Summary
Här presenterar vi en systematisk metod för att utveckla fysiologiskt relevant, känslig och specifik
Abstract
Här presenterar vi metoder för utveckling av testmetoder för att Query potentiellt kliniskt signifikanta nonsynonymous ändringar med hjälp av in vivo komplettering i zebrafisk. Zebrafisk (Danio rerio) är ett användbart djur-system på grund av sin experimentella överskådlighet, embryon är transparenta för att möjliggöra enkel visning, genomgår snabba vivo utveckling ex, och kan vara genetiskt manipulerade 1 Dessa aspekter har möjliggjort betydande framsteg i analysen av fosterutvecklingen,. molekylära processer och morphogenetic signalering. Sammantaget fördelarna med denna ryggradsdjur modell gör zebrafisk mycket mottaglig för modellering av utvecklings-hoppar i pediatrisk sjukdom, och i vissa fall, vuxen-debut störningar. Eftersom zebrafisk genomet är mycket konserverad med den hos människor (~ 70% ortolog), är det möjligt att rekapitulera humana sjukdomstillstånd i zebrafisk. Detta åstadkoms antingen genom injektion av mutant human MRNA för att inducera dominant negativ eller förstärkning av funktionen alleler, eller utnyttjande av morfolinogrupper (MO) antisensoligonukleotider att undertrycka gener att efterlikna förlorad funktion varianter. Genom komplettering av MO-inducerad fenotyper med utjämnade human mRNA, gör vår strategi tolkning av den skadliga effekten av mutationer på humant protein sekvens baserad på förmågan hos mutant mRNA för att rädda en mätbar, fysiologiskt relevant fenotyp. Modellering av den mänskliga sjukdomen alleler sker genom mikroinjektion av zebrafisk embryon med MO och / eller humant mRNA vid 1-4 cellstadiet och fenotypning upp till sju dagar efter befruktningen (DPF). Denna allmänna strategi kan utvidgas till ett brett spektrum av sjukdomstillstånd fenotyper, vilket visas i följande protokoll. Vi presenterar våra etablerade modeller för morphogenetic signalering, kraniofaciala, hjärt-, kärl-integritet, njurfunktion och skelettmuskulaturen fenotyper sjukdom, liksom andra.
Introduction
Den funktionella tolkningen av genetisk information och tilldelning av det prediktiva kliniska värdet till en genotyp utgör ett stort problem i medicinsk genetik och blir alltmer gripande med den allt snabbare tekniska och ekonomiska genomförbarheten av genomet hela sekvensering. Därför är det nödvändigt att utveckla och implementera nya paradigm för att testa sjukdomsframkallande varianter av okänd betydelse (VUS) upptäcktes hos patienter. Dessa analyser måste då vara korrekt, tid-och kostnadseffektivt, och hamnen potential att katalysera en övergång till klinisk användbarhet.
Även musen har traditionellt verktyget för val när det gäller mänskliga sjukdomar modellering är zebrafisk fram som ett vetenskapligt och ekonomiskt gynnsamt surrogat. Till skillnad från musen, låter zebrafisk biologi enkel och snabb tillgång till alla utvecklingsstadier, med hjälp av optisk klarhet embryon som möjliggör realtid avbildning av utvecklingsländernas sjukdomar.
Vi noterar också attre är inneboende begränsningar till zebrafisk modellsystem. Även D. rerio ha snabb inledande utvecklingen av organsystem, kräver könsmognad cirka tre månader. På grund av detta, prenatal och pediatrisk-starten störningar är de mest lämpade för detta övergående uttryck modell. Även idealisk för att genomföra stora skärmar kemisk förening, är användningen av genetiska mutanter inte möjligt för systematisk testning av tusentals nonsynonymous varianter som bidrar till, och fortsätta att detekteras i pediatriska sjukdomar.
Kompletteringen testerna beskrivs här dra nytta av detta experimentella lätthanterlighet hög grad av homologi, och bevarande av funktion mellan mänskliga och zebrafisk proteiner, i synnerhet så för molekyler som är nödvändiga för bevarade utvecklingsprocesser. Figur 1 en översikt över testning och identifiering strategi för olika allel effekter. Både förlust av funktion (LOF) och dominerande analyser kan utföras. För LOF, börjar experimentera med undertryckandet av genen av intresse med en morfolino knockdown och analysera för fenotyper som kan vara relevanta för den kliniska fenotypen under utredning. Suppression kan uppnås antingen genom att blockera translation genom att rikta en MO vid eller nära det translationella startstället för zebrafisk lokuset (översättning blockerare morfolino; tbMO) eller genom att interferera med splitsning genom att placera en MO den en splitsningsförbindelse, typiskt inducera antingen ta upp ett intron eller avvikande exon hoppa (skarven blockering morfolino; SBMO).
Därefter utjämnade mRNA från ortologa mänskliga avskriften introduceras och kvantifierbara räddning av fenotypen mäts. När analysen är etablerad kan kandidat-mutationer i det mänskliga budskapet införas och analyserades med avseende på deras förmåga att rädda den MO-inducerade fenotypen vid samma effektivitet som WT humant mRNA. Omvänt, för kandidat dominanta alleler, human mRNA (men inte MO) är inföed med en förväntan om att WT human mRNA inte grovt påverkar zebrafisk anatomi och fysiologi, medan införandet av test mutationer som har en dominerande effekten kommer att framkalla fenotyper analoga med dem som observerats i humana kliniska tillstånd. Detta experiment kan vara finkornig vidare att dissekera huruvida den dominerande effekten sker genom en förstärkning av funktion (GOF) eller en dominant-negativ mekanism genom att blanda WT och muterade humana mRNA, för GOF evenemang, tillsats av WT human mRNA förväntas vara irrelevant, bör medan för dominant-negativa alleler, blandning av WT och muterade mRNA ändra svårighetsgrad fenotypen inducerad av mutant budskap. I samtliga fall rekommenderar vi att alla kombinationer av injektioner (MO med WT human mRNA vs morfolino med mutant human mRNA etc. utföras, helst inom samma koppling av embryon (se figur 1) Tolkning är enligt följande.:
För LOF tester:
- Om knockdownger en fenotyp som kan räddas ekvivalent med mutant och WT mRNA, är allelen sannolikt godartade.
