Summary
For at undersøge ændringerne i nociceptive intraepidermal nervefibre (IENFs) i smertefulde neuropatier (PN), vi udviklede protokoller, der direkte kunne undersøge tredimensionelle morfologiske ændringer observeret i nociceptive IENFs. Tredimensional analyse af IENFs har potentiale til at vurdere de morfologiske ændringer IENF i PN.
Abstract
En dorn biopsi af huden er almindeligt anvendt til at kvantificere intraepidermal nerve fiber tætheder (IENFD) til diagnose af perifer polyneuropati 1,2. På nuværende tidspunkt er det almindelig praksis at samle 3 mm hudbiopsier fra den distale ben (DL) og den proksimale låret (PT) til evalueringen af længde-afhængige polyneuropatier 3. Men på grund af den multidirektionelle karakter IENFs, er det udfordrende at undersøge overlappende nerve strukturer gennem en analyse af todimensionale (2D) afbildning. Alternativt kunne tredimensionale (3D) billeddannelse give en bedre løsning på dette dilemma.
I den nuværende rapport præsenterer vi metoder til at anvende 3D-billedbehandling til at studere smertefuld neuropati (PN). For at identificere IENFs er hudprøver forarbejdet til immunofluorescent analyse af protein gen-produkt 9,5 (PGP), et pan neuronal markør. På nuværende tidspunkt er det almindelig praksis at diagnosticere små fiber neuropatier hjælp IENFD afskrækkeudvundet af PGP immunhistokemi hjælp brightfield mikroskopi 4.. I den aktuelle undersøgelse, anvendt vi dobbelt immunofluorescerende analyse for at identificere den samlede IENFD, bruger PGP, og nociceptive IENF, gennem anvendelse af antistoffer, der genkender tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A) højaffinitetsreceptoren for nervevækstfaktor 5.. Fordelene ved co-farvning IENF med PGP og Trk A antistoffer gavner studiet af PN ved klart farvning PGP-positive, nociceptive fibre. Disse fluorescerende signaler kan kvantificeres for at bestemme nociceptive IENFD og morfologiske ændringer i IENF forbundet med PN. De fluorescerende billeder er erhvervet ved konfokal mikroskopi og forarbejdet til 3D analyse. 3D-billedbehandling giver roterende evner at analysere morfologiske ændringer i forbindelse med PN. Tilsammen fluorescerende co-farvning, konfokal billedbehandling og 3D-analyser klart gavne studiet af PN.
Introduction
På nuværende tidspunkt er det almindelig praksis for læger at kvantificere intraepidermal nerve fiber tætheder, (IENFD) fra hudens hudbiopsier, som kan anvendes til at diagnosticere små fiber neuropatier 3, 6-8. Biopsier taget fra den distale ben (DL), 10 cm over de laterale malleolus og den proximale lår (PT), 20 cm under den forreste iliacrygsøjle 9.. Alle IENF mærkes ved hjælp proteingen produkt 9,5 (PGP), et pan neuronal markør 10-12. På nuværende tidspunkt er det almindelig praksis at diagnosticere små fiber neuropatier hjælp IENFD bestemt ved PGP farvning med lysfelt mikroskopi 6.. Derudover har flere forskergrupper brugte immunfluorescerende protokoller for PGP immunhistokemi 7-9. Lille fiber neuropati er ofte forbundet med neuropatisk smerte. For yderligere at forstå den rolle IENF afgørende for smerte behandling, har vi udviklet en teknik til at co-label total IENF med fibre, der genererer smerte. Nociceptiv IENF specifikt Aδ og C-fibre, kan studeres gennem co-mærkning af IENF med PGP og nociceptive markør, tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A) 5.. Trk A er den højaffinitetsreceptoren for nervevækstfaktor, der er afgørende for udviklingen af nociception. TRK A-positive nociceptive nervefibre er peptiderge fibre, der udtrykker substans P (SP) og calcitoningenrelateret peptid (CGRP). Tidligere anvendte Lauria og kolleger dobbelt-mærkning teknik til at studere PN, co-mærkning PGP-positive IENF med en nociceptive markør 10.. I vores tidligere undersøgelse viste vi, at Trk A-positiv IENF, men ikke Trk A-negativ IENF blev opreguleret