi dobbelt immunofluorescerende analyse for å identifisere total IENFD, ved hjelp av PGP, og nociceptive IENF, ved bruk av antistoffer som gjenkjenner tropomyosin-reseptor-kinase A (Trk A), høyaffinitets-reseptor for nervevekstfaktor 5.. Fordelene med co-flekker IENF med PGP og Trk A-antistoffer fordeler studiet av PN ved klart flekker PGP-positive, nociceptive fiber. Disse fluorescerende signaler kan kvantifiseres å bestemme nociceptive IENFD og morfologiske endringer av IENF forbundet med PN. Fluorescerende bildene er kjøpt av konfokalmikroskopi og behandles for 3D analyse. 3D-avbildning gir rotasjons evner å ytterligere analysere morfologiske endringer knyttet til PN. Til sammen fluorescerende co-flekker, confocal bildebehandling og 3D-analyse tydelig fordel studiet av PN.
Introduction
I dag er det vanlig praksis for leger å kvantifisere intraepidermal nerve fiber tettheter, (IENFD) fra hud punsj biopsier, som kan brukes til å diagnostisere små fiber nevropati 3, 6-8. Biopsier er tatt fra den distale benet (DL), 10 cm over den laterale malleolus, og den proksimale lår (PT), 20 cm under fremre iliaca ryggraden ni. Alle IENF er merket med protein genproduktet 9.5 (PGP), et pan neuronal markør 10-12. I dag er det vanlig praksis å diagnostisere små fiber nevropati med IENFD bestemt av PGP farging med lysfelt mikroskopi seks. I tillegg har flere forskningsgrupper brukt immunofluorescent protokoller for PGP immunhistokjemi 7-9. Lite fiber nevropati er ofte forbundet med nevropatisk smerte. For ytterligere å forstå den rollen IENF avgjørende for smerte behandling, har vi utviklet en teknikk for å co-label total IENF med fibre som genererer smerte. Nociceptive IENF, spesielt Aδ og C-fibre, kan studeres gjennom co-merking av IENF med PGP og nociceptiv markør, tropomyosin-reseptor-kinase A (Trk A) 5. Trk A er høyaffinitets-reseptor for nervevekstfaktor som er essensielt for utvikling av nociception. De Trk A-positive nociceptive nervefibre er peptidergic fibre som uttrykker substans P (SP) og kalsitonin relatert peptid (CGRP). Tidligere brukt Lauria og kolleger dobbel-merking teknikk for å studere PN, co-merking PGP-positive IENF med en nociceptiv markør 10. I vår tidligere studie demonstrerte vi at Trk A-positive, IENF, men ikke Trk A-negativ IENF ble oppregulert ved en dyremodell for smertefull diabetisk nevropati 5.. Dette co-merking teknikken gir mulighet til å sammenligne kvantifisering av nociseptive IENFD til total IENFD og muligheten til å studere morfologiske endringer knyttet til PN. Evnen til å visualisere nociseptive IENF og selskaperRe kvantifisering av total IENFD til nociceptiv IENFD kunne gi objektive bevis for tilstedeværelse av smerte og eventuelt innsikt i alvorlighetsgraden av smerte forbundet med PN. Denne teknikken er også aktuelt for huden dyremodeller. I forhold til tidligere studier, beskriver dagens protokoll metoder for 3D bildeanalyse, skaper muligheten til å unngå feil som kan oppstå i 2D bildeanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Del A: Immunohistokjemi
Fremstilling av 96-brønns plate og forebygging av bakgrunnsfarging Punch hud biopsier er samlet inn fra humane individer og inkubert i 12-24 timer i fikseringsoppløsning (2% paraformaldehyd med 0,75 M L-lysin-løsning (pH 7,4) og 0,05 mM natrium-perjodat) ved 4 ° C som tidligere beskrevet 8.. Prøver blir deretter cryoprotected i fosfatbufret saltvann (PBS) med 20% glycerol ved 4 ° C i opptil en uke, forankret i monterings media optimal skjæring temperatur (OCT), deretter seksjonert i 50 um tykke seksjoner på en kryostat. Protokollen er beskrevet nedenfor, er beregnet for 8 hud seksjoner, det maksimale antall hud seksjoner mulig å gjennomgå frittflytende immunhistokjemi i en 96-brønns plate.