- Om den mutanta räddning av knockdown fenotypen är omöjlig att skilja från knockdown fenotyp själv, är allel en trolig funktionell null. Experimentet kan inte skilja mellan riktiga nollor (inget funktionellt protein) och ultralow protein aktivitetsnivåer som inte har någon räddning kapacitet.
- Om den muterade räddning av knockdown fenotypen är statistiskt bättre än MO, men värre än WT, är allelen sannolikt en hypomorph eftersom detta resultat visar partiell förlust av funktion.
För dominerande tester:
- Om det inte finns någon knockdown fenotyp, men injektion av WT-mRNA ger en fenotyp, måste en beredskapsplan användas om experimentet är att gå vidare (se nedan).
- Om det inte finns någon knockdown fenotyp och injektion av WT mRNA producerar ingen fenotyp, fortsätter experimentet som vanligt.
- Om injektionav mutant-mRNA är ekvivalent med den hos vildtyps-mRNA, kan allel antingen vara godartad eller förlust av funktion, eller analysen kan ha misslyckats. Detta kräver ytterligare experiment för att skilja mellan dessa alternativ.
- Om injektion av mutant mRNA är omöjlig att skilja från MO knockdown, är funktionen av genen produkten sannolikt förändras på något sätt. Att urskilja den ändrade funktionen, bör en titrering av mutant-mRNA med vildtyp mRNA utföras.
- Om resultatet av denna titrering är omöjliga att upptäcka vildtyp mRNA ensam, har det visat sig att det muterade proteinet produkt använder vildtypsprotein som ett substrat, som dess effekt varieras med mängden av titreringen. Detta tyder på en dominant, negativ fenotyp.
- Om resultatet av denna titrering är omöjliga att upptäcka mutant mRNA ensam, har det visat sig att det muterade proteinet är inte längre har samma funktion som den vilda typen, och sålunda påverkas inte av mängden vildtyp proteinprodukt preskickats. Detta visar att allelen är troligt funktionsökning.
Beredskapsplan:
- Om ingen fenotyp presenterar från MO knockdown, men gör detta med WT mRNA, kan ytterligare experimenterande uppstå, även om vi betona att denna situation är inte idealisk. WT humant mRNA bör titreras för att minimera fenotyp, och kan också användas som ett nytt börvärde. Ytterligare saminjektion av WT och muterade humana mRNA kan utvärderas baserat på undsättning förmåga mutanten.
Protocol
Ett. Bioinformatics Analys
- Bestäm om den mänskliga genen av intresse har en zebrafisk ortolog, och i så fall hur många kopior. Vi rekommenderar ömsesidig BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ) av det humana proteinet mot zebrafisk genomet, och efterföljande BLAST av de bästa zebrafisk slå mot det mänskliga genomet. Sant ortologer blir den bästa träffen i varje instans.
- Bestäm storleken på den öppna läsramen (ORF) av den humana genen. Om mer än 6 kb, är denna modell svårlösta för närvarande på grund av begränsningar av hög kvalitet in vitro transkription av långa mallar.
- Skaffa eller skapa en konstruktion innehållande den humana ORF i pCS2 + vektorryggraden (eller motsvarande vektor med en 5-SP6 transkription webbplatsen och 3 'polyA-signal).
- Designa en MO att blockera skarvning eller översättning av riktade zebrafisk genen. Om flera kopior finns i zebrafisk genomet, there finns två alternativ: a) utformning av kompletterande MOS, eller b) identifiering av en splitsningsställe fullständigt bevarad mellan kopior mot vilka en enda MO kan vara effektiva. Vissa publicerade MO sekvenser finns på www.zfin.org .
2. Expression Analysis i utvecklingsländerna Zebrafish Embryo
- Bestäm om zebrafisk ortolog uttrycks i en spatiotemporal sammanhang relevant för den fenotypiska avläsning. Om inga expressionsdata finns tillgängliga för genen av intresse, utföra omvänd transkription (RT)-PCR med användning av cDNA från hela zebrafisk embryon eller hybridisering in situ. (Se 2,3).
Tre. Ställesriktad mutagenes
- Design mutagenesstrategierna primers 25-45 baser långa, med den önskade mutationen i centrum. Primern smälttemperatur bör vara större än eller lika med 78 ° C. Designa en framåt och bakåt mutagenesprimern para till motsattasträngarna av plasmiden.
- Skaffa primers för sekvens bekräftelse på ORF efter mutagenes, bör dessa kakel över ~ 300 baspar sektioner för att täcka hela ORF.
- Montera mutagenes reaktion med en hifi-polymeras och cykel enligt följande (1: 95 ° C 30 sek, 2: 95 ° C 30 sek, 3: 55 ° C 1 min, 4: 68 ° C 6 min, 5: Gå till 2 18x, 6: 4 ° C för evigt, 7: slut).
- Tillsätt 1 l Dpnl restriktionsendonukleas per reaktion för avlägsnande av dammen metylerat templat; inkubera vid 37 ° C under 2 timmar.
- Transform 2 pl av mutagenes reaktion till 20 | il kompetenta celler enligt standardprotokoll.
- Plocka 3-4 kolonier och ympa 5 ml LB-medium med lämplig antibiotika. Skaka vid 37 ° C över natten vid 225 rpm.
- Miniprep DNA och bestämma koncentrationen.
- Sekvens mutationsstället för att bekräfta närvaron av mutationen av intresse.
- Sekvens hela ORF att bekräfta sekvens integritet.