i en dyremodel af smertefuld diabetisk neuropati 5.. Dette samarbejde mærkning teknik giver mulighed for at sammenligne kvantificering af nociceptive IENFD til total IENFD og evnen til at studere morfologiske ændringer i forbindelse med PN. Evnen til at visualisere nociceptive IENF og virksomre kvantificering af den samlede IENFD til nociceptive IENFD kunne give objektive beviser for tilstedeværelsen af smerte, og muligvis indsigt i sværhedsgraden af smerter forbundet med PN. Denne teknik kan også anvendes til hud dyremodeller. I forhold til tidligere undersøgelser, beskriver den nuværende protokol metoder til 3D-billedanalyse, skaber mulighed for at undgå fejl, der kan opstå i 2D billedanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Del A: Immunohistokemi
Fremstilling af 96-brønds plade og forebyggelse af baggrundsfarvning Punch hudbiopsier indsamles fra forsøgspersoner og inkuberet i 12-24 timer i fikseringsopløsning (2% paraformaldehyd med 0,75 M L-lysin-opløsning (pH 7,4) og 0,05 mM natriumperiodat) ved 4 ° C som tidligere beskrevet 8.. Prøver bliver derefter kryobeskyttet i phosphatbufret saltvand (PBS) med 20% glycerol ved 4 ° C i op til 1 uge, indlejret i monteringsmedie optimal opskæring temperatur (OLT), derefter opdelt i 50 um tykke sektioner på en kryostat. Protokollen beskrevet nedenfor er beregnet til 8 hudsektioner, det maksimale antal hudsektioner muligt at gennemgå fritflydende immunohistokemi i en 96-brønds plade.
Dag 1:
1.. Forebyggelse af Ikke-specifik Immunoreaktivitet i stratum corneum
- Etiket 96-brønds plade, som vist i figur 1.. Tilsæt 150 ul Image-IT FX Signal (Image-IT), effektiv til at blokere baggrundsfarvning 11,12, i hver brønd i række 1 i 96-brønds plade.
- Tilsæt 150 ul 1X PBS i hver brønd i række 2 og 3 i 96-brønds plade.
- Anskaf to 50 um snit per patient: en sektion fra biopsi tages på DL, en sektion fra biopsi tages på PT. En pode løkke (LeLoop) bruges til at overføre sektioner fra én skylning til den næste for at undgå morfologisk beskadigelse. Forsigtigt overføre hver 50 um sektion, ved hjælp af en pode loop, i en individuel brønd af række 1, indeholdende Image-IT. Inkuber sektioner i Image-IT for 30 min ved RT på en flad rocker.
- Skyl sektioner to gange med 1X PBS (Række 2 og 3) i 10 minutter ved stuetemperatur. Placer brønde på en flad rocker mellem skylninger.
2.. Fremstilling af 5% BSA blokerende opløsning og 1% skyllevand
- Mens biopsi sektioner inkubere i Image-IT, forberede 5% blokerende løsningning (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex løsning indtil BSA opløses fuldstændigt).
- Tilsæt 150 pi af 5% BSA blokerende opløsning i hver brønd i række 4.
- Ved hjælp af en pode loop, afsnit overføres til individuelle brønde i 5% BSA blokerende opløsning. Inkuber sektioner i 5% BSA blokerende opløsning i 1-2 timer ved stuetemperatur på en flad rocker.
3.. Fremstilling af 1% BSA skyllevand og fortynding af primære antistoffer
- Mens sektioner inkubering i 5% BSA blokerende opløsning, forberede 1% skylning opløsning (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex løsning indtil BSA opløses fuldstændigt).
- Mens sektioner inkubering i 5% BSA blokerende opløsning, fortyndes primære antistoffer i 1% skyllevand.
- For otte sektioner (8 x 150 pi = 1.200 ul) i alt 1.200 pi er nødvendig. De primære antistoffer er konfektioneret 1.500 pi (omkring 20% ekstra volumen).
- Fortyndinger af de primære antistoffer: PGP, 1:500, Trk A,1:500 i 1% BSA skylning løsning.
4.. Inkubation af sektionsopdelte Biopsier i Primary Antibody
- Tilsæt 150 ul fortyndede primære antistoffer i de udpegede brønde i 96-brønds plade (Række 5).
- Overfør sektioner fra 5% blokerende opløsning (Række 4) ind i de udpegede primære antistof brønde (Række 5).
- Forsegle 96-brønds plade med parafilm og aluminiumsfolie for at undgå udtørring og lyseksponering.
