Summary
Denne protokol beskriver udviklingen, ekspansion, og in vivo billeddannelse af NK-celler afledt fra hESCs og iPSCs.
Abstract
Vi præsenterer en metode til at udlede naturlige dræberceller (NK-celler) fra udifferentierede hESCs og iPSCs hjælp af en feeder-fri tilgang. Denne metode giver anledning til høje niveauer af NK-celler efter 4 ugers kultur og kan undergå yderligere 2-log ekspansion med kunstige antigenpræsenterende celler. hESC-og iPSC-afledte NK-celler udviklet i dette system har en moden fænotype og funktion. Produktionen af et stort antal genetisk modificerbare NK-celler er gældende for både grundforskning mekanistisk samt anti-tumor studier. Ekspression af ildflueluciferase i hESC-afledte NK-celler giver en non-invasiv metode til at følge NK-celle transplantation, distribution og funktion. Vi beskriver også en dual-imaging ordning, der giver mulighed for separat overvågning af to forskellige cellepopulationer til mere udpræget karakterisere deres interaktion in vivo. Denne metode til afledning, ekspansion, og dual in vivo imaging giver en pålidelig metode til at frembringe NK-celler, og deres evalueringtion, der er nødvendig for at forbedre de nuværende NK celle adoptivforældre behandlingsformer.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (iPSCs), er udifferentierede, pluripotente celler, som kan ubegrænset selvfornyelse og multi-slægt differentiering. hESCs succes er blevet differentieret i modne og funktionelle undergrupper af hver kim lag, herunder celler af den hæmatopoietiske system 1-3. Naturlige dræberceller (NK-celler) er lymfocytter i det medfødte immunsystem, der kan afledes af hESCs ved dannelse af embryoid organer (EBS) 4,5 eller co-kultur med stromale cellelinier 1,2,6-8. NK-celler besidder anti-viral og anti-tumor egenskaber og har potentiale til at være effektiv mod en bred vifte af maligniteter, da de ikke kræver forudgående antigenstimulering til at udføre deres effektorfunktioner. Således hESC afledt NK-celler er en attraktiv kilde til celler til immunterapi. Derudover afledning af NK-celler fra hESCs giver et genetisk medgørlige til undersøgelse normal udvikling <em> in vitro.
Fordi de giver et genetisk medgørligt system kan embryonale afledt NK celler eksperimentelt modificeret til at udtrykke fluorescerende og bioluminescerende reportere giver en optimal model til at studere NK celle effektorfunktioner in vitro og in vivo. hESC-afledte NK-celler besidder aktivitet mod en række mål, herunder HIV 9, leukæmi (K562) og andre kræfttyper 7,8. Men evnen effektivt udlede nok NK-celler er i stand til at behandle patienter fortsat en vigtig barriere for klinisk oversættelse og er i mindre grad, en begrænsning for omfattende prækliniske in vivo studier af NK-celle udvikling og anti-cancer-funktioner. Her bruger vi et spin EB tilgang til at udlede hæmatopoietiske stamfædre fra hESCs 4,5,10. Efter elleve dage spin EB overføres til NK-celle kultur med eller uden automater til 28 dage. Efter 4 uger i NK-celle dyrkningsmedium, er NK-celler transferred til co-kultur med K562-celler modificeret til at udtrykke membranbundet interleukin 21 (IL-21), der tjener som kunstige antigenpræsenterende celler (aAPCs). Tilpasning en protokol til udvidelse af perifert blod NK-celler ved hjælp af disse kunstige APC'er 11,12, vi er i stand til at udvide NK-celler 2-logs og samtidig bevare en moden fænotype og cytotoksiske kapaciteter.