4. In vitro mRNA-transkription
- Med hjälp av en lineariserad pCS2 + mall, generera capped mRNA med användning av mMessage mMachine SP6 kit (Ambion). Vi rekommenderar att använda hälften av de kvantiteter reaktionskomponent.
- Rena den RNA-provet med LiCl utfällning eller fenol-kloroform såsom beskrivits i satsens bruksanvisning.
- Bestäm koncentrationen av mRNA med användning av absorbans, säkerställa integriteten av mRNA med användning av gelelektrofores, och lagra provet i tre eller flera alikvoter vid -80 ° C tills redo för användning. Vi rekommenderar inte flera frys-tö cykler av mRNA portioner.
5. In vivo av Variant förlust av funktion
- Skaffa zebrafisk embryon från naturliga zebrafisk parningar, och hålla dem vid 28 ° C i embryo vatten i 6 eller 10 cm rätter.
- Genomför en morfolinogrupp dosresponskurva att utvärdera fenotyp specificitet, MO effektivitet och MO toxicitet. Injicera en dos kurva påminst tre olika koncentrationer mellan 1-10 ng MO till 50-100 (1-4 cellstadiet) zebrafisk embryon / kull. Effektiva MOS bör ge upphov till dosberoende ökning av andelen drabbade embryon i ett parti.
- Fenotyp embryon vid lämpligt utvecklingsstadium bygger på uttryck av riktade zebrafisk genen av intresse och vilket skede ett relevant fenotyp kommer att observeras. Detta kan antingen vara kvantitativ (t.ex. en mätning mellan anatomiska strukturer) eller kvalitativa (baserat på standardiserade fenotypiska kriterier). För alla injektioner gjorde> 24 HPF: embryon bör behandlas med PTU (0,003% 1-fenyl-2-tiourea i embryo medium) vid 24 HPF till största sänkningen av melanocyt formation.
- För skarv-blockering MOS, testa MO effektivitet genom att extrahera totalt RNA från hela embryot lysat vid tidpunkten av fenotypisk scoring, generera cDNA och genomföra RT-PCR av målgenen med användning av primrar som flankerar MO målstället.
- För att verifiera undertryckandet efficiency av en TB-MO, skörd hela lysates embryo protein och genomföra immunblottning att jämföra nivåer av riktade protein kontra kontroll. Dock är denna metod inte lämpar sig för alla målgener eftersom det finns begränsad korsreaktivitet för många kommersiella antikroppar mot zebrafisk proteiner. Två indirekta metoder för att visa MO specificitet, såsom: a) visar att det finns en dosberoende effekt på fenotypen, och b) visar att samtidig injektion av vildtyp mRNA med TB-MO räddar fenotyp effektivt. Av dessa skäl rekommenderar vi en skarv blockerare när det är möjligt eftersom effektivitet kan övervakas direkt.
- Om en fenotyp observeras vidare till steg 5.7, om inget fenotyp observeras vidare till steg 6.1.
- För kvalitativa fenotyper, välj MO dos där 50-75% av embryon påverkas, för kvantitativa fenotyper, välj MO dos där fenotypiska åtgärden skiljer sig väsentligt från vild-typ (p <0,001). Injicera nya partier av zebrafisk embrulltobak (1-4 cellstadiet, n = 50-100/batch) med en cocktail innehållande "analysen" dos av MO och en dos kurva av humant WT mRNA (allt från 10 till 200 pg mRNA; dessa doser säkerställa betydande överuttryck ovan baslinjen för varje enskild transkript, vilket motsvarar 0,25-0,5% av totala polyA mRNA i en zebrafisk embryo). 4
- Genomföra maskerade poängsättning av injektion partier, välj WT mRNA dosen med den mest betydande räddning i jämförelse med MO ensam, detta är den "analysen" dos av mRNA.
- Injicera nya satser (1-4 cellstadiet, n = 50-100/batch) med analys dos av MO och analys dos av mutant human mRNA. Fenotyp embryon i rätt skede och jämför resultat på WT human mRNA räddning med lämpligt statistiskt test (t-test eller chi-kvadrat). Se figur 1 för resultat och gå vidare till steg 7. Injicera analysbeståndsdelarna doser av WT och muterade mRNA ensamt att kontrollera för effekter mRNA toxicitet.
6. In vivo av Variant Dominant Negativ eller funktionsökning Effekter
- Om ingen förlust av funktion fenotypen observeras (Steg 5.5) eller om mutant mRNA ger upphov till fenotyper inte signifikant från MO ensam (Steg 5.7), injicera en dos kurva som sträcker sig från 10 till 200 pg WT human mRNA (vi rekommenderar 25, 50 , och 100 pg som första kontroll) i embryo satser (1-4 cellstadiet, 50-100 embryon / kull).
- Vid lämpligt skede (se 5.3 ovan), genomföra fenotypisk bristningar och bestämma den högsta dos vid vilken det inte finns ett statistiskt signifikant antal döda och / eller drabbade embryon i jämförelse med oinjicerade kontroller. Detta är den "-analys" dos.
- Injicera analysen dos av mutant human mRNA (1-4 cellstadiet, 50-100 embryon / kull). Fenotyp embryon och jämför resultat på scoring från analysen dosen av WT human mRNA injektion eller analysen MO koncentrationen. Se Figur 1 för resultat.
- Om resultaten inte kan skiljas från MO, titrera human mutant mRNA med WT-mRNAoch jämföra människors WT och muterade injektioner mRNA. Förbättring av fenotyper med muterade plus WT mRNA-injicerade satser indikerar en dominant negativ. Ingen förbättring visar en vinst på funktion.
7. Återge in vivo testresultat
- Upprepa in vivo analyser minst tre gånger.
8. Integrera Zebrafisk in vivo Pathogenicity data med andra bevislinjer
- Jämför patogenicitet data från zebrafisk experiment till: genetiska data inom en stamtavla (om tillämpligt), kontroll befolkningsdata frekvens, in vitro studier (cell-baserade analyser av protein stabilitet, cellulär lokalisering, signalutgång eller enzymatisk aktivitet).
