Summary
Detta protokoll beskriver utveckling, expansion och in vivo-avbildning av NK-celler härledda från hESCs och iPSCs.
Abstract
Vi presenterar en metod för att härleda naturliga mördarceller (NK) celler från odifferentierade hESCs och iPSCs med en feeder-fri tillvägagångssätt. Denna metod ger upphov till höga nivåer av NK-celler efter fyra veckors odling och kan genomgå ytterligare två-log expansion med artificiella antigenpresenterande celler. hESC-och iPSC-härledda NK-celler som utvecklats i detta system har en mogen fenotyp och funktion. Produktionen av ett stort antal genetiskt modifierbara NK-celler är tillämplig för både grundläggande mekanistiska samt anti-tumör studier. Uttryck av eldflugeluciferas i hESC härledda-NK-celler gör att en icke-invasiv metod för att följa NK cell engraftment, distribution och funktion. Vi beskriver också en dual-imaging system som möjliggör separat kontroll av två olika cellpopulationer att tydligare beskriva deras interaktioner in vivo. Denna metod för härledning, expansion, och dual in vivo imaging ger en tillförlitlig metod för att producera NK-celler och deras utvärdeation som är nödvändig för att förbättra nuvarande NK cell adoptiv terapier.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är odifferentierade, pluripotenta celler som kan obegränsat självförnyelse och flera härstamning differentiering. hESCs har framgångsrikt differentieras till mogna och funktionella undergrupper av varje GRODDBLAD, inklusive celler i hematopoetiska systemet 1-3. Naturliga mördarceller (NK) celler är lymfocyter i det medfödda immunförsvaret som kan härledas från hESCs genom bildning av embryoidkroppar (EBS) 4,5 eller samodling med stromacellinjer 1,2,6-8. NK-celler har anti-virala och anti-tumör kapacitet och har potential att vara effektiva mot ett brett område av maligniteter, eftersom de inte kräver tidigare antigen stimulering för att utföra sina effektorfunktioner. Således hESC-derived NK-celler är en attraktiv källa till celler för immunterapi. Dessutom ger härledningen av NK-celler från hESCs ett genetiskt mottaglig system för att studera normal utveckling <em> in vitro.
Eftersom de ger en genetiskt foglig system kan hESC-derived NK-celler experimentellt modifieras för att uttrycka fluorescerande och bioluminescerande reportrar ger en optimal modell för att studera NK cell effektorfunktioner in vitro och in vivo. hESC-härledda NK-celler uppvisar aktivitet mot en rad mål inklusive HIV 9, leukemi (K562) och andra typer cancer 7,8. Men förmågan härleda tillräckligt effektivt NK-celler med förmåga att behandla patienter förblir ett viktigt hinder för klinisk översättning och är, i mindre grad, en begränsning för omfattande prekliniska in vivo-studier av NK-cell utveckling och anti-cancer-funktioner. Här använder vi en metod spin EB att härleda hematopoetiska stamceller från hESCs 4,5,10. Efter 11 dagar av spin EB överförs till NK-cell kultur med eller utan matare för 28 dagar. Efter 4 veckor i NK cellodlingsmedium, NK-celler är transferred till samodling med K562-celler modifierade för att uttrycka membranbundna interleukin 21 (IL-21), som fungerar som konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs). Att anpassa ett protokoll för utbyggnaden av perifert blod NK-celler med dessa artificiella APC 11,12, kan vi utöka NK-celler 2-stockar och samtidigt behålla en mogen fenotyp och cytotoxiska kapacitet.
