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Biology

में मुताबिक़ पुनर्संयोजन Constructs Recombineering Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

मुताबिक़ पुनर्संयोजन तकनीक बहुत अग्रिम

Abstract

अंतर्जात जीन loci के तेजी से, बड़े पैमाने पर हेरफेर के लिए तकनीक के निरंतर विकास के मानव रोग से संबंधित अनुसंधान के लिए एक आनुवंशिक मॉडल जीव के रूप में ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का उपयोग व्यापक होगा. हाल के वर्षों के मुताबिक़ पुनर्संयोजन और recombineering तरह तकनीकी प्रगति को देखा है. हालांकि, स्पष्ट अशक्त म्यूटेशन या टैगिंग अंतर्जात प्रोटीन पैदा ज्यादातर जीनों के लिए एक बड़ा प्रयास रहता है. यहाँ, हम vivo में अंतर्जात स्थलों को निशाना बनाने और हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वैक्टर उत्पन्न करने recombineering आधारित क्लोनिंग तरीकों का उपयोग करने के लिए तकनीक का वर्णन है और दिखाना है विशेष रूप से, हम तीन प्रौद्योगिकियों के संयोजन की स्थापना की है. (1) बीएसी transgenesis / recombineering, ( 2) सिरों से बाहर मुताबिक़ पुनर्संयोजन और (3) गेटवे प्रौद्योगिकी अंतर्जात जीनोमिक loci जोड़ तोड़ के लिए एक मजबूत, कुशल और लचीला तरीका प्रदान करने के लिए. इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे (1) डिजाइन individua करने के बारे में कदम दर कदम विवरण प्रदानएल वैक्टर, (2) के अंतर की मरम्मत, और (3) कैसे recombineering के दूसरे दौर का उपयोग कर इन वैक्टर भीतर ब्याज की जीन को बदलने या टैग करने के लिए उपयोग कर मुताबिक़ पुनर्संयोजन वेक्टर में जीनोमिक डीएनए के बड़े टुकड़े क्लोन करने के लिए कैसे. अंत में, हम भी एक पीटा, या दस्तक के माध्यम से एक टैग जीन उत्पन्न करने के लिए vivo में इन कैसेटों को लामबंद करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करेगा. इन तरीकों को आसानी से समानांतर में कई लक्ष्यों के लिए अपनाया और एक समय और कुशल तरीके से ड्रोसोफिला जीनोम से छेड़छाड़ के लिए एक साधन प्रदान किया जा सकता है.

Introduction

उनके अंतर्जात loci में एक जीन की molecularly परिभाषित जोड़तोड़ साफ यूकेरियोटिक जीव विज्ञान से संबंधित प्रश्नों की एक बहुत बड़ी संख्या का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं. ड्रोसोफिला नुकसान के समारोह alleles के सृजन के लिए आनुवंशिक तकनीक रिवर्स Golic और उनके सहयोगियों में शुरू की जब तक चुनौतीपूर्ण हो करने के लिए साबित हो गया था विवो जीन ड्रोसोफिला 1-3 करने के मुताबिक़ पुनर्संयोजन का उपयोग कर निशाना. वे कहते हैं कि विशिष्ट जीनोमिक loci एक एकीकृत ट्रांसजेनिक निर्माण से डीएनए के एक रेखीय टुकड़ा का उपयोग लक्षित किया जा सकता का प्रदर्शन किया. इस रैखिक "दाता" डीएनए meganuclease मैं SCEI साथ linearization द्वारा पीछा FRT की मध्यस्थता पुनर्संयोजन (उत्पाद शुल्क को एक परिपत्र अणु के रूप में गुणसूत्र से डीएनए) के माध्यम से इन विवो में उत्पन्न होता है. इस पद्धति को सफलतापूर्वक परिभाषित घावों की एक किस्म उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, तकनीक समानांतर में कई जीन की हेरफेर के लिए आसानी से स्केलेबल नहीं किया गया है क्योंकि प्रत्येक व्यक्तिगतदोहरी पीटकर निर्माण विशिष्ट और कस्टम डिजाइन की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, मूल शास्त्रीय प्रतिबंध एंजाइम / बंधाव क्लोनिंग या पीसीआर, साथ ही इन विवो परिवर्तन वैक्टर में पारंपरिक का आकार सीमाओं का उपयोग कर इन विट्रो में डीएनए (> 5 केबी) के बड़े टुकड़े जोड़ तोड़ में कठिनाइयों अक्सर लक्षित कर मुताबिक़ पुनर्संयोजन का तेजी से निर्माण के साथ हस्तक्षेप वैक्टर. इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम सिरों से बाहर जीन एक कुशल और अपेक्षाकृत तेजी से मंच की स्थापना के लिए कार्यप्रणाली को निशाना बनाने के साथ, डीएनए के 100 केबी तक की उप क्लोनिंग और transgenesis की अनुमति देता है जो recombineering / transgenesis पी [acman] प्रणाली, संयुक्त कि ड्रोसोफिला जीन को निशाना बनाने की सुविधा.

