Summary
心室の脳脊髄液（CSF）は、胚の初期に脳の発達の間に神経上皮および大脳皮質前駆細胞を浸す。ここでは、その生物学的機能を調べるために、異なる年齢の齧歯類の胚から心室CSFを分離するために開発された方法を説明します。加えて、我々は我々の大脳皮質植郭清および培地またはCSFの最小限のボリュームで外植片の成長を可能にする培養技術を実証する。
Abstract
CSFは、開発全体と成人期の動的に変化するプロテオームを持つ複雑な流体である。胚発生時には、発生期のCSFは前方神経管の閉鎖時に羊水から区別します。 CSFのボリュームは、神経上皮前駆細胞は脳室と脈絡叢生成CSFを裏打ちするように、その後の日にわたって増加します。発達中の脳や脊髄の神経幹細胞の胚CSFの接点は心尖、心室表面。 CSFは脳の発達の拡大のための重要な流体圧を提供し、時間的に特異的に神経前駆細胞への促進因子の重要な成長を配布しています。 CSFの機能を調べるためには、血液や開発終脳組織からの汚染なしに胚CSFの純粋な試料を分離することが重要です。ここでは、使用することができる胚性心室CSFの比較的純粋な試料を分離するための技術を説明質量分析、タンパク質電気泳動し、細胞と一次移植片培養を含む実験アッセイの広い範囲。我々はメディアやCSFの減量化量を使用した開発皮質組織を成長させるために多孔質ポリカーボネート膜上に皮質の外植片を分析し、文化する方法を示しています。この方法では、実験は標的細胞上のプロテオームCSFの生物活性を調べるために、さまざまな年齢や条件からCSFを用いて行うことができる。
Introduction
CSFは開発上皮1-6を浴びると脳の発達のために8月12日手がかりを推進不可欠圧力7と成長を提供する複雑な流体である。脳の発達の過程でCSFを勉強するために、我々は6,9開発のさまざまな段階でラットやマウス胚の開発から心室CSFを単離するための技術を開発した。分離する従来の方法は、ガラスマイクロ針を使用し、マイクロインジェクター1,2を使用して脳脊髄液を分離する含まれています。我々の手法は、その先端の改善組織浸透のための超ポイントを作成するために引き出されたガラスマイクロキャピラリーピペットを使用しています。ガラスマイクロキャピラリーピペットは、その心室CSFのコレクションはプレッシャーの中で穏やかに変化を制御することができるように吸引器に接続されています。 CSF信号の幹細胞の影響を調べるために、我々は、大脳皮質の外植片を解剖ポリカーボネート膜の上に置き、適切なCUの上に浮くlture媒体は、CSF試料9を補った。この手法では、メディアの減量化量は、CSF 9の効率的な利用を可能にする、文化組織をするのに十分である。
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Protocol
1。胚アイソレーション/準備
この手法は、マウスやラットのために使用することができます。このプロトコルでは、CSFの収集テクニックやマウス胎児脳と大脳皮質植郭清術を実証する。我々は一般的な手法の中に存在ラット対マウスの任意の重要な相違点についてコメントします。胎齢ステージングシステムでは、E1がラットのプラグの日のように分類されており、E0.5、マウスのプラグの日として分類されます。
- シルガードシリコーンエラストマーと顕微解剖皿を準備します。シルガード184シリコーンエラストマーは、2つの部分の液体成分は、パートとパートBパートAおよびパートBとして供給されている重量又は体積で10:1の比率で混合される。液体成分が混合された後、皿の全面を覆うようにペトリ皿にSYLGARDエラストマーを注ぐ。いくつかの気泡が硬化プロセス中に放散され存在していてもよい。上のシャーレのふたを置き、elastomを許可ERは、治すために。エラストマーは、24時間、またはそれ以上の温度（ 例えば 37℃）で速く硬化、室温で硬化させることができる。液体成分が固化したら、解剖皿を使用する準備が整いました。皿は、それが手順に従ってきれいに掃除されていれば、複数の実験のために繰り返し使用することができます。