Denna process av utveckling och expansion ger tillräckliga hESC-derived NK-celler för omfattande in vivo karakterisering. För in vivo-studier, har vi möjlighet att icke-invasivt övervaka långsiktigt engraftment och kinetik av injiceread eldflugeluciferas som uttrycker (Fluc +), hESC-derived NK-celler med hjälp av bioluminescens avbildning. Dessutom har vi möjlighet att följa NK cell interaktioner med tumörceller med en dubbel, bioluminiscent eller fluorescerande imaging system. En tidigare studie från vår grupp används mareld avbildning i en anti-tumör modell att följa tumörprogression och cleArance av Fluc + K562-celler in vivo 7. Nu, genom att iscensätta våra hESCs att uttrycka eldflugeluciferas 13,14 vi kan följa biofördelningen och trafficking av NK-celler till K562 tumörceller som uttrycker sistone präglats fluorescerande protein, turboFP650 15. Vi har valt detta dubbla reportersystem för att samtidigt följa de två cellpopulationer in vivo (Figur 1). Mest dubbla imaging modeller har dual-luciferasenheter system, men dessa system kan tekniskt utmanande på grund av leveranskrav för coelenterazin, underlaget som krävs för uttryck av de flesta Renilla och Gaussia luciferas reportrar 16-18. Fluorescerande reportrar har tillåtit enkel övervakning av många cellinjer och konstruktioner in vitro, men har haft begränsad framgång för in vivo imaging grund av överlappningen mellan vävnad och päls autofluorescens och emissionsspektra för många commonly används fluorescerande reportrar inkluderande GFP, DsRed, och tdTomato 15,19. Denna oro har uppmuntrat utvecklingen av långt-röda fluorescerande proteiner, som möjliggör bättre vävnad penetrans och högre specifik signal jämfört med bakgrunden 15,19. TurboFP650, det fluorescerande proteinet som visas i detta system är långt-rött skiftat och övervinner många av de frågor som med avbildning fluorescerande proteiner i levande djur.
Denna metod för att utveckla och expandera NK-celler som härrör från hESCs har tillåtit oss att ytterligare karakterisera hESC-derived NK-celler in vitro och in vivo, vilket är nödvändigt för att bättre förstå NK cellernas funktion och kliniskt viktigt att förbättra nuvarande NK cell adoptiv terapier. Det är också mottaglig för härledning och expansionen av iPSC-härledde NK-celler. Den dubbla lysrör och självlysande avbildning system är brett tillämpbar för andra system än den anti-tumör modell vi har visat här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Anpassning hESCs eller iPSCs i TrypLE för Spin EB Cultures
- Den initiala dissociation med TrypLE fungerar bäst om ES / iPS kolonier från kollagenas-passerade kulturer är relativt små. Utgångspunkten ES / iPS populationer bör cellerna gått längre än 4-5 dagar tidigare. 4-5 dagar innan behandling med TrypLE passage, passerar ES-celler vid en densitet som gör att cellerna att vara ~ 70% sammanflytande i 4 dagar. Använd vanliga ES medier för odling av TrypLE-passerade ES-celler. Här använder vi hESCs stabilt modifierade med en luciferasrapportör konstruktion (Material tabell). Protokollet arbetar också med iPSCs, med omodifierade iPSCs för jämförelse av hematopoetisk stamcellstransplantation och NK cell utveckling.
- Fyra dagar innan initiering av TrypLE passage, passerar ES / iPS-celler med kollagenas IV, efter en normal passage protokoll. Vi passerar vanligtvis 1:01 i den första passagen med TrypLE. Expandera ES / iPS-celler i enlighet förväg.
- Försiktigt plocka bort differentierade kolonier (de som saknar en avgränsad kant eller har fibroblastiska / epiteliala egenskaper) innan du fortsätter till TrypLE dissociation. Differentierade celler kan ta över kulturen relativt enkelt med TrypLE passage, så det är viktigt att se till att din start befolkningen är mycket ren.
- Aspirera media från brunnar och tillsätt 1,0 ml förvärmda TrypLE Välj per brunn.
- Inkubera ES / iPS-celler i TrypLE för 5 min i en 37 ° C inkubator. Efter 5 min, försiktigt pipett ES-celler från botten av brunnen.
- Samla TrypLE cellsuspension från brunnar och överför till en konisk tub. Pipettera upp och ner GEntly 2-3 gånger för att uppmuntra de största klumparna att bryta isär. Späd TrypLE med minst en lika mediavolymen ES och en lika DPBS volym. TrypLE icke utsläckes av odlingsmedia, så det är viktigt att späda TrypLE med medier och DPBS efter avlägsnande celler från plattan. Vi använder DPBS + media för tvättar att spara ES media.
- Centrifugera ner cellerna vid 1500 rpm under 5 min i kyld centrifug (8 ° C).
- Sug bort så mycket av supernatanten som möjligt för att avlägsna TrypLE.
- Resuspendera cellerna i 4 ml ES media plus 4 DPBS ml och upprepa spinn för att bli av kvarvarande spår av TrypLE.
- Sug bort supernatanten och återsuspendera i lämpliga medier volym ES för plätering.
- Plate ES-celler 01:01 (eller 02:01 om det behövs) på låg-density MEF i ES media.
- Efter 24 timmar, mata cellerna med färska ES media. Det kommer sannolikt att finnas många enskilda celler som inte fäster. Feed ES-celler dagligen med ES media.