DAG 1:
En. Forebygging av ikke-spesifikk immunreaktivitet i stratum corneum
- Etikett 96-brønns plate som vist på figur 1. Tilsett 150 ul av Image-IT FX Signal (Bilde-IT), med virkning for blokkering bakgrunn farging 11,12, i hver brønn i Rad 1 av 96-brønners plate.
- Tilsett 150 pl av 1X PBS i hver brønn i rad 2 og 3 i 96-brønns plate.
- Erverve to 50 mikrometer seksjoner per pasient: en seksjon fra biopsi tatt på DL, en seksjon fra biopsi tatt på PT. En podeøse (LeLoop) brukes til å overføre deler av en skylling til den neste for å unngå morfologisk skade. Forsiktig overføre hver 50 mikrometer delen, ved hjelp av en podeøse, i en individuell godt av Row 1, som inneholder Bilde-IT. Inkuber seksjoner i bilde-det i 30 minutter ved RT på en flat rocker.
- Skyll seksjoner to ganger med 1X PBS (rad 2 og 3) i 10 min ved RT. Plasser godt platen på et flatt rocker mellom skyllinger.
2. Fremstilling av 5% BSA Blocking Solution og 1% renseoppløsningen
- Mens biopsi seksjoner ruger i Image-IT, forberede 5% blokkering løsningsjon (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex løsning inntil BSA helt i oppløsning).
- Tilsett 150 ul av 5% BSA blokkering løsning i hver brønn av Rad 4.
- Ved hjelp av en podeøse, overføre seksjoner i individuelle brønner av 5% BSA blokkerende oppløsning. Inkuber seksjoner i 5% BSA blokkerer løsning for 1-2 time ved RT på en flat rocker.
3. Fremstilling av 1% BSA renseoppløsningen og fortynning av primære antistoffer
- Mens deler ruger på 5% BSA blokkering løsning, forberede en% renseoppløsningen (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex løsning inntil BSA helt i oppløsning).
- Mens deler ruger på 5% BSA blokkering løsning, fortynne primære antistoffer i 1% skylling løsning.
- For åtte seksjoner (8 x 150 pl = 1,200 ul) totalt 1,200 mL er nødvendig. De primære antistoffene er bygget opp i 1500 mL (ca. 20% ekstra volum).
- Fortynninger av de primære antistoffer: PGP, 1:500; Trk A,1:500 i 1% BSA skylling løsning.
4. Inkubasjon av seksjonert Biopsi i Primær antistoff
- Tilsett 150 pl av fortynnet primære antistoffer inn i de tilhørende brønner av 96-brønn plate (rad 5).
- Overføre deler fra 5% blokkering løsning (Rad 4) i de utpekte primære antistoff brønner (Rad 5).
- Tett 96-brønners plate med parafilm og aluminiumsfolie for å unngå uttørking og lys.
- Inkuber 96-brønns plate O / N ved 4 ° C på en flat rocker.
DAG 2:
5. Skyll Biopsi i 1% BSA Skylling Solution
- Tilsett 150 ul av 1% BSA renseoppløsningen i hver brønn i Rad 6, 7 og 8..
- Skyll seksjoner tre ganger med 1% BSA renseoppløsningen (Rader 6, 7 og 8) i 1 time hver gang ved RT. Dekk godt plate med aluminiumsfolie og legg på flat rocker mellom skyllinger.
6. Utvanning av sekundære antistoffer
<ol>- For åtte seksjoner (8 x 150 pl = 1,200 ul) totalt 1,200 mL er nødvendig. De sekundære antistoffer er bygget opp i 1500 mL (ca. 20% ekstra volum).
- Fortynninger av sekundære antistoffer: for PGP (Alexa Fluor 488 esel anti-kanin, 1:250), for Trk A (Alexa Fluor 647 esel anti-geit, 1:250) i 1% BSA skylling løsning.