- マイクロキャピラリーピペット（針）の調製。マイクロキャピラリーピペットは熱を加えることによって調製し、以下の設定でナリシゲPC-10垂直マイクロピペットプラーを使用してプルされています：ワンステッププル;ヒーター＃2 58に設定され、100グラムプル重量。マイクロピペットの細い先端を慎重に罰金55位鉗子を使用してオフにスナップされます。針の結果として、平均内径が85μmである。
- CSFの吸引用吸引器アセンブリを準備します。キャピラリー針にマイクロキャピラリーピペット付属マイクロプランジャーを挿入します。あるいは、Tに接続されているアスピレータチューブアセンブリの端にプラスチック製の使い捨てフィルターを取り付けるマイクロキャピラリーピペットをO。アスピレーターアセンブリの反対側の端の位置にガスケットを介して針を押し込みます。
- ごみからシルガードで調製顕微解剖皿に分離胚を転送します。
- 胚が明確に露出するように胚外膜や組織を削除します。各組織層初の子宮壁、次に脱落することができますが、細かい虹彩切除はさみ（ すなわちファイン科学ツール＃15000から02）を用いて解剖することができます。各移植部位で、最初の子宮壁は、脱落膜が子宮の長軸に平行に切開することができ、切開をして微鉗子を使用して、さらに開くことができます。脱落膜は胎児膜を露出させ、同様の切開後に除去することができる。ケアは、胎膜を切開または穿刺しないように注意が必要である。
- 無菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し、ピペットと同様キムワイプまたはフィルタを使用して周囲の胚から余分な水分を取り除く本稿では、三角形に切る。
2。心室CSFのコレクション
- 解剖顕微鏡下で胚を可視化：マウスでは、胚は、1つは、発生中の胚のサジタルビューを有するように、その側に敷設する必要があります。ラット胚E16以前で、頭蓋から尾の方向に、その最長の平面寸法に沿って、その背脊柱に胚を置き、胚はその背中に横たわっているかのよう。このようにしてCSFは、左右両方の側脳室から収集することができる。
- 着実にピペットが挿入された後に神経上皮細胞と接触しないようにしようと、側脳室、脳室、または大槽にマイクロキャピラリーピペットを挿入します。マウス胚E14.5以上では、CSFは、右心室から吸引してから針を外し、左心室に挿入することができます。 E14.5より若い胚における心室と神経管の開存のため、全体CSFのボリュームは、多くの場合、単一の針挿入と側脳室から吸引することができる。接続心室の発育時間と開通が若干異なる場合がありますので、マイクロキャピラリーピペットも最大CSFの体積を収集するために大槽に挿入することができますしかし、これは必ずしもそうではありません。
- 一度マイクロキャピラリーピペットを負圧を作成し、CSFを吸引するために、マイクロプランジャーのいずれかを使用して、ピペット内に髄液を吸引し始める慎重に、ゆっくりと、側脳室、脳室、または大槽内に挿入され、または提供することにより、 CSFは優しくゆっくりと制御された方法でマイクロキャピラリーピペット流れ込みを始めるように口の中で作成された穏やかな負圧。私たちは、視聴者がこれらのアプローチに向けての施策に関する自国の当局者と確認することをお勧めします。
- 負圧を適用し、マイクロキャピラリーピペットにCSFを収集し続けています。E16.5/E17または年下のマウスおよびラットの胚の両方では、それは、マイクロキャピラリーピペットが古い胚ではインチであることを頭の側面に形成ディボットの出現によって若干心室崩壊を観察することができる脳の大きなサイズに起因し、それが崩壊頭部を観察することができない場合があります。
- 圧力をかけて停止し、静かに側脳室からマイクロキャピラリーピペットを削除します。
- 穏やかに氷上で冷却されたエッペンドルフチューブにCSFサンプルを追放。
- 動物やプールの全リター試料同一チューブ内からCSFを集め続ける。
- どんな汚染細胞を除去するために10分間、4℃で10,000×gで遠心分離します。