- Väl TrypLE på färsk MEF (0.9-1 x 10
- För de första kanalerna (upp till passage 5-10), kommer cellerna att kräva passerar vid 01:01. Detta möjliggör expansion av celler svårt. I vår erfarenhet, utstrykningseffektivitet av ES-celler sjunker dramatiskt runt passager 4-5 och sedan kommer tillbaka upp inom ett par passager. Efter passager 5-7, kanske du kan börja passera cellerna vid 01:02, och slutligen, 01:03. Bortom kanalen 20, kan du behöva börja passera cellerna vid 1:05 eller 1:06. Se till att plätera de ES-celler vid en hög täthet de första 5 till 10 passager. När du kommer till en punkt där cellerna plattan ner tillräckligt effektivt att de kan nå ~ 70% sammanflödet inom två dagar efter passagen, kan du prova att starta passerar vid 01:02, och så småningom ska kunna passera vid 1:03 eller 01:04. iPSCs, i synnerhet, om inte passera tätt nog innan fullt endapted, tenderar att differentiera.
2. Förbered Lager Lösningar för Konfigurera kulturer Spin EB
- 10% BSA-lösning i IMDM: Suspendera 4 g BSA i 35 ml IMDM (i en 50 ml konisk). Låt lösningen stå vid rumstemperatur under 1-2 timmar för att tillåta BSA till fullständig upplösning. Justera totala volymen till 40 ml med IMDM att få slutlig koncentration av 10%. Kommersiellt tillgänglig BSA kan vara cytotoxiska för ES-celler. Deionizing lösningen kan minska potentialen för cytotoxicitet. Att deionize, lägg ~ 1.3 g hartspärlor till 40 ml BSA-lösning och skaka väl att blanda.
- Placera BSA-lösning (med hartspärlor) vid 4 ° C tills pärlor ändra färg från blå-grön till gul (vilket indikerar att utbytet kapacitet är uttömd).
- Skaka lösningen var 20-30 min för att underlätta utbytet
- Varje utbyte kan ta upp till 2 timmar. När utbytet är klar, centrifugera lösningen under 2 min vid 1000 rpm för att pelletera pärlorna i botten av röret.
- Pipette BSA-lösning i en ny 50 ml konisk och att lämna pärlor som skall kasseras.
- Upprepa steg 2,2-2,5 åtminstone två ytterligare gånger för totalt tre eller flera utbyten. Under det sista bytet kan kapaciteten av pärlorna inte helt konsumeras även efter två timmars inkubering med pärlorna.
- Sterilfiltrera BSA-lösning och ta bort eventuella återstående pärlor.
- Den BSA-lösning måste vara stabil vid 4 ° C under minst två månader.
- 5% PVA-lösning: Mät 100 ml Millipore H2O i 125 ml glasflaska.
- Tillsätt 5 g PVA till vattnet. Det är viktigt att lägga till PVA till vattnet så att PVA blir helt "blöt". Om du lägger till vatten till PVA, kommer det att ta mycket lång tid för PVA att gå i lösning.
- PVA löses inte upp omedelbart. Place PVA / vatten-lösning vid 4 ° C över natten.
- Nästa morgon, plats PVA / vatten-lösning i 37 ° C vattenbad under 4-8 timmar. PVA ska vara mestadels i lösning vid slutet avinkubationen.
- Placera flaskan tillbaka i 4 ° C under ytterligare 24-48 timmar, eller tills den är helt upplöst. Lösning kan vara något trögflytande.
- PVA-lösningar bör vara stabila vid 4 ° C i minst 6 veckor.
- Linolsyra och linolensyra (10.000 x lösningar): späd till 1 mg / ml i 200-proof etanol. Tillsätt 10 ml ren olja till 10 ml etanol. Fördela och förvara vid -20 ° C.
- α-MTG lager lösning: Späd 13 l α-MTG i 1 ml IMDM.
- Askorbinsyra 2-fosfat-lösning (100X): Gör en 5 mg / ml lösning. 250 mg askorbinsyra 2-fosfat i 50 ml sterilt, vävnads-kultur klass H 2 O. Löser sig lätt.
Tre. Montering av BPEL Media (till ~ 200 ml total volym)
- Gör en PVA-lipider blandning (detta steg förhindrar PVA från att bilda olösliga droppar i mediet som skulle få filtreras bort).
- Tillsätt 20 ml IMDM och 20 ml F-12 näringsblandning till 50ml koniska rör.