Denne proces med udvikling og ekspansion giver tilstrækkelige embryonale afledt NK-celler til omfattende in vivo karakterisering. Til in vivo studier, er vi i stand til ikke-invasivt overvåge langsigtet engraftment og kinetik af indsprøjtet ildflueluciferase udtrykker (Fluc +), embryonale-afledte NK-celler ved hjælp af bioluminescens billeddannelse. Desuden er vi i stand til at følge NK celleinteraktioner med tumorceller ved hjælp af en dobbelt, selvlysende eller fluorescerende billeddannelse ordningen. En tidligere undersøgelse fra vores gruppe brugte bioluminescence billeddannelse i en anti-tumor model til efterfølgelse tumor progression og cleArance af udsving + K562-celler in vivo 7.. Nu ved ingeniør vore hESCs at udtrykke ildflueluciferase 13,14 vi kan følge biofordelingen og handel med NK-celler til K562 tumorceller, som udtrykker den nyligt karakteriseret fluorescerende protein, turboFP650 15.. Vi har valgt dette dobbelte reporter system for at samtidigt følge de to cellepopulationer in vivo (figur 1). De fleste dual imaging modeller har været dual-luciferase-systemer, men disse systemer kan teknisk udfordrende på grund af de levering krav coelenterazin, underlaget kræves for ekspression af de fleste Renilla og Gaussia luciferase journalister 16-18. Fluorescerende reportere har tilladt nem overvågning af mange cellelinjer og konstruktioner in vitro, men har haft begrænset succes til in vivo billeddannelse på grund af overlapning mellem væv og pels autofluorescens og emission spektre af mange commonly brugt fluorescerende reportere, herunder GFP, DsRed og TdTomato 15,19. Denne bekymring har tilskyndet til udviklingen af langt rødt fluorescerende proteiner, som tillader en bedre væv penetrans og højere specifik signal i forhold til baggrunden 15,19. TurboFP650 det fluorescerende protein er vist i dette system, er langt rødt flyttet og overvinder mange af de spørgsmål, der er forbundet med billeddiagnostiske fluorescerende proteiner i levende dyr.
Denne metode for udvikling og udvidelse NK-celler afledt fra hESCs har givet os mulighed for yderligere at karakterisere embryonale afledt NK-celler in vitro og in vivo, som er nødvendig for bedre at forstå NK-cellernes funktion og klinisk vigtigt at forbedre de nuværende NK celle adoptiv behandlingsformer. Det er også modtagelig for udledning og udvidelse af iPSC-afledte NK-celler. Den dobbelte fluorescerende og bioluminiscerende imaging-ordningen er bredt anvendelig til andre systemer end den anti-tumor model, vi har vist her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Tilpasning hESCs eller iPSCs i TrypLE til Spin EB Cultures
- Den indledende dissociation med TrypLE fungerer bedst, hvis ES / iPS kolonier fra kollagenasebehandlede passerede kulturer er relativt små. Udgangspunktet ES / iPS populationer bør celler passerede længere end 4-5 dage tidligere. 4-5 dage før initiering af TrypLE passage, passerer ES-celler ved en densitet, som vil tillade cellerne at være ~ 70% sammenflydende i fire dage tid. Bruge almindelige ES medier til dyrkning af TrypLE-passerede ES-celler. Her bruger vi hESCs stabilt modificeret med en luciferase reporter konstruktion (Materials Table). Protokollen virker også med iPSCs, ved hjælp af ikke-modificerede iPSCs sammenligningsgrundlag for hæmatopoietisk stamcelle-og NK-celle udvikling.
- Fire dage før initiering af TrypLE passage, pass ES / iPS celler med collagenase IV, efter en normal passage protokol. Vi typisk passere 01:01 i den første passage med TrypLE. Udvid ES / iPS-celler i overensstemmelse hermed på forhånd.
- Omhyggeligt pick off differentierede kolonier (dem, der mangler en afgrænset grænse eller har fibroblastiske / epitelial egenskaber), før du fortsætter til TrypLE dissociation. Differentierede celler kan overtage den kultur relativt nemt med TrypLE passage, så det er vigtigt at sørge for din start befolkning er meget ren.
- Aspireres medierne fra boringer, og der tilsættes 1,0 ml forvarmet TrypLE Vælg per godt.
- Inkuber ES / iPS celler i TrypLE i 5 min i en 37 ° C inkubator. Efter 5 minutter pipettér forsigtigt ES-celler fra bunden af brønden.
- Saml TrypLE cellesuspension fra brønde og overføres til en konisk rør. Pipetteres op og ned gently 2-3 gange for at tilskynde de største klumper at bryde ud. Fortynd TrypLE med mindst 1 lige volumen ES medier og en tilsvarende mængde DPBS. TrypLE ikke udslukkes af dyrkningsmedier, så det er vigtigt at fortynde TrypLE med medier og DPBS efter fjernelse af celler fra pladen. Vi bruger DPBS + medier til vask for at spare ES medier.
- Spin ned cellerne ved 1.500 rpm i 5 minutter i kølecentrifuge (8 ° C).
- Aspirer off så meget af supernatanten som muligt at fjerne TrypLE.
- Resuspender cellerne i 4 ml ES medier plus 4 ml DPBS og gentag spin til at slippe af med de resterende spor af TrypLE.
- Aspirere off supernatanten og resuspender i passende volumen ES medier til galvanisering.
- Plate ES-celler 1:1 (eller 02:01 om nødvendigt) på low-density MEF'er i ES medier.
- Efter 24 timer, fodre cellerne med frisk ES medier. Der vil højst sandsynligt være mange enkelte celler, der ikke vedhæfte. Feed ES-celler dagligt med ES medier.