Representative Results
Recessiva och Pseudorecessive Disorders
Primär cilia är nästan allestädes närvarande strukturer på ryggradsdjur kroppen planen som spelar cellulär signalering roller i flera cell öden, inklusive spridning, polaritet, differentiering, och vävnad underhåll. 5 dysfunktion av dessa organeller leder till ett brett spektrum av mänskliga genetiska sjukdomar som avses kollektivt som ciliopathies. 6,7 En sådan klinisk enhet är Bardet-Biedl syndrom (BBS), en multisystemisk pediatrisk sjukdom som kännetecknas av retinal degeneration, fetma, hypogonadism, polydactyly och njurpåverkan. 7 Utvecklingen av in vivo-analyser av allel patogenicitet var nödvändig för BBS eftersom a) det är en genetiskt heterogen sjukdom som orsakas av främst privata nonsynonymous förändringar i åtminstone 17 gener 7-10, och b) oligogenic arv i> 25% av BBS familjer, varvid närvaron av heterozygota förändringar i en sekundBBS-genen (utöver recessiva primära kausala mutationer) kan modulera kliniska penetrans och expressivitet. Typiskt sådana tredje alleler är nonsynonymous heterozygota förändringar, från en genetisk synvinkel, oklar patogena potential, vilket kräver noggrann tolkning av deras biologiska effekt på proteiners funktion. 11-13
För att undersöka sjukdomsframkallande förmåga mutationer bidrar till mutational belastning i BBS, testade vi inledningsvis alla missense förändringar identifierats i BBS1 - BBS14. Både vi och andra har visat att förlusten av basala kroppsegna proteiner ger upphov till oregelbundenhet i plana cellens polaritet (PCP, icke-kanoniska Wnt signalering). Manifesterar sig som konvergerande förlängning defekter i mitten somitic zebrafiskembryon 14 Använda denna fysiologiskt relevant fenotypisk avläsning, vi har funnit att undertryckandet av BBS gener resulterade i förkortade kroppsaxlar, bredare och tunnare somiter, och bred, krokig notochords. 15 </ Sup> (Figur 2) MO-suppression produceras Gastrulation defekter, och co-injektion med humant mRNA räddade signifikant (och reproducerbart) dessa fenotyper som görs av tre olika in vivo-metoder. Först var embryon gjorde leva utifrån kvalitativa fenotypiska kriterier (Normal, klass I och klass II, för detaljerade definitioner av fenotypiska klasserna se 15). Nästa, kvantifieras vi cellmigrationen under epiboly (ett tidigt utvecklingsstadium kännetecknas av gallring och spridning av cellskikt över äggulan cellen 16) genom att använda en fluorescein spårämne att visualisera migrerande celler. Slutligen mätte vi somit trunk längd i nio-somit embryon in situ hybridiserade med en cocktail av krox20, pax2 och MyoD riboprobes, vilka platt var monterade för morfologisk analys.
Denna metod har använts för att testa mer än 500 alleler i den ciliära mutational utrymmet. I enstudera ensam, in vivo-testning av> 130 alleler fram en serie fenotypiska poäng, såsom indikeras av våra protokoll (Figur 1) komplett räddar klassificerades som godartad (ej signifikant skilt från WT räddning), räddar partiell klassificerades som hypomorphs (signifikant förbättrad från MO, men svårare än WT räddning), var underlåtenhet att rädda klassificeras som funktionell null (ej signifikant skilt från MO), och fenotyper inducerade av mutant-mRNA jämfördes med MO klassificerades som dominerande negativ.
Vi har också utvärderat sensitivitet och specificitet för in vivo komplettering analys i zebrafisk. Specificitet bekräftas genom co-injicera vanligt SNPs (> 5% mindre allelfrekvens i friska kontrollpersoner populationer), dessa visade sig ge godartade fenotyper i 14/17 testade (> 82%), och känsligheten visades vara 98% som anges av överensstämmelse mellan in vivo-data och genetiska argument tillräckliga to tillskriver en allel som kausal i en BBS stamtavla. 17 Dessutom observerade fenotypiska effekter med tre in vivo åtgärder (live scoring, epiboly spårning, och ISH Morfometri) var validerade in vitro med hjälp immunoblottning och cellulär lokalisering studier. Även tolkningen av dessa resultat krävs förkunskaper minst en anordning av sjukdompathogenesis, ger detta exempel bevis för att styrka nyttan och robustheten i våra protokoll. Vi har sedan dess bekräftat vår in vivo scoring med flera andra linjer av experimentella bevis i en opartisk mutational screening och funktionell analys studie av TTC21B, en bakåtsträvande intraflagellar transport protein. 18
Dominerande Disorders
Limb gördel muskeldystrofi (LGMD) är en autosomal klass av muskeldystrofi, vilket långsamt framskridande muskelsvaghet i höfter och axlar. Denna genetiskt och migchanistically heterogen grupp av sjukdomar som orsakas av både dominanta och recessiva mutationer över flera sarcolemmal, sarkomeriskt, cytoplasmiska och nukleära proteiner. Utifrån presentationen av kliniska fenotyper och bevis för muskel engagemang från magnetisk resonanstomografi, undersökte vi orsaken till en dominerande LGMD finns på finska, amerikanska och italienska familjer 19. Sekvensering av positionella kandidater inom den mappade lokuset avslöjade mutationer i DNAJB6 uttryckte en gen som kodar en co-chaperone av HSP70 familjen som åtminstone två splitsade isoformer (nukleär och cytoplasmisk) hos människor. För att få ytterligare inblick i DNAJB6 funktion och dess relevans för LGMD vi granskat dess roll i muskel integritet i zebrafisk. RT-PCR av zebrafisk ortolog (dnajb6b) upptäckt uttryck så tidigt som fem-somit stadium, vilket följdes av injektion av embryon med en skarv-blockering morfolino. Vid 48 timmar efter befruktning, visade maskerade scoring avlossning av långsamfibrer från sina insättningspunkter. Specificitet denna fenotyp testades sedan med en andra icke-överlappande MO och räddade därefter med WT human DNAJB6 mRNA.