- Tillsätt 10 ml 5% PVA lager, 0,4 ml synthechol, 20 | il linolensyra, och 20 | il linolsyra för 200 ml BPEL media. Skaka tuben väl för att blanda. Ställ åt sidan medan andra medier komponenterna är sammansatta.
- Lägg alla återstående mediekomponenter till toppen av 250 ml Stericup filtrering enhet. Lägg balansen av erforderlig IMDM-och F-12 volymer (66 ml vardera), BSA, en-MTG, 100X ITS, Glutamax I, Pen / Strep, proteinfritt hybridom blandning II, och askorbinsyra. Tillsätt PVA-lipider blandningen från steg 1 till den övre delen av Stericup. Filtrera mediet. Medium ska vara stabilt vid 4 ° C under minst två veckor. Använd gamla medium för tvätt steg.
4. Konfigurera TrypLE-passerade ES-celler i steg I Spin EB
Använd ES / iPS-celler som har anpassats till TrypLE passage på lägre densitet MEF (dvs. ES / iPS-celler som har passerats med TrypLE minst 5-7 gånger). Om celler kan passera vid ~ 1:03 och bli 70-80% sammanflytande i 3-4 dagar, Bör cellerna vara bra att använda.
- Två dagar innan inrätta differentiering Spin EB (dag -2): Pass TrypLE-anpassade ES / iPS celler på färsk MEF vid en densitet ger dem möjlighet att vara 70-80% sammanflytande på dagen för differentiering setup. Vi passerar vanligtvis 48 h före Spin EB setup.
- Day of Spin EB Setup i steg I Differentiering (dag 0): Att förbereda för Spin EB plätering, pipett 150 ul sterilt vatten in i de 36 yttre brunnarna i varje 96-brunnar för att minimera avdunstning. Använd rund botten, låg fästpunkt 96 brunnar bara.
- Aspirera odlingsmedier av av ES / iPS-celler och tillsätt 1,0 ml förvärmd TrypLE Välj till varje brunn.
- Placera plattorna i inkubatorn (37 ° C) under 5 min. Försiktigt pipettera celler bort av plattan.
- Samla dissocierade celler i ett koniskt rör och pipettera upp och ned för att bryta sönder klumpar. Späd TrypLE med en lika mediavolymen BPEL och minst en lika DPBS volym.
- Avlägsna supernatanten och suspenderaceller i 5 ml BPEL media plus 5 ml DPBS. Upprepa spinn.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i 5-10 ml BPEL media, beroende på förväntad mobilnummer. Passera celler genom 70 pm filter (BD Falcon # 352.350) i en färsk 50 ml konisk för att avlägsna klumpar (som kan störa EB bildning).
- Räkna filtrerade celler. Alikvotera celler som skall användas för plätering i en 50 ml konisk och spinn. För plätering: 3000 ES-celler / brunn, 60 brunnar / platta = 1.8x10 5 ES-celler / platta.
- Efter centrifugering, kommer celler behöva resuspenderades till 3x10 4 celler / ml (100 | il volym / brunn, 3000 ES-celler / brunn).
- Förbered en volym av BPEL medier + cytokiner tillräckliga för resuspending cellerna (detta kommer att vara 6 ml / platta). För steg I differentiering, använder vi SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml) och VEGF (20 ng / ml) för härledning av hematopoetiska progenitorceller.
- Plate 100 | il celler / brunn (= 3000 celler / brunn) i var och en av de inre 60 brunnarna i beredskapened 96-brunnars plattor. Detta är lättast när du använder ett multikanalspipett och steril tråg. Var noga med att blanda celler genom att pipettera innan i tråget och arbeta snabbt så att cellerna inte har en chans att lösa ut.
- Snurra de 96-brunnsplattor i kyld centrifug under 4 min vid ~ 1500 rpm, 8 ° C.
- Försiktigt överföra plattorna från centrifug till 37 ° C inkubator. Undvik att störa plattorna så mycket som möjligt. Kontrollera plattorna för att säkerställa att cellerna bildade enhetliga pellets i botten av brunnarna.
- Steg I spinna EB inte ska ges eller på annat sätt störs genom dagarna 3-4 differentiering tills EBS har bildat ett mer hållbart yttre skikt. Om EB blir kvar i steg I mer än 10-12 dagar, matar vi ibland EB med 50 l färska BPEL media med cytokiner till varje brunn (först ta ut 50 il gamla medier från varje brunn). Inom 24 timmar, bör cellerna börjar bilda en 3-D EB struktur, och vid dag 3-5 bör ha en distinkt yttre skikt, och börja utveckloping cystiska strukturer.