- Passere med TrypLE onto frisk MEF'er (0,9-1 x 10
- For de første adskillige passager (op til passage 5-10), vil cellerne kræve passerer på 1:01. Dette gør ekspansion af celler vanskelig. Det er vores erfaring, dråber udpladningseffektivitet af ES-celler dramatisk omkring passager 4-5, og derefter kommer tilbage op inden for et par passager. Efter passager 5-7, kan du være i stand til at begynde passerer cellerne ved 1:2 og til sidst, 01:03. Beyond passage 20 kan du nødt til at begynde at passere cellerne ved 01:05 eller 01:06. Sørg for at pladen ES-cellerne ved en høj tæthed de første 5-10 passager. Når du kommer til et punkt, hvor cellerne pladen ned effektivt nok, at de kan nå ~ 70% sammenløb inden for to dage efter passage, kan du prøve at starte passerer på 1:2 og i sidste ende bør være i stand til at passere 01:03 eller 01:04. iPSCs især passeret hvis ikke tæt nok, før fuldt adapted, tendens til at differentiere.
2.. Forbered Stock Løsninger til Opsætning Spin EB Cultures
- 10% BSA-opløsning i IMDM: Afbryd 4 g BSA i 35 ml IMDM (i en 50 ml konisk). Opløsningen sidde ved stuetemperatur i 1-2 timer for at tillade BSA til opløses fuldstændigt. Juster samlet volumen på 40 ml med IMDM at få endelig koncentration på 10%. Kommercielt tilgængelig BSA kan være cytotoksiske for ES-celler. Deionizing løsningen kan reducere risikoen for cytotoksicitet. At deionize tilføje ~ 1,3 g harpiks perler til 40 ml BSA-opløsning og ryst godt at blande.
- Sted BSA-opløsning (med harpiksperler) ved 4 ° C indtil perler skifter farve fra blå-grøn til gul (hvilket indikerer, at udvekslingen kapacitet er opbrugt).
- Ryst opløsning hver 20-30 min til at lette udvekslingen
- Hver udveksling kan tage op til 2 timer. Når udvekslingen er færdig, centrifugeres løsning til 2 min ved 1.000 rpm til pellet perler i bunden af røret.
- Pipette BSA-opløsning i en frisk 50 ml konisk, forlader perler skal kasseres.
- Gentag trin 2,2-2,5 mindst to yderligere gange for i alt tre eller flere udvekslinger. Under den sidste udveksling, kan kapaciteten af perlerne ikke helt udtømmes selv efter to timers inkubation med perlerne.
- Steril filter BSA-opløsningen og fjerne eventuelle resterende perler.
- BSA-opløsningen skal være stabilt ved 4 ° C i mindst 2 måneder.
- 5% PVA løsning: Mål 100 ml Millipore H 2 O i 125 ml glasflaske.
- Tilsæt 5 g PVA til vandet. Det er vigtigt at tilføje PVA til vand, således at PVA får fuldt "våd". Hvis du tilsætte vandet til PVA, vil det tage meget lang tid for PVA at gå i opløsning.
- PVA vil ikke opløses øjeblikkeligt. Sted PVA / vand opløsning ved 4 ° C natten over.
- Næste morgen, sted PVA / vandopløsning i 37 ° C vandbad i 4-8 timer. PVA bør være overvejende i opløsning i slutningen afinkubationen.
- Sted flaske tilbage i 4 ° C i yderligere 24-48 timer, eller indtil den er helt opløst. Løsning kunne være lidt tyktflydende.
- PVA-løsninger skal være stabilt ved 4 ° C i mindst 6 uger.
- Linolsyre og linolensyre (10.000 x-løsninger): Fortynd til 1 mg / ml i 200-bevis ethanol. Der tilsættes 10 ml ren olie til 10 ml ethanol. Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
- α-MTG stamopløsning: Fortynd 13 pi α-MTG i 1 ml IMDM.
- Ascorbinsyre 2-fosfat-løsning (100X): Lav en 5 mg / ml opløsning. 250 mg ascorbinsyre 2-fosfat i 50 ml sterilt, cellekultur klasse H 2 O. Letopløseligt.
3.. Samling af BPEL Media (for ~ 200 ml Total Volume)
- Lav en PVA-lipider blanding (dette trin forhindrer PVA fra at danne uopløselige dråber i det medium, der ville få filtreret ud).
- Tilsættes 20 ml IMDM og 20 ml F-12 næringsstof blanding til 50ml konisk rør.
- Tilsæt 10 ml 5% PVA bestand, 0,4 ml synthechol, 20 ul linolensyre, og 20 ul linolsyre for 200 ml BPEL medier. Ryst røret godt at blande. Braklægning mens andre medier er samlet.