7. Inkubasjon av seksjonert Biopsi i sekundært antistoff
- Tilsett 150 ul av utvannet sekundære antistoffer i sine utpekte brønnene i 96-brønners plate (rad 9).
- Overføre deler fra 1% BSA blokkering løsning (Rad 8) inn sekundært antistoff godt (rad 9).
- Tett 96-brønners plate med parafilm og aluminiumsfolie for å unngå uttørking og lys.
- Inkuber seksjoner i den angitte sekundære antistoffer O/ N ved 4 ° C på en flat rocker.
8. Skyll Biopsi i 1% BSA Skylling Solution
- Tilsett 150 ul av 1% BSA renseoppløsningen i hver brønn i 10 Row, 11, og 12..
- Skyll seksjoner tre ganger med 1% BSA renseoppløsningen (Linjer 10, 11 og 12) i 1 time hver gang ved RT. Dekk godt plate med aluminiumsfolie og legg på en flat rocker mellom skyllinger.
9. Utarbeidelse av mikroskop lysbilder og oppheng seksjoneres biopsier
- Mens biopsi seksjoner ruger i det siste skyllevannet på 1% BSA renseoppløsningen (Row 12), forberede objektglass.
- Plasser 50 ul av 1% BSA renseoppløsningen på ett lysbilde om gangen.
- Fjern seksjoner fra 1% BSA renseoppløsningen (Row 12), og plasser den i 50 mL dråpe av 1% BSA skylling løsning på den angitte mikroskop lysbilde. Etter å optimalisere posisjonen av delen, fjerne overskudd av 1% BSA renseoppløsningen med en bulbed glass pipette tar forholdsreglerå unngå å berøre prøven.
MERK: Pass på at delen ikke er brettet over, den prøven bør være flatt mot overflaten av mikroskop lysbilde.
- Plasser en dråpe Forleng Gold antifade montering reagens med DAPI nær biopsi på objektglass. Ta en 22x22 mm mikroskop glass dekkglass og forsiktig plasserer den over biopsi og en dråpe forlenge Gold antifade reagens med DAPI slipp. Gjenta for hver seksjon.
- La mikroskopobjektglass tørr O / N ved RT i mørket.
MERK: Fjern eventuelle luftbobler ved hjelp av en pipette tips. Tørk bort overflødig Forleng Gold antifade reagens.
Del B: Confocal Imaging
10. Konfokalmikroskoper Imaging
- Bilde fluorescens signaler ved hjelp av et Olympus FluoView 500 laserskanning confocal mikroskop med en 40X olje-immersion (1.3 NA) objektiv og zoom to ganger med FluoView versjon 5.0 software. Bruk Alexa Fluor 488 og Alexa Fluor 647 å opphisse 543-nm HeNe grønn laser og 633-nm HeNe Red laser, henholdsvis. Alexa Fluor 488 signal er representert ved en grønn look up table (LUT) og Alexa Fluor 647 med en rød LUT.
- Still konfokale åpninger for hver detektor på 400 mikrometer å forbedre signaler. Sekvensielle skanner bør tas med en oppløsning på 1024 x 1024 for å maksimere signal separasjon.
- Fange tredimensjonale z-serien med 1,2 mikrometer z-trinns intervaller (basert på optimal skanneenheten beregnet av FluoView programvare) med Kalman gjennomsnitt (to bilder).
Del C: Tredimensjonal visualisering og animasjon
11. Tredimensjonale (3D) Visualisering og animasjon
- Åpne Fluoview filer i Imaris x64-programvare (versjon 7.3, Bitplane AG) til å visualisere 3D-bildet settene.
- Juster vise som trengs for å forbedre kontrasten av nerve bestemt signal.
- Lag en surface å visualisere dermal-epidermal grensen. Bruk Contour verktøy i tegnemetode å trekke grensen.
- Tildel et semi-transparent overflate til grensen for å vise de underliggende fluorescerende signaler.
