Summary
为了研究伤害表皮内神经纤维（IENFs）在痛苦神经病（PN）的变化，我们开发的协议，可以直接检查观察伤害IENFs的三维形态变化。三维分析IENFs的有潜力评估的形态变化IENF PN。
Abstract
一拳的皮肤活检是常用的量化表皮内神经纤维密度（IENFD）的周边多发性神经病变的诊断1,2。目前，通常的作法是，以收集从小腿远端（DL）和近端大腿长度依赖多神经病的评价3（PT）中的3毫米的皮肤活组织切片检查。然而，由于多向性质IENFs，它是具有挑战性的研究通过分析重叠的神经结构的二维（2D）成像。另外，三维（3D）成像，可以提供一个更好的解决方案，这种困境。
在目前的报告中，我们提出了应用三维成像的方法研究痛性神经病变（PN）。为了拣选IENFs的，皮肤样本进行处理的蛋白基因产物9.5（PGP），锅的神经元的标记物的免疫荧光分析。目前，标准做法是诊断小纤维神经病使用IENFD阻止使用PGP免疫组化开采的明视场显微镜4。在目前的研究中，我们采用双重免疫分析识别总IENFD，使用PGP，痛觉IENF，通过使用抗体，承认原肌球蛋白受体激酶A（TRK），高亲和力受体的神经生长因子5。 PGP和TRK A抗体共同染色IENF与优势，有利于PN明确PGP阳性，痛觉纤维染色的研究。这些荧光信号可以被量化，以确定的伤害IENFD及形态学的影响IENF与PN。荧光共聚焦显微镜图像采集和3D分析处理。 3D成像提供了旋转的能力，以进一步分析与PN相关的形态学变化。两者合计，荧光染色，共聚焦成像和3D分析明显受益PN的研究。
Introduction
目前，通常的做法是从皮肤打孔活检，可用于诊断小纤维神经病6-8医师量化表皮内神经纤维密度，（IENFD）。活检取自小腿远端（DL），10厘米以上外踝，和大腿近端（PT），20厘米以下的髂前上棘9。 ，所有IENF标记蛋白基因产物9.5（PGP），泛神经标记10-12。目前，标准做法是小纤维神经病诊断确定由PGP染色与明视场显微镜6 IENFD。此外，一些研究小组已经使用PGP免疫组化免疫协议7-9。小纤维神经病变通常伴有神经性疼痛。为了进一步了解必不可少的疼痛处理IENF的作用，我们制定了技术合作标签总IENF的纤维，产生疼痛。 Nocicep略去IENF，特别是Aδ和C纤维，可以研究通过使用PGP IENF标签和痛觉标记，原肌球蛋白受体激酶A（TRK）5。蒂尔克是伤害性的发展是必不可少的神经生长因子的高亲和力受体。 A-阳性的TRK痛觉神经纤维肽纤维快递P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）。此前，劳里亚和他的同事们采用双标记技术，研究PN，共同标签PGP阳性IENF与疼痛标记10。在我们以前的研究中，我们证实蒂尔克A-阳性IENF，但不是蒂尔克A-负面IENF的，上调糖尿病痛性神经病变的动物模型。这个共同标签技术提供了比较量化痛觉IENFD的，总IENFD和学习能力与PN相关的形态学变化的能力。可视的痛觉IENF和COMPA能力，重新量化总IENFD到痛觉IENFD的疼痛的存在可以提供客观的证据，并有可能洞察疼痛的严重程度与PN。这种技术也适用于皮肤的动物模型。在以往的研究相比，目前的协议描述为3D图像分析的方法，创造了机会，以避免错误可能发生在2D图像分析。
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Protocol
A部分：免疫组化
96 - 孔板的下游和预防的背景染色打孔皮肤活检从人类受试者收集孵育12-24小时，在固定液（用0.75M的L-赖氨酸溶液（pH7.4）中的2％的多聚甲醛和0.05 mM的高碘酸钠）在4℃下，如前面所述。样本，然后cryoprotected的在磷酸盐缓冲盐水（PBS），在4℃的20％甘油1周，嵌入安装媒体最佳的切削温度（OCT），然后划分成50微米厚的部分在低温恒温器中。下面描述的协议，是专为8内的皮肤，皮肤切片的最大数量未能经过自由浮动的免疫组化实验在一个96 - 孔板。