- Tilføj alle resterende medier komponenter til at toppen af 250 ml Stericup filtrering enhed. Tilsæt resterende krævede IMDM og F-12 volumener (66 ml hver), BSA, en-MTG 100X ITS, Glutamax I, Pen / Strep, Protein-fri hybridoma blanding II, og ascorbinsyre. Tilsæt PVA-lipider blanding fra trin 1 til toppen af Stericup. Filtreres mediet. Medium skal være stabilt ved 4 ° C i mindst 2 uger. Brug gamle medium for vasketrin.
4.. Opsætning TrypLE-passerede ES-celler i fase I Spin EB'er
Brug ES / iPS celler, der er tilpasset TrypLE passage på lavere massefylde MEF (dvs. ES / iPS celler, der er blevet passeret med TrypLE på mindst 5-7 gange). Hvis cellerne kan overføres på ~ 01:03 og blive 70-80% sammenflydende i 3-4 dage, Bør cellerne være godt at bruge.
- To dage før opsætning Spin EB differentiering (dag -2): Pass TrypLE tilpassede ES / iPS celler på friske MEF'er ved en densitet tillader dem at være 70-80% sammenflydende på dagen for differentiering setup. Vi typisk passere 48 timer forud for Spin EB setup.
- Day of Spin EB Setup i fase I Differentiering (dag 0): At forberede Spin EB plating, pipette 150 ul sterilt vand ind i de 36 yderste brønde af hver 96-brønds plade for at minimere fordampning. Brug rundbundede, lav tilknytning 96 brønde alene.
- Aspirer dyrkningsmedier off af ES / iPS-celler og tilsættes 1,0 ml forvarmet TrypLE Vælg til hver brønd.
- Place plader i inkubator (37 ° C) i 5 min. Forsigtigt pipettere cellerne ud af pladen.
- Saml dissocierede celler i et konisk rør og pipetteres op og ned for at bryde ud klumper. Fortynd TrypLE med 1 lige volumen BPEL medier og mindst 1 lige volumen DPBS.
- Fjern supernatanten og resuspenderceller i 5 ml BPEL medier plus 5 ml DPBS. Gentag spin.
- Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 5-10 ml BPEL medier, afhængig af forventede celle nummer. Passere celler gennem 70 um filter (BD Falcon # 352350) i en frisk 50 ml konisk for at fjerne klumper (som kan interferere med EB dannelse).
- Tæl filtrerede celler. Alikvote celler, der skal anvendes til udpladning i en 50 ml konisk og spin. For plating: 3.000 ES-celler / brønd, 60 brønde / plade = 1.8x10 5 ES-celler / plade.
- Efter centrifugering vil cellerne har brug for at blive resuspenderet til 3x10 4 celler / ml (100 pi volumen / brønd, 3000 ES-celler / brønd).
- Forbered en volumen på BPEL medier + cytokiner er tilstrækkelige til resuspendering af cellerne (dette vil være 6 ml / plade). Trin I differentiering, bruger vi SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml), og VEGF (20 ng / ml) til udledning af hæmatopoietiske progenitorceller.
- Plate 100 ul celler / brønd (= 3.000 celler / brønd) i hvert af de indre 60 brønde i prepared 96 brønde. Det er nemmest, når du bruger en multikanalpipettor og sterilt trug. Vær sikker på at blande celler ved pipettering før du sætter i truget og arbejde hurtigt, så cellerne ikke har en chance for at bosætte sig.
- Spin 96-brønds plader i kølecentrifuge i 4 minutter ved ~ 1.500 rpm, 8 ° C.
- Omhyggeligt overføre pladerne fra centrifuge til 37 ° C inkubator. At forstyrre pladerne så meget som muligt. Tjek plader for at sikre, at cellerne dannede ensartede pellets i bunden af brøndene.
- Fase I spinde EB bør ikke fodres eller på anden måde forstyrret gennem dage 3-4 differentiering, indtil EB har dannet en mere holdbar ydre lag. Hvis EB'er vil blive efterladt i fase I over 10-12 dage, vi nogle gange fodre EB'er med 50 pi frisk BPEL medier med cytokiner til hver brønd (først tage 50 ul af gamle medier fra hver brønd). Inden 24 timer, skal cellerne begynde at danne en 3-D EB struktur, og ved dag 3-5, bør have en særskilt ydre lag, og starte DEVEloping cystisk strukturer.
5.. Dissocierende Stage I EB'er for FACS analyse
Saml around18-36 spin-EB til FACS-analyse. Hvis analysere celler, før dag 6, er flere brønde nødvendig for at opnå et tilstrækkeligt antal celler.