- Ta stillbilder av 3D fluorescerende signaler for å lage Snapshot bilder av 3D-film.
- Bruk Animasjon funksjonen til å lage en 3D-film. Bildene kan roteres 360 grader flere ganger for å vise hvert signal separat og fusjonerte (Figurene 2, 3 og 4). Sett animasjon til å lage filmer som består av 200 rammer animert med 15 bilder per sekund. Lagre hver film som en rå AVI fil.
- Komprimere den endelige AVI film med VirtualDub (versjon 1.9.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi søkte gjeldende protokoll for å studere morfologi IENF i PT og DL hud biopsier fra pasienter med PN. Huden, fra tre personer ble samlet inn ved University of Utah for å demonstrere pathomorphology forbundet med PN. Fagene er: Sak 1: en 51-år gammel mann med en historie med PN av type 2 diabetes (varighet: 14 måneder, smerteskår: 51); Tilfelle 2: en 56-år gammel mann med en historie med PN av type 2 diabetes (varighet: 108 måneder, smerteskår: 47) og sak 3: en 66-år gammel mann med en historie med PN av type 2 diabetes (varighet: 42 måneder, smerteskår: 46). Nevrologisk historie og undersøkelse, inkludert kvantitativ sensorisk testing og nerve conduction studier ble utført for å vurdere perifer nevropati. Smertescore ble bestemt basert på 0-100 visuell analog smerte skala.
Ved hjelp av denne protokollen, er vi i stand til å studere 3D-struktur av IENFs i menneskelig hud (figur 2). I figur 2 (figur 3). 3D avbildning av aksonale hevelser, presentert i figur 3, viser at disse hevelsene er kuleformet strukturer fordelt langs IENFs. I tillegg kan disse fremgangsmåter benyttes til å studere forgrening i IENFs (figur 4). 3D bilder av forgrening presentert i figur 4 viser at morfologiske endringer skjer med tilstedeværelse av PN. Som tidligere beskrevet, ble den dermale-epidermale grensen bestemmes basert på morfologi og orientering av nerver og piksel intensitet forskjellen mellom dermis og epidermis 8.. Den blå tracing, avbildet i figurene 2, 3 og 4, Indikerer dermal-epidermal krysset.
Figur 1. Skjematisk tegning av oppsettet for en 96-brønners plate for hudbiopsi immunhistokjemi.
Figur 2. Tredimensjonale (3D) bilder av IENF. Representative 3D-bilde av (A) PGP-positiv IENF, merket grønn, som representerer total IENF (først 360 ° rotasjon) og (B) Trk A-positive, IENF, merket rød, som representerer nociceptiv IENF (andre 360 ° rotasjon), og (C ) en sammenslåtte bildet viser PGP-positive, nociceptiv IENF (tredje 360 ° rotasjon) i en hud prøve fra Tilfelle 1. Bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se filmen.
Figur3. Tredimensjonale (3D) bilde av aksonale hevelser i IENF av PN. Representant 3D-bilde av aksonale hevelser (pilspisser) langs IENFs, merket av PGP med et grønt signal, og innenfor subdermal plexus i en hud prøve fra Tilfelle 2. Bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se filmen.
Figur 4. Tredimensjonale (3D) bilde av aksonal forgrening i IENF av PN. Representant 3D-bilde av aksonal forgrening (pilspisser) sammen IENFs, merket av PGP med et grønt signal, i en hud prøve fra sak 3. Bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se filmen.
| Komponenter av 5% BSA Blocking Solution: | Beløpet som trengs for 12,5 ml |
| 1X PBS | 8.125 ml |
| 0,1% Triton X-100 (TX-100) [endelig konsentrasjon: 0,03%] | 3,75 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0.625 g |
| TOTAL | 12.5 ml |
Tabell 1. 5% BSA Blokkering Solution.
| Komponenter av 1% renseoppløsningen: | Beløpet som trengs for 12 ml |
| 1X PBS | 8.625 ml |
| 0,1% TX-100 [Endelig Konsentrasjon: 0.03%] | 3,25 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,125 g |
| TOTAL | 12 ml |
Tabell 2. 1% BSA Blokkering Solution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Måling av IENFD har vært mye brukt for å fastslå graden av perifere nevropatier 13,14. I dag måler den mest brukte protokollen bare tettheter av nervefibre som penetrerer basalmembranen av epidermis, det tar ikke hensyn aksonal forgrening og / eller morfologiske endringer i nervene. I tillegg har dagens IENFD analyse ikke vist seg å korrelere IENFD med tilstedeværelse av smerte i PN 15.