- 神経上皮細胞や赤血球を汚染の兆候のためのサンプルを分析します。汚染の兆候は、通常、血液を帯びたスポットで曇りまたはピンク/赤、またはペレットの存在が登場する流体によって示されます。遠心分離した後に、CSFは、細胞または細胞の残骸の証拠について顕微鏡分析することができます。汚染の兆候がある場合、流体は捨てられるべきです。追加制御方式として、ペレットのコンテンツは、また、細胞のために染色することができる。クリーンCSF試料は、細胞培養、皮質培養、分析、ウェスタンブロット、ELISA、および他のアッセイに使用することができます。明確なCSFは新しい滅菌エッペンドルフチューブに転送する必要があります。サンプルは現在、液体窒素で凍結した他のサンプル、またはスナップをプールし、-80℃で保存し、分析に使用することができる流体の微小サンプルの凍結融解は小さな体積減少とタンパク質濃度の変化をもたらすかもしれません。これは、試料を凍結乾燥することによって回避できます。
3。皮質植解剖
- シルガードで調製顕微解剖皿にごみから分離されたE14.5胚を転送します。
- ステップ1.5で説明したように胚外膜や組織から胚を取り出します。 <LI>無菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し、ピペットを用いて周囲の胚から余分な水分を取り除く。
- 胚の残りの部分（ 図1A）からヘッドを分離頸部を通して解剖する。
- 細かいメス（眼科ナイフ）を使用して、頭皮の正中線を切り倒した。細かい鉗子でこの切開の両側をつかみ、皮膚を取り除きます。次に、現像頭蓋の正中線の長さを実行して切開を作るために虹彩切除術のはさみを使用しています。その後、発展途上頭蓋骨の前部と後部の両端から2追加の切開、距離の約1/3を加える。解剖のこの部分から生じる頭蓋の"フラップ"を把握するために細かい鉗子を使用しており、皮質（ 図1B）を露光、現像頭蓋骨組織を除去する。
- 左右の皮質半球（ 図分離半ば、矢状面で正中線に沿ってメスを二分の脳を使用して1B、C）。軟膜とクモ膜は皮質に取り付けたままであり、硬膜を開発頭蓋骨と一緒に削除されます。
- 個別皮質半球を準備します。あなたは神経節隆起と途上皮質（ 図1C、D）を見ることができるように半球の内側面を上にして置きます。
- メスを用いて、開発して嗅球へ尾皮質上皮を通して冠状切開を行います。この切開は横方向と内側神経節隆起の前方境界から始まり、開発皮質原基（ 図1E）の前帯状領域を介して拡張する必要があります。
- 横神経節隆起（ 図1F）の後方境界にちょうど尾別の冠状切開を加えます。この切開は、途上皮質原基の内側壁に神経節隆起の側面境界から拡張する必要があります。
- 皮質の "フラップ"クレアを撤回皮質に機械的な損傷を避けるために、200μlのピペッターに付属のHBSSストリームからメスまたは穏やかな圧力を使用して、手順3.7と3.8で作られた2つの切開によってテッド。その後開発皮質（ 図1G、H）から横神経節隆起を隔てる境界に沿って横切開を行います。その後、横皮質表面は半球間の壁を満たして新皮質の頂点で、開発海馬や内側終脳の皮質の裾を離れ解剖。
- 開発皮質（ 図1H）から横神経節隆起を隔てる境界に沿って横切開を加えます。
- 解剖した皮質の外植片からシルガードプレート上にある任意の余分な解剖組織を除去する。一つは余分な解剖組織を離れてピペットに新鮮なHBSS緩衝液を用いて穏やかにピペッティングを使用することができます。解剖皮質は下向きに髄膜側（ 図1I）となりました。
- ガラスピペットに接続されている白金線ループを準備します。ガラスピペットの最後に挿入され折りたたまれた白金線でガラスピペットを熱し。白金線ループの終わりをねじることによって、ループの大きさが増加または減少しており、ループは、所望の外植片のサイズに合うように成形することができることができます。 （これは、予め用意して再利用できます。）
- ループを殺菌するために白金線の先端を加熱します。
- 解剖皮質外植片を分離し、ワイヤーループで使用する少量を残して、穏やかにピペッティングすることにより、余分なHBSSメディアを取り出します。
- 直径4cmイメージング皿1cmのポリカーボネート膜を置きます。
- 髄膜側が上を向いているように、白金線ループの側を使って、優しく皮質を反転させます。