Fem. Dissociering Steg I EB för FACS Analysis
Samla around18-36 spinn EB för FACS-analys. Om analys av celler före dag 6, fler brunnar behövs för att få tillräckliga cell nummer.
- Förbered nödvändiga volymen av trypsin med 2% kyckling serum. Placera i 37 ° C vattenbad fram till användning.
- Överför spin EB och media från 96-brunnar till 15 ml koniska rör.
- Låt EB sjunka till botten av koniska rör. Med en 5 ml pipett försiktigt pipettera ut supernatanten och överför till en separat rör (du kan samla alla av supernatanten till en 15 ml eller 50 ml koniskt rör). Som vissa hematopoetiska celler har redan släppts från spinn EB mellan dag 9 och 11, separerar supernatanten innehållande dessa celler förhindrar alltför trypsinization.
- Resuspendera EB i trypsin + 2% kycklingserum: 3-4 ml till vardera 15 ml koniska rör. Placera EB med trypsin i 37 ° C Waterbath för 3-7 min. Skaka eller försiktigt virvel varje 1-2 min. Vid tidigare tidpunkter (före dag 8), kommer EBs bryta isär lättare och kan ta så lite som 3 min. Vid senare tidpunkter (dag 8 +) EBS kan ta längre tid att ta avstånd. Vi brukar inte låta dem trypsinize i mer än 5 minuter vid 37 ° C. Obs, dessa tider är bara en vägledning. För någon speciell cellinje eller EB differentiering, kan det ta mer eller mindre tid att dissociera EBS. Noga övervaka dissociation. Det är viktigt att inte lämna cellerna i trypsin för länge. Det är bättre att stoppa trypsin dissociation då endast ett fåtal små klumpar förblir synliga snarare än att försöka eliminera alla klumpar.
- Quench trypsin med åtminstone en lika stor volym av FBS-innehållande media. Centrifugera ner cellerna (1500 rpm, 5 min, 8 ° C).
- Resuspendera cellerna i en lämplig volym av media för räkning (vanligen 3-5 ml).
- Filtrera celler genom en 100 | im cellfilter. Ta bort en delmängd av celler för räkning. Fortsätt med cellertill vanliga lab FACS-protokoll.
6. Utveckling, expansion och karakterisering av NK-celler från HPSC-derived stamceller
Eftersom spin EBs innehåller en hög andel av hematopoetiska progenitorceller, kan de överföras direkt till NK cellkultur på dag 11. Den spin EB kan överföras till plattor med 24 brunnar med eller utan matare. Vi har inte visat någon skillnad i fenotyp eller funktion mellan NK-celler härledda i varje tillstånd. Därför överför vi generellt till odlingar utan matare att ha ett fullständigt definierat system för NK cell utveckling. Om du använder en hESC / iPSC linje med suboptimal hematopoetisk differentiering användningen av matarskikt rekommenderas 7,8.
- Med hjälp av en flerkanalspipett inställd på 100 | il, överföring 6 spin EBS till varje brunn i en 24 brunnars platta.
- Med Matare: överflyttning spin EBS 24-brunnsplattor innehållande 100.000 bestrålade (3000 cGY) EL08-1D2 (en murin embryonic levercellinje) celler per brunn. Utan matare: transfer EBs direkt till obestruket, 24 brunnar.
- Lägg 400 pl NK differentiering media innehållande cytokiner (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, alla från Peprotech) så den totala volymen i varje brunn är ~ 1 ml.
- Placera celler i inkubatorn och foder var 5-7 dag med NK differentiering media innehållande samtliga cytokiner i steg 6.3 utom IL-3.
- NK-celler kommer att uttrycka en mogen fenotyp vid dag 28 efter överföring till NK celldifferentiering kultur (figur 2).
- För att testa NK cell cytotoxicitet, kan en 4 hr kromfrisättningsanalys utföras 8.
- Om ett stort antal celler behövs för in vivo-studier, kan samodling med artificiella antigenpresenterande celler (aAPCs) bildning av en 2-log eller större expansion. För ett detaljerat protokoll, besök http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.
7. In vivo Lysrör och Bioluminescent Imaging för att övervaka hESC-härledda NK-celler och tumörceller i möss med immunbrist
Vi använder nonobese diabetiker / svår kombinerad immunbrist med gamma-kedjan knockout (NOD / SCID / γC - / -) möss som är 6 till 8 veckor gamla i alla våra experiment. Vi använder en dubbel imaging modell för att samtidigt spåra tumörprogression (turboFP650 reporter) och hESC-NK-celler kinetik (Fluc reporter uttrycks i celler förälder ES) in vivo. Denna avbildning system är brett tillämpbar för andra system än den anti-tumör modell visas här. Den IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences) är optimal för samtidig lysrör och självlysande in vivo imaging.