- Forbered nødvendige mængde af trypsin med 2% kylling serum. Sted i 37 ° C vandbad indtil brug.
- Overførsel centrifugering EB'er og medier fra 96-brønds plader til 15 ml koniske rør.
- Tillad EB'er at afregne til bunden af koniske rør. Med en 5 ml pipette, pipette forsigtigt ud supernatanten og overførsel til et separat rør (du kan samle alle supernatanten til et 15 ml eller 50 ml konisk rør). Som nogle hæmatopoietiske celler allerede er blevet frigivet fra spin EB mellem dag 9 og 11, adskiller supernatant indeholdende disse celler forhindrer overdreven trypsinbehandling.
- Resuspender EB'er i trypsin + 2% kylling serum: 3-4 ml til hver 15 ml konisk rør. Placer EB'er med trypsin i 37 ° C waterbath for 3-7 min. Ryst eller forsigtigt vortex hver 1-2 min. På tidligere tidspunkter (før dag 8), vil EBS bryde ud lettere og kan tage så lidt som 3 min. På senere tidspunkter (dag 8 +) EBS kan tage længere tid at dissociere. Vi plejer ikke lade dem Trypsinisér for mere end 5 min ved 37 ° C. Bemærk, disse tider er kun vejledende. For enhver bestemt cellelinje eller EB differentiering, kan det tage mere eller mindre tid til at dissociere EBS. Nøje overvåge dissociation. Det er vigtigt ikke at forlade cellerne i trypsin for længe. Det er bedre at stoppe trypsin dissociation, hvor kun et par små klumper forbliver synlige snarere end forsøge at fjerne alle klumper.
- Quench trypsin med mindst 1 lige volumen FBS-holdige medier. Spin ned celler (1.500 rpm, 5 min, 8 ° C).
- Resuspender cellerne i et passende volumen af medier til optælling (sædvanligvis 3-5 ml).
- Filterceller gennem en 100 um cellefilter. Fjern en portion af celler til tælling. Fortsæt med cellertil standard lab FACS-protokoller.
6.. Udvikling, Expansion, og karakterisering af NK-celler fra hPSC progenitorceller
Fordi spin EBS indeholde en høj procentdel af hæmatopoietiske stamceller, kan de overføres direkte til NK-celle kultur på dag 11. Spin EB kan overføres til plader med 24 brønde med eller uden foderautomater. Vi har ikke vist nogen forskel i fænotype eller funktion mellem NK-celler er afledt i hver tilstand. Derfor, vi generelt overføre til kulturer uden foderautomater at have et fuldstændigt defineret system til NK-celle udvikling. Hvis du bruger en embryonale / IPSC tråd med suboptimal hæmatopoietisk differentiering brugen af fødelag anbefales 7,8.
- Hjælp af en multikanalpipette sat til 100 ul, overførsel 6 spin-EB til hver brønd i en plade med 24 brønde.
- Med Fødere: forflytning spin-EBS til 24-brønds plader indeholdende 100.000 bestrålede (3.000 CGY) EL08-1D2 (en murin embryonic liver cellelinje) celler per brønd. Uden foderautomater: transfer EB'er direkte til ubestrøget, 24 brønde.
- Tilføj 400 ul NK differentiering medier indeholdende cytokiner (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, alt fra Peprotech), så det samlede volumen i hver brønd er ~ 1 ml.
- Sted celler i inkubator og foder hver 5-7 dage med NK differentiering medier, der indeholder alle de cytokiner i trin 6.3, undtagen IL-3.
- NK-celler vil udtrykke en moden fænotype på dag 28 efter overførsel til NK-celle differentiering kultur (figur 2).
- For at teste NK-celle cytotoksicitet, kan en 4 timers chromfrigivelsesanalyse udføres 8..
- Hvis store antal celler er nødvendige til in vivo-undersøgelser, kan co-kultur med kunstige antigenpræsenterende celler (aAPCs) giver en 2-log eller større ekspansion. For en detaljeret protokol, besøg http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.
7.. In vivo fluorescerende og Bioluminescent Imaging Monitor hESC-afledte NK-celler og kræftceller immunsvækkede mus
Vi bruger nonobese diabetiker / svær kombineret immundefekt med gamma-kæde knockout (NOD / SCID / γC - / -) mus der er 6 til 8 uger gammel i alle vores eksperimenter. Vi bruger en dual tegnemodel til samtidig spore tumor progression (turboFP650 reporter) og embryonale-NK-celler kinetik (Fluc reporter udtrykt i forælder ES-celler) in vivo. Denne imaging Ordningen er bredt anvendelig til andre systemer end den anti-tumor viste model her. Den IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences) er optimal for samtidige fluorescerende og bioluminiscerende in vivo billeddannelse.