Att fråga hur förlusten av DNAJB6 funktion leder till defekter i muskulär integritet, introducerade vi missense mutationer har hittats hos patienter i humana transkript av båda isoformer och injicerade dem i zebrafisk embryon. Även injektion av WT human mRNA gav ingen märkbar fenotyp, phenocopied dessa förändringar förlusten av funktionen effekter MO när konstruerad i cytoplasma, men inte kärnkraft isoformen. Detta följdes av saminjektion av ekvimolära mängder av mutant och WT-mRNA, som visade ökad svårighetsgrad muskulösa fenotyp, vilket tyder på en dominerande effekten. För att testa detta begrepp, har ytterligare injektioner utförs med förändra molförhållanden av mutant och WT-mRNA. Konsekvent med förutsägelsen, ett överskott av mutant-mRNA jämfört med WT inducerad letalitet med embryon, medan enn överskott av WT producerade ett progressivt ökat räddning. Detta följdes av in vitro-experiment för att bestämma oligimerization egenskaper och risken för interaktioner protein. Dessa visade att mutationer försämrar antiaggregation aktivitet cytoplasmic DNAJB6 och störa omsättningen av både mutant och WT, samt interagera med en annan molekyl, BAG3, vilket också är relevant för pathomechanism av LGMD, eftersom LOF BAG3 orsakar en pediatrisk form av muskeldystrofi 20. Vi frågade sedan om BAG3 kunde modulera fenotypen inducerad av mutant DNAJB6b i zebrafisk. Även injektion av WT BAG3 ensamt gav ingen fenotyp, saminjektion med DNAJB6 mutanter signifikant ökad fenotypisk svårighetsgrad, vilket tyder på att BAG3 spelar en roll i att medla sjukdomsframkallande egenskaper hos dessa mutanter 19.
| Transient Zebrafish Modell | <td> mutantzebrafish LinjeTransgen mus Linje | ||
| Debutåldern för mänsklig fenotyp under utredning |
|
|
|
| Rimliga Fenotyper |
|
|
|
| Tid till användning (från födseln) | 1-7 dagar | > 3 månader | > 6 månader |
| Genomströmning | medelhög-hög | låg | låg |
| Fördelar |
|
|
|
Tabell 1. Jämförelse av in vivo-modeller.
Tabell 2. Exempel på in vivo modellering av mänskliga dysmorphologies. Olika fenotyper testas under den presenterade protokollet. En rad fenotypiska avläsning och visualiseringsteknik kan användas beroende på vilken typ av störning. Klicka här för att se större tabell.
Figur 1. In vivo funktionell testning av nonsynonymous varianter. En systematisk metod för funktionell testning av allaeles av okänt eller hypoteser betydelse. Gene knockdown via morpholino mikroinjektion följs av en serie av (sam) injektioner av både WT och muterade humana mRNA. Statistiska analyser av fenotypiska utfall informera allelen patogenicitet och molekylär funktion. Kortfattat, för förlust av funktionstester: Om knockdown ger en fenotyp som kan räddas ekvivalent med mutant och WT mRNA, är allelen sannolikt godartade (grön ruta). Om den muterade räddning av knockdown fenotypen är omöjlig att skilja från knockdown fenotyp, är allelen ett troligt funktionell null (gul ruta). Om den mutanta räddning av knockdown fenotypen är statistiskt bättre än MO, men värre än WT, är allelen sannolikt en hypomorph (grön ruta) För dominerande provningen:. Om injektion av mutant-mRNA är ekvivalent med den hos vildtyps-mRNA , allelen kan vara antingen godartad eller förlust av funktion, eller analysen kan ha misslyckats (grön ruta). Om injektion av mutant-mRNA är indis tinguishable från MO knockdown, är funktionen av genen produkten sannolikt förändras på något sätt. Att urskilja den ändrade funktionen, titrera mutant mRNA med vildtyp mRNA. Om resultatet av denna titrering är omöjliga att upptäcka vildtyp mRNA enbart använder det muterade proteinet produkten av vildtyp-protein som ett substrat, vilket därigenom indikerar en dominant negativ fenotyp (blå box). Om resultatet av denna titrering är omöjliga att mutant mRNA ensam, mutantproteinet produkten inte längre har samma funktion som den vilda typen, och därmed sannolikt en vinst på funktion (blå box). Om ingen fenotyp presenterar från MO knockdown, men gör detta med WT mRNA, kan ytterligare experiment uppstår bör WT human mRNA titreras för att minimera fenotypen, och kan också användas som ett nytt börvärde. Ytterligare saminjektion av WT och muterade humana mRNA kan utvärderas baserat på undsättning förmåga mutanten (rosa ruta).et = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Kvantitativ och kvalitativ utvärdering av MKS1 mutationer upptäckts hos människor. Under mks1 morphant embryon Missbildningar. Baserat på svårighetsgrad, var fenotyper indelas i tre grupper. Exempel på varje klass visas (a), och deras förekomst inom deras embryo kohorten (n = 100-160 embryon) har tabellform (visas ej). MO injicerade embryon med klass I fenotyper hade grovt normal morfologi men var kortare, med överdriven embryonal vävnad på gulan jämfört med kontroll injicerade embryon vid samma somitic ålder (8-9 somiter). Klass II morphants har gallrats, kort och hade dåligt utvecklad huvudet och strukturer svans, och dessutom saknade somitic definitionoch symmetri. Klass III embryon försenades starkt med dåligt utvecklade och missbildade somiter, vågformad notochords, och oftast inte överlever förbi den 10-somit skede. Samtidig injektion av humant MKS1 mRNA räddade var och en av dessa defekter, vilket visar specificiteten för fenotyper till mks1 suppression. In situ-hybridisering av embryon vid 11-somit stadiet (± 1 somit) färgad med krox20, pax2 och MyoD riboprober (b, c ). Fenotyper kvantifierades genom mätningar från den första till den sista märkbar somit av varje embryo (pilar), kvantifieras i c.. Figur anpassats med tillstånd från 15.