- 24 h före tumörcellinjektion, irradiate möss (225-250 cGY).
- Resuspendera önskat antaltumörceller (1 x 10 6 K562 celler visas) i 200 ^ Iscove modifierad Dulbecco medium (IMDM) kompletterat med 20% FBS. Tumörcell dosen kan varieras beroende på den använda modellen. TurboFP650 kunde också uttryckas i icke-tumörtyper. Det är bäst avbildas med celler lokaliserade till en enda anatomisk plats.
- Injicera tumörceller subkutant i den övre vänstra bröstkorgen av mössen med användning av en 27 eller 28 gauge nål och låt inympa i 4 dagar. Celler bör bilda en bubbla under huden på musen. Möss kan rakas i denna del av kroppen för att bättre visualisera injektion. Det visar också att området för bättre in vivo fluorescerande avbildning. Injektion runt bröstkorgen hos mössen användes i denna modell eftersom IP injicerade NK-celler är bäst visualiseras medan musen är liggande. Alternativa metoder för subkutan leverans, inklusive ryggen eller flanken, är mindre stressande för djuret och bör övervägas.
- Resuspendera önskat antal hESC-DeriVed NK-celler (10 x 10 6 NK-celler visas) i 300 l Iscove modifierad Dulbecco medium (IMDM) kompletterat med 20% FBS utan antibiotika.
- Injicera hESC-härledde NK-celler i varje mus intraperitonealt (IP) med en 27 eller 28 gauge nål. För alla experiment, inkluderar möss som fick ingen tumör eller NK-cell infusion som en negativ kontroll.
- För att upprätthålla NK cellpopulationer in vivo, ge möss en 250 pl IP-injektion av IL-2 (1x10 4 U / mus) och IL-15 (10 ng / mus) i sterila DPBS varje dag under de första följt 7 dagar av IL- 2 endast var 2 till 3 dagar tills tiden för avlivning.
- Övervaka inympning av hESC härledda-NK-celler genom bioluminescent avbildning. Injicera varje mus IP med 120 ^ D-luciferin (150 mg / kg). Bild på möss 10 min efter D-luciferin injektion.
- Söva möss med användning av en kammare möjliggör isofluran inträde i rutan vid 0,8 l / min. Kontrollera att det finns också syre flöde in i kammaren.
- Placera sövdamöss i IVIS Spectrum och säkra möss på ryggen med tejp eller kardborrband och tillåta isofluran inträde i rutan vid 0,5 l / min för att upprätthålla anestesi.
- Ställ IVIS maskinen ska korrigera imaging plattform (D för 4-5 möss, C för 3 eller färre möss), som binning till medium, f / stop till 1 och skaffa bilder för 1 min.
- För att utföra fluorescerande avbildning för turboFP650 + celler, använda imaging guiden för att ställa in en emission scan mäta sonden av intresse samt bakgrund signal. Från listan över prober väljer Input Em / Ex, och skriv in korrekt excitation och emission. För turboFP650, använd 605 excitation och 660-720 emission för att mäta tumörens signal och 570 excitation och 640-720 emission för att mäta bakgrunden signal. Använd inställningar för automatisk exponering och välj önskad avbildning plattformen. Hela avbildningssekvens tar i allmänhet 3-5 min att förvärva.
- Tillåt möss att återhämta sig helt från anestesi före transport från Imaging System. Analysera bilder med LiVing Image programpaket version 4.2 (Caliper Life Sciences).
- Kvantifiera självlysande signalen med hjälp av en region av intresse (ROI) inställd på totala flödet (fotoner / sek) eller genomsnittlig strålglans (fotoner / sek / cm 2 / sr) och ställa in alla bilder i samma skala (Figur 3). Här, är representativa bilder som används för att påvisa såväl cellpopulationer i varje mus (Figur 3). Andra studier från vårt laboratorium har visat colocalization med denna teknik 20. Colocalization timing måste optimeras utifrån experimentella modell som används.
- För att kvantifiera fluorescerande signal från utsläpp scan sekvensen använder "Spectral unmixing"-funktionen i Living Image. Välj de bilder som ska inkluderas i analysen och drar en mask över det område av musen som innehåller signalen av intresse, i detta fall, den övre bröstkorgen. Välj vävnad autofluorescense och okända sond som ska oblandade. Om möss ges mat som innehåller alfalfa, kan mat signal även unmixed från sonden av intresse och vävnad autofluorescens.