Vi har tidligere rapportert at økt antall nociseptive IENFD er forbundet med smerte atferd i db / db mus, en mus modell av type 2 diabetes fem. I denne rapporten har vi først brukt en dobbel immunofluorescent protokoll for å studere nociceptiv IENF. I den aktuelle studien, utvider vi vår protokoll til menneskelig hud fra pasienter med PN. Den doble immunofluorescent analysen gir målinger av både total IENF og nosiseptiv IENF, undergruppe av IENFs som formidlersmerte. Disse nociceptiv IENF er for det meste positive for Trk A og andre nociceptive neuropeptides fem. Lignende dobbel immunofluorescerende analyse for smertefulle nevropatier har blitt beskrevet av Lauria og kolleger 10. De rapporterte redusert IENFD for transient receptor potential kationekanalen underfamilie V-medlem 1 (TRPV1) hos pasienter med smertefulle nevropatier. Gjeldende protokoll kunne gi en alternativ tilnærming for måling av nociseptive IENFD basert på våre data fra dyreforsøk fem.
Den nåværende protokollen tilbyr en 3D tilnærming for å studere IENF struktur. I kombinasjon med dobbel immunofluorecent analyse, inneholder gjeldende protokoll metoder for å undersøke morfologi nociceptive IENFs. Tidligere studier har ikke rapportert en sammenheng mellom tetthet eller forgrening av nociseptive IENF med PN. Her viser vi en protokoll for å studere aksonal forgrening og hevelse i IENFs av menneskelig hud. Vår 3D analyser tyder på at dette method kunne brukes til å studere morfologiske endringer av IENF i PN. I tillegg kan 3D avbildning forbedre dagens protokoller av IENFD måling ved å unngå feil som er assosiert med redusert visualisering av overlappende strukturer knyttet til 2D-avbildning.
Aksonal hevelse er definert som en forstørrelse av en aksonal del med en diameter på mer enn to ganger så stor som den opprinnelige aksonal kaliber 16.. Denne strukturen inneholder fragmenter av aksonal cytoskeleton og komponenter av aksonal transport. Aksonal hevelse regnes som en tidlig trekk ved aksonal nevropati 6,16,17. Imidlertid har 3D analyse av aksonal svellende strukturer er ikke blitt rapportert i litteraturen. Som vist i figur 3, kan 3D avbildning gir viktig innsikt for aksonal hevelse assosiert med PN.
Det er godt karakterisert som aksonal forgrening følger med utvinning fra nerveskade 18.. Imidlertidtilgjengelig metodikk for å kvantifisere aksonal forgrening er fortsatt begrenset basert på 2D-avbildning. Som beskrevet i figur 4, kan aksonal forgrening bli komplisert ved kroket natur av regenererende nerver. Følgelig kunne de grenpunkt være skjult av nærliggende nervefibre å påvirke nøyaktigheten til kvantifisering. 3D avbildning analyse av protokollen vår gir forbedret visualisering for detaljer om forgreninger nerver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter å fortolle.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants K08 NS061039-01A2, Program for Nevrologi Research & Discovery, og The A. Alfred Taubman Medical Research Institute ved University of Michigan. Dette arbeidet brukte Morfologi og bildeanalyse Kjernen i Michigan Diabetes Research and Training Center, finansiert av National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 fra National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer. Forfatterne ønsker å takke Robinson Singleton og Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donasjon av menneskelige huden prøver å støtte den første utviklingen av nociceptiv biomarkør immunhistokjemi teknikk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