Figur 3. Exempel på in vivo modellering av mänskligt dysmorfologi. (A) Kraniofaciala dysmorfologi. Kontroll mRNA injicerat embryo (vänster) och mutant injicerat embryo (höger) färgades med Alcian blue på 5 DPF. Mutants mRNA-injicerade embryona visar särskilt små och missformade huvuden med en allmän oordning i det brosk kraniofaciala skelettet inklusive utspärrade branchial valv och saknade eller felaktiga konstruktioner. (B) Micro / macrocephaly. Kontroll oinjicerade embryo (vänster) och kctd13 MO-injicerade embryo (höger) vid 5 DPF. Morphants visa breddning av huvudet, såsom den ses av utrymmet mellan ögonen. 21 (c) minskad vaskulär integritet. Kontroll oinjicerade embryo (överst) och eng MO-injicerade embryo (botten) avbildas med fluorescensmikroskopi vid 2 dpf i en fli1: eGFP transgen reporter linje. Morphants visar försämrad groning av intersegmental fartyg och andra vaskulära strukturer. 41 (d) Förändrad hjärta looping. In situ hybridisering av uninjected vildtyp embryon (vänster) visar spaw expression i den vänstra sidoplattan mesoderm, medan ccdc39 morphant embryon uppvisade bilateral (höger) eller, i de flesta fall, odetekterbar spaw uttryck (icke visad). 43 (e) Kidney cystor. Icke injicerade WT embryo (överst) och ift80 morphant (underst). Morphants visade stora cystor (pil), perikardiell ödem (pilspets) och en ringlad svans. 44 (f) Minskad glomerulär filtration. Fluorescerande visualisering av en kontroll injicerade embryot (överst) och ift80 morphant (botten) 24 timmar efter injektion av Rhodamine dextran in i hjärtat. Fluorescens sprider hela kärlsystemet och är nästan helt evakueras via njurarna som sett den fullständiga frånvaron av fluorescens i kontrollen. Den morphant visar ihållande fluorescerande dextran, vilket tyder på minskad glomerulär filtration. 46 (g) muskeldystrofi. WT DNAJB6 mRNA injicerade embryona (överst) visar normala långsamma myofibers spänner somites normalt mellan intilliggande myosepta bestämd genom immunfärgning med anti-slow myosin antikropp. Mutant DNAJBb (botten) visade partiell till fullständig avlossning av myofibers från myosepta i en eller flera somiter. 19 (h) somit vinkel. Förstorad levande laterala vyer av kontroll oinjicerade (överst) eller kif7 morphants (botten) avbildas vid 30 HPF. Morphants visar onormalt formade somiter, hänförliga till ektopisk Hedgehog-signalering i zebrafisk myotome. 47
Alla siffror anpassats med tillstånd.
Discussion
De metoder som beskrivs här ett allmänt protokoll tillämpas på analysen enligt nonsynonymous förändringar i samband med ett flertal humana genetiska sjukdomar fenotyper (tabell 2, figur 3). Våra metoder har visat sig användbara för att utvärdera den potentiella inverkan av variation på sjukdom fenotyper, samt att hjälpa till att dissekera sjukdomsmekanismerna (t.ex. bidrag dominanta negativa mutationer till Bardet-Biedl syndrom, en huvudsakligen autosomalt recessiv sjukdom 17). Hittills genom utveckling av det presenterade beslutet trädet, har vi modellerat till en rimlig kostnad och tid som överstiger 200 gener kausalt samband med genetiska sjukdomar, till ett överskott på 1.000 alleler.
Även om det inte diskuteras i detalj här, har vi även visat att dessa metoder är lämpliga för att modellera andra typer av genetiska lesioner, såsom copy number variants (CNVs) samt och genetiska interaktioner. Analyser av sådana händelser är utanför ramen förden nuvarande metoden beskrivningen, även om de i grunden är beroende av samma princip om systematisk testning av kandidatgener (inklusive par av gener injiceras samtidigt) för att bestämma induktion eller förvärrande av kliniskt relevanta fenotyper. Till exempel kan belysa vilka av de 29 generna i 16p11.2 CNV vara relevanta för den observerade mikrocefali observerats hos patienter med upprepningar av en 660 kb genomisk segment, mRNA som motsvarar varje av de 29 generna inom segmentet injicerades och huvud storlek Mätningarna utfördes vid 2 dpf och 5 DPF, avslöjar ett viktigt bidrag för ett enda transkript, KCTD13. Dessutom 21 har vi använt denna modell för analys av genetiska interaktioner av genomiska lesioner hos patienter med både BARDET-Biedl syndrom och Hirschsprung sjukdom. 22 Genom jämförelse av MO undertryckande av de kausala gener från de två kliniska identiteter separat och samtidigt, kunde vi identifiera den resulterande fenotypen som being en synergistisk interaktion snarare än enbart additiv svårighetsgrad.