第1天：
1。防止非特异性免疫反应的角质层
- 出版商96 -孔板，如在图1中示出。 图像IT FX信号（图像），有效阻断背景染色11,12，第1行中的96孔板，每孔加入150μl。
- 行2和3的96 - 孔板中，在每孔中加入150μl的PBS洗涤。
- 收购两项每名患者的50微米的部分：一节从DL活检，活检采取PT的一个部分。接种环（LeLoop）是用来传输从一个部分到下一个冲洗，以避免形态破坏。轻轻将每50微米的部分，用接种环，进入个人的第1行，包含图像。孵育30分钟，在RT上平坦的摇臂部分在图像。
- 冲洗部分用1X PBS（行2和3）的两倍，在RT下10分钟。将漂洗之间的一台摇臂孔板。
2。 5％BSA封闭液和1％的清洗液的制备
- 虽然活检切片图像IT孵化，准备5％封闭的解决方案重刑（5％BSA，0.3％TX-100，0.1 M的PBS涡BSA解决方案，直到完全溶解）。
- 进入第4行每口井的5％BSA封闭液加入150μl。
- 用接种环，部分转移到个别井的5％BSA封闭液。为1-2小时，在RT下孵育5％牛血清白蛋白封闭溶液中的部分，在平坦的摇臂。
3。 1％BSA冲洗液和稀释初级抗体的制备
- 虽然部分5％BSA封闭溶液中孵育，制备1％冲洗液（1％BSA，0.3％TX-100，0.1M PBS涡的BSA溶液，直至完全溶解）。
- 虽然部分5％BSA封闭溶液中孵育，稀释第一抗体在1％漂洗液。
- 对于八个部分（8×150微升= 1200微升）共1,200微升是必要的。第一抗体是由在1500微升（约20％的额外体积）。
- 稀释的主要抗体：PGP，1:500; TRKÅ，1:500在含1％BSA的冲洗液。
4。孵化的切片活检小学抗体
- 到指定的96 - 孔板的孔中（第5行），加入150μl稀释的第一抗体。
- 传输部分从封锁5％的溶液（第4行）到指定的初级抗体井（第5行）。
- 用封口膜和铝箔密封的96 - 孔板，以避免干燥和曝光灯。
- 一台摇臂上，孵育96孔板O / N在4℃。
第2天：
5。在1％BSA的冲洗液冲洗穿刺活检
- 到第6行中的各孔，7，和8中，加入150μl含1％BSA的冲洗液。
- 冲洗部分三次，用1％BSA（行6，7，和8），在RT 1小时，每次冲洗液。盖孔板铝箔和冲洗平面之间的摇杆。
6。稀释二级抗体
<醇>- 对于八个部分（8×150微升= 1200微升）共1,200微升是必要的。该次级抗体是由在1500微升（约20％的额外体积）。
- 的二级抗体稀释：PGP（的Alexa Fluor 488驴抗兔1:250），蒂尔克的Alexa Fluor 647驴抗山羊，1:250），A（1％BSA冲洗液中。
7。孵化的切片活检中学抗体
- 到他们的指定的96 - 孔板的孔中（行9）加入150μl稀释的二级抗体。
- 从1％BSA封闭溶液（第8行），在进入第二抗体以及（9行）传输部分。
- 用封口膜和铝箔密封的96 - 孔板，以避免干燥和曝光灯。
- 孵育部分在指定的二级抗体Ø/ N在4°C一台摇臂上。
8。在1％BSA的冲洗液冲洗穿刺活检
- 加入150μl含1％BSA的冲洗液到每口井的行10，11，和12。
- 冲洗部分三次，用1％BSA漂洗溶液（行10，11，和12），在RT每次1小时。盖以及用铝箔板和一台摇臂之间冲洗。
9。显微镜玻片制备和安装切片活检
- 虽然活检切片孵育1％BSA冲洗液（第12行）在最后一次漂洗时，准备显微镜幻灯片。
- 将50μl的1％BSA漂洗溶液一次一张幻灯片上。
- 删除部分从1％BSA的冲洗液（第12行），并将其放置在1％BSA漂洗指定的显微镜载片上的解决办法，将50μl滴。优化部分的位置后，用鼓起的玻璃吸管，去除多余的1％BSA冲洗液，采取预防措施以避免触及标本。
注意：请确保部分不折叠;，试样应反对表面的显微镜幻灯片持平。