- Inkubér 96-brønds plade O / N ved 4 ° C på en flad rocker.
DAG 2:
5.. Skyl Biopsier i 1% BSA Skylning Solution
- Tilsæt 150 pi af 1% BSA skylleopløsning i hver brønd i række 6, 7 og 8.
- Skyl sektioner tre gange med 1% BSA skylleopløsning (Rækker 6, 7 og 8) i 1 time hver gang ved stuetemperatur. Dæk godt plade med alufolie og sted på flad rocker mellem skylninger.
6.. Fortynding af sekundære antistoffer
<ol>- For otte sektioner (8 x 150 pi = 1.200 ul) i alt 1.200 pi er nødvendig. De sekundære antistoffer består i 1.500 pi (omkring 20% ekstra volumen).
- Fortyndinger af sekundære antistoffer: for PGP (Alexa Fluor 488 æsel anti-kanin, 1:250), for Trk A (Alexa Fluor 647 æsel anti-ged, 1:250) i 1% BSA skyllevand.
7.. Inkubation af sektionsopdelte Biopsier i sekundært antistof
- Tilsæt 150 pi af fortyndet sekundære antistoffer i deres udpegede brønde i 96-brønds plade (række 9).
- Overfør sektioner fra 1% BSA blokerende opløsning (Række 8) ind sekundært antistof godt (række 9).
- Forsegle 96-brønds plade med parafilm og aluminiumsfolie for at undgå udtørring og lyseksponering.
- Inkuber sektioner i udpegede sekundære antistoffer O/ N ved 4 ° C på en flad rocker.
8.. Skyl Biopsier i 1% BSA Skylning Solution
- Tilsæt 150 pi af 1% BSA skylleopløsning i hver brønd i række 10, 11 og 12.
- Skyl sektioner tre gange med 1% BSA skylleopløsning (Rows 10, 11 og 12) i 1 time hver gang ved stuetemperatur. Dæk godt plade med alufolie og sted på en flad rocker mellem skylninger.
9.. Udarbejdelse af Mikroskopdias og Montage sektioneret biopsier
- Mens biopsi sektioner inkubere i sidste skyl på 1% BSA skyllevand (Række 12), forberede objektglas.
- Placer 50 pi af 1% BSA skylleopløsning på ét dias ad gangen.
- Fjern sektioner fra 1% BSA skyllevand (Række 12), og placer den i 50 pi dråbe 1% BSA skylning løsning på udpegede mikroskopobjektglasset. Efter at optimere positionen af sektionen, fjerne overskydende 1% BSA skylleopløsning med en bulbed glaspipette, idet der træffes forholdsreglerat undgå at røre prøven.
BEMÆRK: Sørg for sektion er ikke foldet over, prøven skal være fladt mod overfladen af objektglasset.
- Anbring 1 dråbe Forlæng Gold antiblegemiddel montering reagens med DAPI nær biopsi på mikroskopobjektglasset. Tag en 22x22 mm mikroskop dækglas og forsigtigt placere det over biopsi og en dråbe Forlæng Guld antiblegemiddel reagenset med DAPI dråbe. Gentag for hver sektion.
- Lad mikroskopobjektglas tør O / N ved stuetemperatur i mørke.
BEMÆRK: Fjern eventuelle luftbobler ved hjælp af en pipette spids. Tør overskydende Forlæng Gold antiblegemiddel reagens.
Del B: Konfokal Imaging
10.. Konfokal Imaging
- Billede fluorescens signaler ved hjælp af en Olympus FluoView 500 laserscanning konfokal mikroskop med en 40X olieimmersionsobjektiv (1,3 NA) objektiv og zoom to gange med FluoView version 5.0 software. Brug Alexa Fluor 488 og Alexa Fluor 647 til ophidse 543-nm HeNe grøn laser og 633-nm HeNe Red laser, hhv. Den Alexa Fluor 488 signal er repræsenteret ved en grøn opslagstabel (LUT) og Alexa Fluor 647 af en rød LUT.
- Indstil konfokale åbninger til hver detektor ved 400 um kan forbedre signalerne. Sekventielle scanninger bør tages i en opløsning på 1.024 x 1.024 for at maksimere signal separation.
- Capture tredimensionelle z-serien bruger 1,2 um z-trin intervaller (baseret på den optimale scanning enhed beregnet af FluoView software) med Kalman gennemsnit (to rammer).