Trots att ha etablerat hög sensitivitet (98%) och specificitet (> 82%) för varianter som bidrar till ciliopathies 17, har vi ännu inte har tillräckliga uppgifter för att avgöra om dessa är generaliserbara till alla fenotypiska avläsning i zebrafisk modeller. För att göra detta, förutspådde ett stort antal alleler, genetiskt att vara antingen godartad eller patogena, måste provas inom varje fenotypisk kategori. Detta kommer att vara särskilt viktigt för genomförandet av sådana analyser i den kliniska inställningen, kan vilken funktionell tolkning av VUSs informera diagnos och behandling endast om en robust förståelse för falska positiva och falska negativa kan medfölja leveransen av sådana resultat för läkare och patienter. Ändå kan dessa metoder bidra avsevärt mot en bättre förståelse av landskapet av mänsklig genetisk sjukdom. Vi räknar med att dessa modeller inte bara kommer att fungera som ett stiftelsertion för förbättrad tolkning av klinisk genetisk information, men också kommer att anställas som användbara modeller för att genomföra terapeutiska skärmar. in vivo-data även kan jämföras med i silico computational förutsägelser från källor som PolyPhen 23, sikta 24, MutPred SNP & GO 25, eller 26 att visa numren. Observera att i en tidigare studie av förutsägelse databaser SNP & GO och MutPred befanns vara den mest exakta, med noggrannhet når bara 0,82 och 0,81, respektive. 27
Även om vi har beskrivit robustheten av dessa metoder för en delmängd av pediatriska anatomiska defekter (tabell 2, figur 3), vissa fenotyper är mindre lätthanterliga med dessa metoder. Vissa undantag trots, det finns tre huvudsakliga typer av sjukdomar inte mottagliga för våra protokoll. Vuxen ålder störningar (såsom Parkinsons sjukdom) utgör en utmaning för modellen i en embryonal systemet. Långsam progression degenerativa fenotyper (t.ex. frontotemporal demens) kan kräva mer tid än de sju dpf fönster MO aktivitet för att producera en fenotyp. Andra gen knockdown teknik såsom RNAi och siRNA finns att störa eller försämra genen mål, men det har visat sig att ingen är så specifika, stabil, icke-toxisk, eller långvarig som MOS 28, vilket också begränsar tidsramen för fenotypning. Tredje, har vissa ryggradsdjur strukturer, såsom däggdjur lungan, inte en tillräckligt ortologa struktur i zebrafisk embryot. Vi har också ett förslag beredskapsplan för utredning av sådana fall där WT human mRNA injektion leder till en fenotyp, men vi varnar för att detta är en ovanlig och oönskad situation.
Vissa sjukdomar fenotyper kan då kräva en högre grad av abstraktion och surrogatmoderskap. Det är möjligt att genfunktion har avvikit tillräckligt för att försvaga den fenotypiska likhet mellan modell och true fenotyp, eller att zebrafisk fysiologi komplicerar inneboende effekterna av inducerad sjukdom. I sådana fall föreslår vi ytterligare dissektion av den producerade fenotypen före avsättning. Vi har producerat några lyckade exempel där problematiska fenotyper för denna analys har modellerats i zebrafisk embryon. Till exempel, mutationer i TCF8 var en gen associerad med Fuchs corneal dystrofi (FCD), analyseras med hjälp av våra protokoll med hjälp Gastrulation defekter som ett surrogat fenotypisk avläsning utifrån kända roller i detta transkript i tidig utveckling. 29 I andra fall, t.ex. som vuxen ålder muskeldystrofi orsakas av mutationer i DNAJB6, kunde vi generera myofiber fenotyper i 5dpf embryon trots att människan är berövad märkbar muskel patologi i sina första tre till fyra decennier av liv. 19
Förutom de transienta muterade modellerna som presenteras här, har andra tagit även fördelaktigaGE i denna övergående system för att modellera människans sjukdomar i olika organ system. I ett exempel, var retinitis pigmentosa modelleras i zebrafisk av knockdown av genen RP2, vilket resulterar i retinal celldöd och minskad retinal laminering. Rescue med humant vildtyp mRNA resulterade i utvecklingen av alla tre skikten av retinal laminering, medan fyra av fem mutanta mRNA misslyckats med att rädda. 30 Även om denna modell av ett mänskligt sensorisk störning är baserad på en morfologisk fenotyp, är det också möjligt att assay svar på stimuli såsom akustisk skrämma eller prepulse inhibition. 47
Nyligen var en zebrafisk modell som används för att undersöka Alzheimers sjukdom patogenes genom amyloidprekursorprotein. 31 Författarna visade att genen knockdown orsakade nedsatt axonutväxt av motoriska nervceller, som skulle kunna räddas med humant mRNA. Denna modell har visat sig vara speciellt informativ, eftersom musmodeller bara visa subtila phenotypes (enda knockdown) eller postnatal dödlighet (dubbel knockdown). Förmågan att utvärdera zebrafisk embryon in vivo genom hela utvecklingen bidragit till att urskilja den patogena effekten av reducerad amyloidprekursorproteinet, samt förutsatt direkta bevis att proteinet kräver både en extracellulär och intracellulär domän för fullgod funktion. Andra noterbara modeller inkluderar att ytterligare muskeldystrofi 32, Diamond Blackfan anemi 33, Axenfeld-Reiger syndrom (okulär och kraniofaciala utveckling) 34, inflammatorisk tarmsjukdom 35 (antibakteriell aktivitet), Parkinsons sjukdom 36 (neuron och locomotion förlust), och beslag 37 (hydrocefalus och hyperaktivitet).
Vanligare är mutantzebrafish linjer som har visat också att rekapitulera en mänsklig sjukdom fenotyp. Kommenterad av 1,38, modeller inkluderar leukemi, melanom, dilaterade kardiomyopati, Duchennes muskeldystrofi,och många andra.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner stöd från en Duke University Dean Summer Research Fellowship (AN), American Heart Association (AHA) gemenskap 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) bidrag R01-EY021872 från National Eye Institute (EED), R01HD04260 från National Institute of Child Health and Development (NK), R01DK072301 och R01DK075972 från National Institute of Diabetes Digestive och njurpåverkan (NK), och Europeiska unionen (Finansierat av EU 7: e ramprogrammet enligt GA nr 241.955, projekt SYSCILIA,. EED, NK) NK är en Distinguished Jean och George W. Brumley Professor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
| DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
| Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
| Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
| Equipment | |||
| PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
| Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
| AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
| DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
| DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
| Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements | ||
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Gerdes, J. M., Davis, E. E., Katsanis, N. The vertebrate primary cilium in development, homeostasis, and disease. Cell. 137, 32-45 (2009).
- Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N. Engl. J. Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J. Clin. Invest. 119, 428-437 (2009).
- Marion, V. Exome sequencing identifies mutations in LZTFL1, a BBSome and smoothened trafficking regulator, in a family with Bardet-Biedl syndrome with situs inversus and insertional polydactyly. J. Med. Genet. 49, 317-321 (2012).
- Otto, E. A. Candidate exome capture identifies mutation of SDCCAG8 as the cause of a retinal-renal ciliopathy. Nat. Genet. 42, 840-850 (2010).
- Schaefer, E. Molecular diagnosis reveals genetic heterogeneity for the overlapping MKKS and BBS phenotypes. Eur. J. Med. Genet. 54, 157-160 (2011).
- Katsanis, N. The oligogenic properties of Bardet-Biedl syndrome. Hum. Mol. Genet. 13 Spec No 1, R65-R71 (2004).
- Badano, J. L. Dissection of epistasis in oligogenic Bardet-Biedl syndrome. Nature. 439, 326-330 (1038).
- Badano, J. L. Heterozygous mutations in BBS1, BBS2 and BBS6 have a potential epistatic effect on Bardet-Biedl patients with two mutations at a second BBS locus. Hum. Mol. Genet. 12, 1651-1659 (2003).
- Gerdes, J. M. Disruption of the basal body compromises proteasomal function and perturbs intracellular Wnt response. Nat. Genet. 39, 1350-1360 (2007).
- Leitch, C. C. Hypomorphic mutations in syndromic encephalocele genes are associated with Bardet-Biedl syndrome. Nat. Genet. 40, 443-448 (2008).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zaghloul, N. A., et al. Functional analyses of variants reveal a significant role for dominant negative and common alleles in oligogenic Bardet-Biedl syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10602-10607 (2010).
- Davis, E. E. TTC21B contributes both causal and modifying alleles across the ciliopathy spectrum. Nat. Genet. 43, 189-196 (2011).
- Sarparanta, J., et al. Mutations affecting the cytoplasmic functions of the co-chaperone DNAJB6 cause limb-girdle muscular dystrophy. Nat. Genet. 44, 450-455 (2012).
- Selcen, D. Mutation in BAG3 causes severe dominant childhood muscular dystrophy. Annals of neurology. 65, 83-89 (2009).
- Golzio, C., et al. KCTD13 is a major driver of mirrored neuroanatomical phenotypes of the 16p11.2 copy number variant. Nature. 485, 363-367 (2012).
- de Pontual, L., et al. Epistasis between RET and BBS mutations modulates enteric innervation and causes syndromic Hirschsprung disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13921-13926 (2009).
- Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7, 248-249 (2010).
- Kumar, P., Henikoff, S., Ng, P. C. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm. Nat. Protoc. 4, 1073-1081 (2009).
- Calabrese, R., Capriotti, E., Fariselli, P., Martelli, P. L., Casadio, R. Functional annotations improve the predictive score of human disease-related mutations in proteins. Hum. Mutat. 30, 1237-1244 (2009).
- Li, B., et al. Automated inference of molecular mechanisms of disease from amino acid substitutions. Bioinformatics. 25, 2744-2750 (2009).
- Thusberg, J., Olatubosun, A., Vihinen, M. Performance of mutation pathogenicity prediction methods on missense variants. Hum. Mutat. 32, 358-368 (2011).
- Summerton, J. E. Morpholino, siRNA, and S-DNA compared: impact of structure and mechanism of action on off-target effects and sequence specificity. Curr. Top. Med. Chem. 7, 651-660 (2007).
- Riazuddin, S. A., et al. Missense mutations in TCF8 cause late-onset Fuchs corneal dystrophy and interact with FCD4 on chromosome 9p. Am. J. Hum. Genet. 86, 45-53 (2010).
- Shu, X., et al. Knockdown of the zebrafish ortholog of the retinitis pigmentosa 2 (RP2) gene results in retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 2960-2966 (2011).
- Song, P., Pimplikar, S. W. Knockdown of amyloid precursor protein in zebrafish causes defects in motor axon outgrowth. PloS one. 7, e34209 (2012).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19, 623-633 (2010).
- Danilova, N., Sakamoto, K. M., Lin, S. Ribosomal protein S19 deficiency in zebrafish leads to developmental abnormalities and defective erythropoiesis through activation of p53 protein family. Blood. 112, 5228-5237 (2008).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D. S., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of axenfeld-rieger syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 7-22 (2012).
- Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4, 832-841 (2011).
- Sheng, D., et al. Deletion of the WD40 domain of LRRK2 in Zebrafish causes Parkinsonism-like loss of neurons and locomotive defect. PLoS genetics. 6, e1000914 (2010).
- Teng, Y., et al. Loss of zebrafish lgi1b leads to hydrocephalus and sensitization to pentylenetetrazol induced seizure-like behavior. PloS one. 6, e24596 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods Cell Biol. 76, 415-436 (2004).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Lee, N. Y. Endoglin regulates PI3-kinase/Akt trafficking and signaling to alter endothelial capillary stability during angiogenesis. Molecular Biology of the Cell. 23, 2412-2423 (2012).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 228, 30-40 (2003).
- Merveille, A. C., et al. CCDC39 is required for assembly of inner dynein arms and the dynein regulatory complex and for normal ciliary motility in humans and dogs. Nat. Genet. 43, 72-78 (2011).
- Beales, P. L. IFT80, which encodes a conserved intraflagellar transport protein, is mutated in Jeune asphyxiating thoracic dystrophy. Nat. Genet. 39, 727-729 (2007).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr. Nephrol. 23, 2095-2099 (2008).
- Putoux, A. KIF7 mutations cause fetal hydrolethalus and acrocallosal syndromes. Nat. Genet. 43, 601-606 (2011).