- Om de resulterande bilderna inte visar en jämn fördelning av vävnad autofluorescens (inklusive det område där signalen är placerad) begränsningar kan ställas in för att få konsekventa distribution och bättre separation av komponenterna som utgör oblandade. Detta är typiskt och ofta nödvändigt för givare som inte finns i programvaran och när specifika signalen är låg, eller nära bakgrunden signal. Ange ett högpassfilter, finns under fliken Uppdatera för 640 nm, vilket motsvarar den lägre änden av utsläpp kurvan för turboFP650. Ett lågpassfilter tvång kan också ställas in, men det var nödvändigt för bildanalys som visas här.
- Kvantifiera fluorescerande signal från oblandade bilden med en region av intresse (ROI) inställd på strålande effektivitet (fotoner / sek / cm 2 / sr) / pW) och ställa in alla bilder i samma skala (Figur 3).
- Vid en önskad tidpunkt, kan mössen offras och analyseras för engraftment av hESC-härledda celler genom flödescytometri. För intraperitonealt injicerade NK-celler analyserar vi typiskt det perifera blodet (ansikts ven utfall), mjälte och bukhinna. Peritoneala tvättningar kan utföras genom att exponera bara det peritoneala membranet och göra en medial incision precis tillräckligt bred för att tillåta en glas pasteurpipett för att komma åt bukhålan. Använd steril PBS, utföra flera tvättar av bukhålan och se till att blanda lösningen ordentligt genom att vrida på musen. Samla tillräckligt med vätska tills du har en synlig pellet efter centrifugering (normalt 5-10 ml tvätt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generation av hematopoetiska stamceller använder den metod spin EB möjliggör optimal NK cellernas utveckling från hESCs och iPSCs. Såsom visas i figur 2, dag 11 spin EBs innehåller höga procentandelar av progenitorceller som uttrycker CD34, CD45, CD43 och CD31. Höga nivåer av CD34 och CD45 medger direkt överföring till NK villkor utan behov av sortering eller stödjande stromaceller. Om det finns suboptimal spinn EB differentiering, är det rekommenderat att stromaceller såsom EL08-1D2 används i de sekundära NK förhållanden. Efter 4 veckors odling av spin EBs ger upphov till ett stort antal NK-celler (ca 1-2 x 10 6 celler per brunn i en 24-brunnar). Kulturer kan också phenotyped vid tidigare tidpunkter för att se den gradvisa utvecklingen av NK cellutveckling i detta system 7. NK-celler bibehålla uttrycket av reportergener som var modifierade till moderföreningen ES / iPS linje och därför sedan kan följas
Figur 1. Dual imaging system och utvecklande tidslinje. A) Schematisk bild av in vivo-modell. Möss injiceras IP med luciferin, och efter ordentlig inkubationstid är Eldflugeluciferas + celler avbildas för självlysande signalen. Efter förvärvet av självlysande bilden, fluorescerande signal från TurboFP650 + celler kan avbildas. B) Tidslinje för utveckling och testning av hESC-deried NK-celler.