- 24 timer forud for tumorcelle injektion, bestråle mus (225-250 CGY).
- Resuspender ønskede antaltumorceller (1 x 10 6 K562 celler er vist) i 200 pi Iscoves modificeret Dulbeccos medium (IMDM) suppleret med 20% FBS. Tumorceller dosis kan varieres afhængig af den anvendte model. TurboFP650 kunne også udtrykkes i ikke-tumortyper. Det er bedst afbildet med celler lokaliseret til en enkelt anatomisk placering.
- Injicere tumorceller subkutant i øverste venstre brystkasse af musene ved hjælp af en 27 eller 28 gauge nål og tillade at indpode i 4 dage. Cellerne skal danne en boble under huden på musen. Mus kan barberes i denne del af legemet bedre at visualisere injektion. Det er også udsætter området for bedre in vivo fluorescerende billeddannelse. Injektion omkring thorax af musene blev anvendt i denne model, fordi de ip injicerede NK-celler er bedst visualiseres mens musen er liggende. Alternative metoder til subkutane, herunder ryg eller flanke, er mindre stressende for dyret og bør overvejes.
- Resuspendere det ønskede antal hESC-deriVED NK-celler (10 x 10 6 NK-celler er vist) i 300 ul Iscoves modificeret Dulbecco medium (IMDM) suppleret med 20% FBS uden antibiotika.
- Injicere hESC-afledte NK-celler i hver mus intraperitonealt (IP) med en 27 eller 28 gauge nål. For alle eksperimenter, indbefatter mus, der modtog ingen tumor eller NK-celle infusion som en negativ kontrol.
- At opretholde NK cellepopulationer in vivo, giver mus en 250 ul IP injektion af IL-2 (1x10 4 U / mus) og IL-15 (10 ng / mus) i sterile DPBS hver dag i de første 7 dage efterfulgt af IL- 2 kun hver 2 til 3 dage, indtil tidspunktet for aflivning.
- Overvåge indpodning af hESC-afledte NK-celler ved bioluminescerende billeddannelse. Indsprøjtes hver mus IP med 120 pi D-luciferin (150 mg / kg). Billede af mus 10 min efter D-luciferin injektion.
- Bedøver mus ved hjælp af et kammer tillader isofluran indrejse i boksen 0,8 l / min. Sørg for at der også er ilt flow ind i kammeret.
- Placer bedøvetmus i IVIS Spectrum og sikre mus på ryggen med tape eller velcro og tillade isofluran indrejse i boksen 0,5 l / min for at opretholde anæstesi.
- Indstil IVIS maskine til at korrigere imaging platform (D til 4-5 mus, C for 3 eller færre mus), der Binning til medium, f / stop til 1 og erhverve billede i 1 min.
- For at udføre fluorescerende billeddannelse til turboFP650 + celler, skal du bruge imaging guiden til at oprette en emission scanning måler sonden af interesse samt baggrund signal. Fra listen over sonder vælger Input Em / ex, og indtast i korrekt excitation og emission. For turboFP650, bruge 605 excitation og 660-720 emission at måle tumor signal og 570 excitation og 640-720 emission til måling baggrund signal. Brug automatisk eksponering indstillinger, og vælge den ønskede billedbehandling platform. Hele billeddannelsessekvens vil generelt tage 3-5 min at erhverve.
- Tillad mus at komme sig helt fra anæstesi før transport fra imaging system. Analyser billeder med LiVing Billede softwarepakke version 4.2 (Caliper Life Sciences).
- Kvantificere bioluminescerende signal ved hjælp af en region af interesse (ROI) er indstillet til den samlede flux (fotoner / sek) eller gennemsnitlig radians (fotoner / sec / cm 2 / sr) og indstille alle billeder til samme skala (Figur 3). Her er repræsentative billeder anvendes til at påvise både cellepopulationer i hver mus (figur 3). Andre undersøgelser fra vores laboratorium har vist colokalisering hjælp af denne teknik 20.. Colokalisering timing skal være optimeret baseret på den eksperimentelle anvendte model.
- For at kvantificere fluorescerende signal fra emission scan sekvens bruge "Spectral unmixing" funktion i Living Image. Vælg de billeder, der skal indgå i analysen, og tegne en maske over området af musen indeholder signalet af interesse, i dette tilfælde, den øvre brystkasse. Vælg væv autofluorescense og ukendte sonde skal ublandet. Hvis mus given fødevare indeholder lucerne, kan fødevarer signal også være unmixed fra sonden af interesse og væv autofluorescens.