Del C: Tre-dimensionel Visualisering og Animation
11.. Tre-dimensionel (3D) Visualisering og Animation
- Åbn Fluoview filer i Imaris x64 software (version 7.3, Bitplane AG) at visualisere 3D-billedet sæt.
- Juster vises som er nødvendig for at forbedre kontrasten af nerve specifikt signal.
- Opret en surface at visualisere dermal-epidermal grænse. Brug Contour værktøj i lodtrækningen tilstand for at trække grænsen.
- Tildele en semi-transparent overflade til grænsen for at se de underliggende fluorescerende signaler.
- Optage stillbilleder i 3D fluorescenssignaler at skabe Snapshot billeder af 3D-film.
- Brug Animation funktion til at oprette en 3D-film. Billederne kan roteres 360 grader flere gange for at vise hvert signal separat og fusionerede (fig. 2, 3 og 4). Sæt animation til at skabe film, der består af 200 billeder animeres ved 15 frames per sekund. Gem hver film som en rå AVI-fil.
- Komprimer den endelige AVI film med VirtualDub software (version 1.9.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi anvendte den nuværende protokol for at studere morfologi IENF i PT-og DL hudbiopsier fra patienter med PN. Huden, fra tre emner, indsamlet blev på University of Utah for at demonstrere pathomorphology forbundet med PN. Emnerne omfatter: Case 1: en 51-årig mand med en historie af PN af type 2-diabetes (Varighed: 14 måneder, smerte score: 51) Case 2: en 56-årig mand med en historie af PN af type 2 diabetes (varighed: 108 måneder smerte score: 47), og sag 3: en 66-årig mand med en historie af PN af type 2 diabetes (varighed: 42 måneder smerte score: 46). Neurologisk historie og eksamen, herunder kvantitative sensoriske test og nervetilstanden studier blev udført for at vurdere perifer neuropati. Smertescore blev bestemt baseret på 0-100 visuel analog smerte skala.
Brug af denne protokol, er vi i stand til at studere 3D-struktur af IENFs i menneskehud (figur 2). I figur 2 (figur 3). 3D billeddannelse af axonal hævelser, præsenteret i figur 3, viser, at disse hævelser er kugleformede strukturer fordelt langs IENFs. Desuden kan disse metoder anvendes til undersøgelse af forgrening i IENFs (figur 4). 3D-billeder af forgrening præsenteret i figur 4 viser, at morfologiske ændringer finder sted med tilstedeværelse af PN. Som tidligere beskrevet blev den dermale-epidermale grænse bestemmes på basis af morfologi og orientering af nerver og pixelintensiteten forskellen mellem dermis og epidermis 8.. Den blå opsporing, afbildet i figur 2, 3 og 4Angiver dermal-epidermal krydset.
Figur 1. Skematisk diagram, der viser opsætning af en 96-brønds plade til hudbiopsi immunhistokemi.
Figur 2. Tre-dimensionelle (3D) billeder af IENF. Repræsentant 3D-billede af (A) PGP-positive IENF, mærket grøn, der repræsenterer i alt IENF (første 360 ° rotation) og (B) Trk A-positive IENF, mærket rød, der repræsenterer nociceptive IENF (anden 360 ° rotation) og (C ) en flettede billede viser PGP-positive, nociceptive IENF (tredje 360 ° rotation) i en skin prøve fra Case 1. Bar = 20 um. Klik her for at se filmen.
Figur3.. Tre-dimensionel (3D) billede af axonale hævelser i IENF af PN. Repræsentant 3D-billede af axonale hævelser (pilespidser) langs IENFs, mærket af PGP med et grønt signal, og inden for det subdermal plexus i en hud prøve fra Case 2. Bar = 10 um. Klik her for at se filmen.