- 将1滴延长Gold抗淬灭试剂用DAPI附近的活检安装在显微镜幻灯片。一个22x22毫米显微镜的盖玻片，轻轻把它放在活检和一滴延长Gold抗淬灭试剂DAPI下降。重复的每个部分。
- 让显微镜玻片干燥RT在黑暗O / N。
注：删除任何气泡，用枪头。擦去多余的延长黄金抗淬灭剂。
B部分：共聚焦成像
10。共聚焦成像
- 荧光图像信号采用奥林巴斯FluoView的500激光扫描共聚焦显微镜40X的油浸目标和变焦两次与FluoView 5.0版软件（1.3 NA）。 使用的Alexa Fluor 488和647的Alexa Fluor 543-nm的绿色氦氖激光和633 nm的氦氖红色激光，分别以激发。的Alexa Fluor 488的信号表示由绿色的查找表（LUT）的Alexa Fluor 647由红色LUT。
- 每个检测器的共焦的孔设置在400微米，以提高信号。应采取循序扫描，分辨率为1024×1024，以最大限度地提高信号分离。
- 使用1.2μm的z轴步进间隔（基于计算由FluoView软件的最佳扫描单元）与卡尔曼的平均（两帧）捕获三维的z系列。
C部分：三维可视化与动画
11。三维（3D）的可视化和动画
- Imaris里X64软件（版本7.3，位平面AG）打开Fluoview文件，以可视化的三维图像集。
- 调整显示根据需要，以提高特定的神经信号的对比度。
- 创建一个SUrface可视化真皮表皮边界。使用轮廓工具绘制模式绘制边界。
- 分配一个半透明的表面的边界，以便查看相关的荧光信号。
- 捕获静止图像的3D荧光信号来创建快照映像的3D电影。
- 使用动画功能来创建一个3D的电影。图像可以360度旋转几次，以显示每个信号分开和合并后的（ 图2，图3，和4）。设置动画创建由每秒15帧200帧动画电影。作为一个原始的AVI文件保存每部电影。
- 压缩最终的AVI电影的VirtualDub软件（版本1.9.4）。
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Representative Results
我们套用了目前的协议与PN患者在PT和DL皮肤活检研究的形态IENF。犹他州立大学的皮肤，从三个科目，收集展示的病理形态学与PN。主要内容包括：案例1：一名51岁的男性与2型糖尿病（持续时间：14个月;疼痛得分：51）的PN历史案例2：一个56岁的男性与PN的历史2型糖尿病（工期：108个月;疼痛得分：47）;案例3：一个66岁的男性与PN 2型糖尿病（持续时间：42个月;疼痛得分：46）的历史。神经系统病史和体检，包括定量感觉测试和神经传导研究，进行评估外周神经病变。疼痛分数确定基于0-100视觉模拟疼痛的规模。
通过此协议，我们能够研究在人体皮肤IENFs的三维结构（ 图2）。在图2中图3）。轴索肿胀，在图3中，三维成像显示，这些隆起的球状结构分布IENFs的。此外，这些方法都可以使用，研究分支在IENFs（ 图4）。分支如图4所示的三维图像表明，形态学变化与PN的存在。如前所述，根据形态和方向的神经和真皮和表皮8的像素之间的强度差异来确定的真皮-表皮边界。蓝色的跟踪， 如图2，图3所示，和4个，表明真皮表皮交界处。
图1。设置为96孔板皮肤活检免疫组化的示意图。
图2。三维（3D）图像的IENF。 PGP阳性IENF（A）代表的3D图像，标记为绿色，代表首创的360°旋转总IENF（）及（B）蒂尔克A-积极IENF的，标记为红色，代表伤害性IENF的（第二个360°旋转）和（C ）合并后的图像显示PGP阳性，的伤害IENF（第三个360°旋转）从案例1在皮肤样本。酒吧= 20微米。 点击这里观看电影。
图3。的三维（3D）图像的轴突肿胀在IENF的PN。代表性的3D图像在皮肤样本从案例2中，轴索的肿胀（箭头）沿IENFs，PGP标记的绿色信号，并在皮下神经丛。酒吧= 10微米。 点击这里观看电影。
图4。的三维（3D）图像轴索分支的PN IENF。代表的3D图像沿IENFs轴突分支（箭头），由PGP标记与一个绿色的信号，从案例3皮肤样本。酒吧= 20微米。 点击这里观看电影。