- Hvis de fremkomne billeder ikke viser en jævn fordeling af væv autofluorescens (herunder det område, hvor signalet er placeret) begrænsninger kan indstilles til at få ensartet fordeling og bedre adskillelse af de komponenter, der ikke er blandet. Dette er typisk og ofte nødvendig for sonder, der ikke er i softwaren, og når specifikt signal er lav eller tæt på baggrund signal. Sæt et højpasfilter, findes under opdateringen fanen for 640 nm, hvilket svarer til den nedre ende af emissionen kurven for turboFP650. En lavpasfilter begrænsning kan også indstilles, men det var unødvendigt for billedbehandling analysen vist her.
- Kvantificere fluorescerende signal fra ublandet billede ved hjælp af en region af interesse (ROI) er indstillet til radiant virkningsgrad (fotoner / sec / cm 2 / sr) / pW), og indstille alle billeder til samme skala (Figur 3).
- På et ønsket tidspunkt, kan musene aflivet og analyseret for dagraftment af hESC-afledte celler ved flowcytometri. For injiceret intraperitonealt NK-celler vi typisk analyserer perifert blod (facial vein udluftning), milt, og bughinden. Peritoneale vask kan udføres ved at udsætte blot den peritoneale membran og gøre en medial snit lige bred nok til at tillade en glas Pasteur-pipette for at få adgang til bughulen. Anvendelse af sterilt PBS, adskillige vaske af bughulen og Sørg for at blande opløsningen grundigt ved at dreje musen udføre. Saml nok væske, indtil du har en synlig pellet efter centrifugering (typisk 5-10 ml vask).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generation af hæmatopoietiske stamceller ved hjælp af spin-EB tilgang giver mulighed for optimal NK-celle udvikling fra hESCs og iPSCs. Som vist i figur 2, dag 11 spin-EB indeholder høje procentdele af progenitorceller, der udtrykker CD34, CD45, CD43 og CD31. Høje niveauer af CD34 og CD45 giver mulighed for direkte overførsel til NK forhold uden behov for sortering eller støtte stromaceller. Hvis der er suboptimal spin-EB differentiering, anbefales det, at stromale celler, såsom EL08-1D2 anvendes i de sekundære NK betingelser. Efter 4 ugers kultur spin EB giver anledning til et stort antal NK-celler (ca. 1-2 x 10 6 celler per brønd i en plade med 24 brønde). Kulturer kan også fænotypebestemmes på tidligere tidspunkter at se den gradvise progression af NK-celle udvikling i dette system 7.. NK-celler opretholder ekspressionen af reportergener, der blev ændret i moderkre ES / iPS linje og derfor kan derefter følges
Figur 1. Dual imaging-ordningen og udviklingsmæssige tidslinje. A) Skematisk af in vivo-model. Mus injiceres IP med luciferin og efter passende inkubationstid, er ildflueluciferase +-celler afbildet til bioluminescerende signal. Efter overtagelse af den selvlysende billede, fluorescerende signal fra TurboFP650 + celler kan afbildes. B) Tidslinje for udvikling og afprøvning af hESC-derived NK-celler.
Figur 2. Fænotype spin EB'er og NK-celler afledt fra hESCs og iPSCs. A) efter 11 dage i spin-EB kultur kan celler analyseres ved flowcytometri. Dagen 11 tidspunkt giver høje procentdele af CD34, CD43, CD45 og CD31-udtrykkende celler optimale til NK-celle differentiering. B) NK-celler kan påvises ved hjælp af flowcytometri efter 4 ugers NK cellekultur. Celler i lymfocytporten (FSC / SSC plot) analyseres for ekspression af CD56. CD56 + celler kan yderligere analyseres for co-ekspression af markører, såsom CD117, CD94, NKp46 eller andre. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Fluorescerende og bioluminescerende billeddannelse in vivo ved hjælp af IVIS Spectrum. In vivo overvågning er det primære formål med denne protokol. Derfor er musene ikke fulgt ud for tumor clearance. Vores tidligere rapport (ved hjælp af 200.000 K562 celler) viser, at tumor clearance sker tre uger 7.. A) Bioluminescent billeddannelse af Fluc + hESC-afledte NK-celler på dag 0, 7 og 14 efter NK-celle injektion vises i den øverste række. Fluorescent billeddannelse af TurboFP650 + K562 celler på dag 0, 7 og 14 efter NK-celle injektion vises i den nederste række. Fluorescerende billeder blev erhvervet umiddelbart efter bioluminiscerende billede erhvervelse. B) Sequence viser væv autofluorescens og fluorescerende signal fra turboFP650 + celler, der genereres ved hjælp af spektrale unmixing indslag i Living Billede software. Musen længst til venstre i hvert billede er en ikke-indsprøjtning kontrol og viser kun baggrunden signal. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hESCs er en ideel platform til at studere diverse celletyper og holde bemærkelsesværdigt potentiale for klinisk oversættelse. Vi bruger en defineret, spin-EB tilgang til at differentiere embryonale / iPSCs til bloddannende stamceller. Spin EB tilgang har givet konsekvent afledning af hæmatopoietiske stamceller og differentiering til NK-celler endnu, variation, findes stadig i differentiering effektiviteten på tværs cellelinjer og skal muligvis modificeres til generering af andre hæmatopoietiske cellelinier. Mens sammenlignelige resultater kan opnås fra afledning i andre EB eller stromale dyrkningsmetoder, dette system er serum-frit og repræsenterer en mere defineret fremgangsmåde til fremstilling af hæmatopoietiske progenitorer i forhold til andre metoder. Vi har også standardiseret en effektiv metode, som består NK-celler fra disse hæmatopoietiske stamfædre i en tilsvarende feeder-fri måde, som overvinder en stor bekymring for klinisk oversættelse. Det giver også et afgrænset system til at studere NK celle UDVIKLINGSt in vitro. Omfattende prækliniske in vivo karakterisering af hæmatopoietiske celler, såsom NK-celler, også er nødvendigt specifikt at definere disse eksperimentelt afledte celletyper og deres gennemførelse til kliniske forsøg.
Fremskridt i billedbehandling og mikroskopi teknikker har muliggjort langsigtet og non-invasiv in vivo monitorering af celler, der udtrykker bioluminiscerende og fluorescerende reportere 15-17,19,21. Mest bemærkelsesværdigt er brugen af ildflueluciferase konstruktionen, som er blevet anvendt til at visualisere forskellige celletyper siden dens oprindelige karakterisering. Dette er en ideel reporter til in vivo billeddannelse, men er begrænset til kun at overvåge én cellepopulation. Den største fordel ved et dobbelt-reporter system er evnen til at følge samspillet mellem to forskellige cellepopulationer. Imidlertid har nogle journalister blevet udviklet, som er både nemme at afbilde in vivo og har tilstrækkelig og kvantificerbare signal overbaggrund.
TurboFP650, det fluorescerende protein, der anvendes i vores dobbelt billeddannelse ordning, er langt rød forskydes, hvilket giver signal adskiller sig fra baggrunden autofluorescens. Men udnyttelsen af spektrale unmixing metoder i Living Billede software (Caliper Life Sciences) var nødvendig for at maksimere signalet til baggrunden forhold i vores system. Der er mange funktioner i Living Billede software i stand til at hjælpe med de iboende udfordringer fluorescerende protein billeddannelse. Alligevel signal penetrans fortsat en udfordring. Systemet skal yderligere optimering til billeddannelse af små cellepopulationer eller billeddannelse af dispergerede celler, som det ville være tilfældet, hvis tumorcellerne blev injiceret IP. Men konsekvensen og brugervenlighed fluorescerende billeddannelse gør dens brug en ideel platform til brug i en dobbelt billedbehandling model. Dyrene er under bedøvelse for mindre tid, og der er ingen grund til at levere en anden substrat som med de fleste dual-luciferase-systemer.
Denne metodeafledningsprocessen giver ekspansion, og dual-imaging in vivo en konsekvent tilgang til at producere embryonale-afledte eller IPSC-afledte NK-celler og deres evaluering, som er nødvendig for at forbedre de nuværende NK celle adoptivforældre behandlingsformer. Den dobbelte fluorescerende og bioluminiscerende tegnemodel er bredt anvendelig for langsigtet undersøgelse af to forskellige cellepopulationer andre end anti-tumor model, vi har vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) og NIH MSTP tilskud T32 GM008244 (DAK) Stem Cell Biology Training Grant T32 (DAK) (T32HD060536) Undergraduate Research Opportunities Program (UROP) Grant, University of Minnesota (AMB), leukæmi Research Fund af University of Minnesota Cancer Center og William L og Blanche Hughes Foundation.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Melinda Hexum til indvielse af spin EB-protokollen inden for vores lab. Vi vil gerne takke de øvrige medlemmer af laboratoriet, herunder Laura E. Bendzick, Michael Lepley og ZhenYa Ni for deres tekniske bistand med dette arbejde. Forfatterne vil også gerne takke Brad Taylor på Caliper Life Sciences for hans ekspert teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercapt–thanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R & D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells |  MD Anderson, Houston, TX |
contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section | |
Materials Table. |
|||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