Figur 2. Fenotypen av spin EBs och NK-celler som härrör från hESCs och iPSCs. A) efter 11 dagar i spinn EB kultur, kan celler analyseras med flödescytometri. Dagen 11 tidpunkt ger höga procentsatser av CD34, CD43, CD45 och CD31-uttryckande celler optimala för NK-cell differentiering. B) NK-celler kan detekteras med användning av flödescytometri efter 4 veckor av NK cellkultur. Celler inom lymfocytinramningen (FSC / SSC plot) analyseras för uttrycket av CD56. CD56 +-celler kan analyseras ytterligare för co-uttryck av markörer såsom CD117, CD94, NKp46 eller andra. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Lysrör och självlysande avbildning in vivo med hjälp av IVIS Spectrum. In vivo övervakning är det primära syftet med detta protokoll. Därför mössen inte följs upp för tumör avslut. Vår förra rapport (med 200.000 K562-celler) visar att tumören clearance sker vid tre veckor 7. A) Bioluminescent avbildning av Fluc + hESC-härledd NK-celler på dag 0, 7 och 14 efter NK cell injektion visas i den övre raden. Fluorescerande avbildning av TurboFP650 + K562 celler på dag 0, 7 och 14 efter NK-cell injektion visas i nedersta raden. Fluorescerande bilder förvärvades omedelbart efter självlysande bilden förvärvet. B) Sekvens visar vävnad autofluorescens och fluorescerande signal från turboFP650 + celler, som genereras med hjälp av spektrala unmixing funktionen i Living bildbehandlingsprogram. Musen längst till vänster i varje bild är en icke-injektion kontroll och endast visar bakgrunden signalen. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hESCs är en idealisk plattform för att studera olika celltyper och håller anmärkningsvärd potential för klinisk översättning. Vi använder ett definierat, spin EB strategi att differentiera hESC / iPSCs till hematopoetiska stamceller. Den spin EB metoden har gett konsekvent härledning av hematopoetiska stamceller och differentiering för att NK-celler, men, variation fortfarande existerar i differentiering effektivitet inom cellinjer och kan behöva modifieras för generering av andra hematopoetiska cellinjer. Medan jämförbara resultat kan erhållas från härledning i andra EB eller stromal metoder kultur, är detta system serum-fri och representerar en mer definierad metod för framställning av hematopoetiska stamceller jämfört med andra metoder. Vi har också standardiserat en effektiv metod för att härleda NK-celler från dessa hematopoetiska stamceller i en liknande feeder-fritt sätt, som övervinner ett stort bekymmer för klinisk översättning. Det ger också ett fastställt system för att studera NK cell UTVECKLINGt in vitro. Omfattande prekliniska in vivo karakterisering av hematopoetiska celler, såsom NK-celler, är också nödvändigt att specifikt definiera dessa experimentellt härledda celltyper och deras genomförande till kliniska prövningar.
Framsteg inom bildbehandling och tekniker mikroskopi har möjliggjort långsiktig och icke-invasiv in vivo övervakning av celler som uttrycker självlysande och fluorescerande reportrar 15-17,19,21. Mest anmärkningsvärt är att användningen av eldflugeluciferas konstruktionen, som har använts för att visualisera olika celltyper sedan dess initiala karakterisering. Detta är en idealisk reporter för in vivo imaging, men är begränsad till endast övervaka en cell population. Den största fördelen med en dual-reportersystem är förmågan att följa de interaktioner mellan två distinkta cellpopulationer. Emellertid har få reportrar utvecklats som är både lätt att bilden in vivo och har tillräckliga och mätbara signal överbakgrund.
TurboFP650, det fluorescerande proteinet som används i vår dubbla imaging system, är långt-rött skiftat, vilket ger signal skiljer sig från bakgrunden autofluorescens. Emellertid var användningen av spektrala unmixing metoder i Living bildbehandlingsprogram (Caliper Life Sciences) som krävs för att maximera signal till bakgrunden förhållandet i vårt system. Det finns många funktioner i levande bild programvara som kan hjälpa till med de inneboende utmaningar fluorescerande protein avbildning. Ändå förblir signalen penetrans en utmaning. Systemet behöver ytterligare optimering för avbildning av små cellpopulationer eller avbildning av dispergerade celler, vilket skulle vara fallet om tumörcellerna injicerades IP. Dock gör konsistensen och enkel fluorescerande imaging dess användning en idealisk plattform för att använda i en dubbel avbildning modell. Djuren är under anestesi för mindre tid och det finns inget behov att leverera ett andra substrat som med de flesta dual-luciferas-system.
Denna metodav härledning, ger expansion, och dual-avbildning in vivo en konsekvent strategi för att producera hESC-härledde eller iPSC-derived NK-celler och utvärdering som är nödvändiga för att förbättra nuvarande NK cell adoptiv terapier. Den dubbla lysrör och självlysande avbildning modell är brett tillämpbar för långsiktig studie av två distinkta cellpopulationer andra än anti-tumor modell har vi visat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöddes av NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) och NIH MSTP bidrag T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology Training Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Grundutbildning forskningsmöjligheter Program (UROP) Grant, University of Minnesota (AMB), leukemi Research Fund vid University of Minnesota Cancer Center, och William L och Blanche Hughes Foundation.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Melinda Hexum för initiering av spin EB protokoll inom vårt labb. Vi vill tacka övriga medlemmar i labbet, däribland Laura E. Bendzick, Michael Lepley och ZhenYa Ni för sitt tekniska bistånd med detta arbete. Författarna vill också tacka Brad Taylor på Caliper Life Sciences för hans sakkunnig teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercapt–thanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R & D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells |  MD Anderson, Houston, TX |
contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section | |
Materials Table. |
|||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