| 5％BSA封闭液的组成： | 所需金额12.5毫升 |
| 1X PBS | 8.125毫升 |
| 0.1％的Triton X-100（TX-100）[终浓度：0.03％] | 3.75毫升 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 0.625克 |
| 总 | 12.5毫升 |
表1中。 5％BSA封闭液。
| 1％的组件冲洗解决方案： | 12毫升所需金额 |
| 1X PBS | 8.625毫升 |
| 0.1％TX-100 [终浓度：0.03％] | 3.25毫升 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 0.125克 |
| 总 | 12毫升 |
表2中。 1％BSA封闭液。
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Discussion
测量IENFD已被广泛用于周围神经病变13,14的程度来决定。目前，最常用的协议仅用于测量神经纤维的密度，穿透基底膜的表皮，它并没有考虑到轴突分枝和/或神经的形态变化。此外，还没有被证明电流IENFD分析与疼痛的存在PN 15相关联IENFD的。
我们以前报道，都与在db / db小鼠的疼痛行为，2型糖尿病的小鼠模型增加的痛觉IENFD的数字。在该报告中，我们首先采用免疫荧光双协议研究痛觉IENF的。在目前的研究中，我们将扩大我们的协议，对人体皮肤与PN患者。双重免疫分析提供了两个总IENF疼痛及IENF的测量，子集的IENFs调解疼痛。这些的伤害IENF大多是正面蒂尔克A等的痛觉神经肽5。劳里亚和他的同事10类似的双重免疫分析已经由痛苦的神经病变。他们减少痛苦的神经病变患者的瞬时受体电位阳离子通道亚科V成员1（TRPV1）IENFD。目前的协议可以提供另一种方式为我们的动物数据 ，基于伤害IENFD的测量。
目前的协议提供了一个3D的方法研究IENF结构。结合双免疫荧光分析，目前协议规定的方法检查痛觉IENFs形态。以往的研究还没有报道密度或PN的伤害IENF与分支之间的关联。在这里，我们展示了一个协议，用于研究轴突分支和肿胀在人体皮肤IENFs的。我们的3D的分析表明，这种米ethod可以用来研究PN IENF的形态变化。此外，三维成像可以改善目前的协议IENFD测量，避免错误，都与减少重叠结构与二维成像的可视化。
被定义为轴索肿胀轴突部，其直径大于2倍的原始轴突口径16的放大。这个结构包含轴突细胞骨架和轴突运输的组成部分片段。轴索肿胀的早期特征性轴索型神经病6,16,17。然而，轴索膨胀结构的三维分析的文献报道。 如图3所示，三维成像能提供重要线索，与PN轴索肿胀。
这是很好的特点，轴突分支伴随着神经损伤的恢复18。然而，本基于二维成像量化轴突分支的可用方法仍然有限。 图4中所描述的，复杂的曲折性神经再生轴突分枝。因此，分枝点附近的神经纤维被遮蔽影响定量结果的准确性。我们的协议提供的三维成像分析改进的可视化分支神经的细节。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助的支持K08 NS061039-01A2，神经学研究发现，和A.阿尔弗雷德·陶布曼医学研究所在密歇根大学的计划。这项工作用了密歇根州的糖尿病研究和培训中心，由国家卫生部授予5P90 DK-20572研究院从国家糖尿病，消化道和肾脏疾病研究所资助的形态和图像分析核心。笔者想感谢罗宾逊的Singleton和戈登史密斯（犹他州大学）的慷慨捐款支持初始伤害性的生物标志物免疫组化技术的发展，人类皮肤样本。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
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