- ループの途中で外植片を置き、に固有の静水圧の力を使用することによって、解剖皿オフ皮質外植片を持ち上げ平面上の外植片を持ち上げます。
- 優しくポリカーボネート膜上に外植片を置き、離れて外植片は、心室表面が膜に接触することによる平面上の膜の上に残るように白金線ループを持ち上げる。
- 優しく膜を持ち上げ、膜の下CSFまたは他のメディア、50μlのピペット。
- イメージング皿をカバーし、継続的な細胞増殖と植片の成長をサポートするために、24時間、5％CO 2で加湿二次容器に入れ、37℃でインキュベートする。 図2は、最終皮質植皿の準備の概略図を示している。
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Representative Results
CSFのコレクションは明確で、透明な液が得られるはずです。吸引とエッペンドルフチューブで、赤または黄色を帯びた流体によって実証されるように、血液からの汚染の証拠があってはなりません。また吸引とエッペンドルフチューブ内の組織の証拠があってはなりません。 CSFは遠心分離された場合、1はまた、汚染がないことを確実にするために顕微鏡CSFを評価することができます。汚染の兆候がある場合には、CSFは捨てられるべきです。 1 E14.5マウスごみから、1つは10から15μlのCSFを集めて予測することができます。 表1さまざまな胚年代から、マウスとラットの両方で平均リターサイズから収集されたCSFの平均的なボリュームを表しています。純粋CSFサンプルが収集されたときに、CSFは多数の異なる技術を用いて分析することができる。 図3は、マウスE14.5 CSFの2UGを使用して代表的な銀染色ゲルを示す。
大脳皮質外植片はウィットを成長させることができるhは、CSFのボリュームに加え、基礎培地全量が50μlであるように、必要に応じて変化する。 図4は、24時間100パーセント胚CSFの50μlの成長代表植片を示しています。外植片を生き残るために示されており、100％CSFで増殖し、同じ妊娠9歳時、げっ歯類の胚に似た組織の組織像を持っている、などの心室に沿っホスホヒストンH3（PH3）、細胞分裂のマーカーに対する免疫反応により示されてい表面、BrdUを、開発皮質板のDNA合成、脳室帯に沿って取り込み、Tuj1、神経マーカーのマーカー。
| のSprague Dawleyごみ胚年齢 | 一腹当たりの体積 | CD1ごみ胎齢 | 一腹当たりの体積 |
| E13 | 30〜50μlを | E10.5 | 15から20μlを |
| E14 | 40から75μlを | E12.5 | 15から20μlを |
| E16 | 50から90μlを | E14.5 | μlの10月15日 |
| E18 | 40から75μlを | E16.5 | 5〜10μlの |
表1：標準サイズの同腹から取得したCSFの平均ボリューム。
図1。大脳皮質植郭清をアウトライン概略図。
図2。ファイナル皿の準備の概略図。
図3。シルバーはマウスE14.5 CSFの染色。これはインビトロジェン4から12パーセントのBis-Tris NuPAGE勾配ゲル上で実行2UGマウスE14.5 CSFタンパク質の染色代表シルバーです。銀5分40秒のために開発さSilverQuest銀染色キットで行わ染色。
図4。 24時間成長させ、E15ラット皮質外植片は、これらの100パーセント胚CSF中の24時間成長させ大脳皮質外植片の代表画像です。これらの外植片をカルノア方法、パラフィン切片で固定されており、免疫染色のために準備されている。 PH3（赤）、Tuj1（緑）、BrdUを（青）。
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Discussion