Figur 4.. Tre-dimensionel (3D) billede af axonal forgrening i IENF af PN. Repræsentant 3D-billede af axonal forgrening (pilespidser) langs IENFs, mærket af PGP med et grønt signal, i en hud prøve fra Case 3. Bar = 20 pm. Klik her for at se filmen.
| Komponenter i 5% BSA blokerende opløsning: | Beløb Needed for 12,5 ml |
| 1X PBS | 8,125 ml |
| 0,1% Triton X-100 (TX-100) [Slutkoncentration: 0,03%] | 3,75 ml |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | 0,625 g |
| TOTAL | 12,5 ml |
Tabel 1. 5% BSA blokerende opløsning.
| Komponenter i 1% Skylning Løsning: | Beløb Needed for 12 ml |
| 1X PBS | 8,625 ml |
| 0,1% TX-100 [Slutkoncentration: 0,03%] | 3,25 ml |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | 0,125 g |
| TOTAL | 12 ml |
Tabel 2. 1% BSA blokerende opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Måling af IENFD har været meget anvendt til at bestemme graden af perifere neuropatier 13,14. På nuværende tidspunkt har kun den mest almindeligt anvendte protokol måler tætheder af nervefibre, der trænger basalmembranen af overhuden, og det behøver ikke tage hensyn axonal forgrening og / eller morfologiske ændringer i nervesystemet. Desuden har den nuværende IENFD analyse ikke vist sig at korrelere IENFD med tilstedeværelsen af smerte i PN 15..
Vi har tidligere rapporteret, at et forøget antal nociceptiv IENFD er forbundet med smerte adfærd hos db / db-mus, en musemodel af type 2-diabetes 5.. I denne rapport først vi anvendte en dobbelt immunofluorescent protokol til at studere nociceptive IENF. I den aktuelle undersøgelse, udvider vi vores protokol til menneskehud fra patienter med PN. Den dobbelte immunofluorescent analyse giver målinger af både total IENF og nociceptive IENF, den delmængde af IENFs som medierersmerte. Disse nociceptiv IENF er overvejende positive for Trk A og andre nociceptive neuropeptider 5.. Lignende dobbelt immunofluorescens analyse for smertefulde neuropatier er blevet beskrevet af Lauria og kolleger 10. De rapporterede reduceret IENFD til transient receptor potentielle kation kanal underfamilie V-medlem 1 (TRPV1) hos patienter med smertefulde neuropatier. Den nuværende protokol kunne give en alternativ tilgang til måling af nociceptive IENFD baseret på vores data fra dyr 5.
Den nuværende protokol tilbyder en 3D-tilgang til at studere IENF struktur. I kombination med dobbelt immunofluorecent analyse giver den nuværende protokol metoder til at undersøge morfologi nociceptive IENFs. Tidligere undersøgelser har ikke rapporteret en sammenhæng mellem tætheder eller forgrening af nociceptive IENF med PN. Her viser vi en protokol for at studere axonal forgrening og hævelse i IENFs af menneskelig hud. Vores 3D analyse antyder, at denne metode kunne anvendes til at studere de morfologiske ændringer i IENF i PN. Desuden kunne 3D imaging forbedre de nuværende protokoller IENFD måling ved at undgå fejl, der er forbundet med nedsat visualisering af overlappende strukturer i forbindelse med 2D-billeddannelse.
Axonal hævelse defineres som en udvidelse af en axonal del med en diameter større end to gange den oprindelige axonal kaliber 16. Denne struktur indeholder fragmenter af axonal cytoskelet og komponenter af axonal transport. Axonal hævelse betragtes som en tidlig træk ved axonal neuropati 6,16,17. Imidlertid har 3D analyse af axonale hævelse strukturer ikke blevet rapporteret i litteraturen. Som vist i figur 3, kan 3D-billedbehandling giver vigtig indsigt for axonal hævelse forbundet med PN.
Det er godt karakteriseret, at axonal forgrening ledsager nyttiggørelse fra nerveskade 18. Imidlertidtilgængelige metode til at kvantificere aksonal forgrening er stadig begrænset baseret på 2D-billedbehandling. Som beskrevet i figur 4, kan axonal forgrening blive kompliceret af den bugtede karakter af regenererende nerver. Følgelig kunne forgreningspunkterne blive sløret af nærliggende nervetråde til at påvirke nøjagtigheden af kvantificering. Den 3D-billedbehandling analyse af vores protokol giver forbedret visualisering for oplysninger om de forgrenede nerver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Tilskud K08 NS061039-01A2, Programmet for Neurology Research & Discovery og The A. Alfred Taubman Medical Research Institute ved University of Michigan. Dette arbejde brugte Morfologi og Image Analysis Kernen i Michigan Diabetes Research og Training Center, finansieret af National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 fra National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme. Forfatterne vil gerne takke Robinson Singleton og Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donation af humane hud prøver at støtte den indledende udvikling af nociceptive biomarkør immunhistokemi teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