心室CSFの収集のための記載の方法は、細胞アッセイ9の数は安定したタンパク質組成と一貫性のある活動と胚CSFの比較的純粋な試料が得られている。良いコレクションのテクニックと10 E14.5マウスの産仔数と、1は、CSFの10から15μlを集めることを期待することができ、およびE16ラットのごみから、1は、CSFの50〜90μlのについて収集することが予想されます。このコレクションのテクニックは注意深い観察、遠心分離し、細胞破片や血液色合いの証拠を有するサンプルを捨てることによって、血液や組織からの汚染を最小限に抑えることができます。我々は、遠心分離後の脳脊髄液内細胞の破片やセルに対して評価する微視的流体を分析し、遠心分離後に全くペレットを持っていないサンプルは、携帯汚染から自由であることを発見した。発達中の脳組織のプロテオームへまたはCSF抽出のこの方法を使用して汚染されたCSF（データは示さず）のサンプルとは対照的に、質量分析計を用いて分析したときに6 CSFのプロテオームは、どのミトコンドリアのタンパク質が含まれていませんでした。
終脳胞と神経管の中の心室CSFの物理的なローカライズに基づいて、分離する唯一の方法は、発展途上皮膚、頭蓋骨、および終脳を貫通することです。したがって、これらの組織を介し針挿入が可能な汚染のソースです。針の先端は、針が組織を通って心室にスムーズに挿入することができるように、できるだけ細身でなければなりません。マイクロキャピラリーピペットは、心室への針の挿入中に針の穴の中に組織を収集することがあります。胚の年齢に応じて、脈絡叢は脳内で開発されている場合、それはピペットに脈絡叢の中身を吸引しないことが重要です。しかし、CSFはtに収集するような十分な負圧を作成しておくことが重要です彼は周囲の開発脳組織または脈絡叢を乱すことなく、ピペット。組織汚染の存在は、ガラスカバースリップとスライドガラス上にCSFをピペッティングし、直接細胞の破片のために視覚化することによって、解剖顕微鏡下で可視化することができる。
我々が現在までに決定したとして我々はCSFの単離のために記述するメソッドは、CSFの比較的純粋なサンプルを提供する。知られている汚染されたCSFサンプルを質量分析法を用いて分析されている場合、それらはミトコンドリアタンパク質（データは示していない）の存在が明らかになった。技術に内在する欠陥は、CSFが開発頭蓋骨と皮質を穿孔して得られることであるので、細胞や組織は、CSF中に存在してもよい。 、CSFを遠心分離し、ペレットをアッセイし、顕微鏡顕微鏡下で髄液を分析することによって、我々は、CSFの比較的純粋なサンプルを得CSFの単離のための方法を最適化している。
技術のfまたは心室胚CSFの収集および大脳皮質外植片を説明し、マウス胎児のために映画の中で示されている。しかし、この技術は、すべてのげっ歯胚から心室CSFの収集と大脳皮質の外植片に使用することができますし、ラットとマウスの両方に適用されています。このプロトコールに記載された方法は、心室CSFの単離のために特別に設計されており、くも膜下腔におけるCSFの収集のために意図されていません。
大脳皮質外植片のための技術は、メディアの量を減らした外植片とを成長させることができるように作成された個々の実験のために利用できる胚CSFの限られた量を与えられた。 24時間確実に植体を成長させるために使用される媒体の最小体積は50μlであった。時折、外植片を72時間であるの最長期間で、より長くて24時間培養した。もはや実験と、それが増殖培地ごとに24時間を補完するのが最善です。一度外植AReは、所望の期間培養し、外植片は神経球、細胞死、またはRNA抽出を生成し、免疫蛍光を含む様々な多くのアッセイに使用することができます。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、NIH（受賞番号MKLにR00 NS072192、HD029178 AS.L.に、2 RO1 NS032457 CAWまで）からの支援に感謝しています。 MKLは、チルドレンズホスピタルボストンキャリア開発フェローシップ/ハーバードメディカルスクールショアフェローシップとアルフレッド·P·スローン財団のフェローの受賞者です。 CAWのは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者でもある。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
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