पुनर्संयोजन की मध्यस्थता जेनेटिक इंजीनियरिंग (recombineering) 4,5 एक शक्तिशाली मुताबिक़ पुनर्संयोजन आधारित क्लोनिंग तकनीक है. पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम / ligase क्लोनिंग के विपरीत, recombineering अनुक्रम या siz के द्वारा ही सीमित नहीं हैचालाकी से डीएनए के ए. Recombineering एक विशेष ई. का उपयोग करता है एक दोषपूर्ण λ prophage 4 द्वारा प्रदान पुनर्संयोजन मशीनरी बंदरगाहों कि कोलाई तनाव. इस तकनीक को हाल ही में ड्रोसोफिला 6,7 में उपयोग के लिए अपनाया गया है. ड्रोसोफिला में Recombineering पी [acman] 6,7 नामक एक संशोधित सशर्त amplifiable जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) वेक्टर पर निर्भर करता है. OriV, अनुक्रमण और भ्रूण इंजेक्शन और बेसल शर्तों के तहत कम प्रतिलिपि संख्या रखता है जो श्वास, के लिए आवश्यक डीएनए की बड़ी मात्रा की शुद्धि के लिए रासायनिक प्रेरण पर उच्च प्रतिलिपि संख्या जो उत्पादन: इस वेक्टर प्रतिकृति के दो मूल वहन करती है. इसके अतिरिक्त, पी [acman] वेक्टर एक जीवाणु लगाव (attB) साइट के साथ सुसज्जित है. attB साइट ड्रोसोफिला जीनोम 8,9 भीतर एक पूर्व निर्धारित लैंडिंग साइट में बड़े डीएनए टुकड़े के समावेश की अनुमति देता है कि ΦC31 इंटिग्रेस की मध्यस्थता transgenesis के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है.

हम समाप्त होता है से बाहर मुताबिक़ पुनर्संयोजन 10,11 के लिए एक लक्ष्य वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक पी [acman] वेक्टर (पी [acman] को 1.0 कहा जाता है) उत्पन्न किया है. प्रणाली में प्रौद्योगिकी को निशाना बनाने को शामिल करने के लिए समाप्त हो जाती है, बाहर जीन, हम दो FRT और दो मैं SCEI साइटों गयी. हम भी पी [acman] को 1.0 में समरूपता के हथियारों को शामिल करने की प्रक्रिया को कारगर बनाने के लिए इस संशोधित वेक्टर भीतर एक गेटवे कैसेट को शामिल किया है. यह लक्षित कर वेक्टर में ब्याज के लगभग किसी भी जीनोमिक क्षेत्र लागू करने के लिए एक तेजी से और आसान तरीका प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल में हम पी [acman] को 1.0, और कैसे अंतर्जात ठिकाना लक्षित करने के लिए vivo में इस वेक्टर जुटाने के लिए उपयोग कर एक को लक्षित वेक्टर इंजीनियर के लिए का वर्णन करेंगे. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य के लिए हम ब्याज की एक जीन को बदलने के लिए आरएफपी / कान कैसेट का उपयोग करेगा, लेकिन एक एंटीबायोटिक चयन मार्कर होते हैं कि कैसेट की एक किस्म इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जा सकता है. हम कैसेट का एक सेट के लिए बनाया गया है और सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया हैजीन प्रतिस्थापन और टैगिंग 10,11.

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Protocol

1. बीएसी का चयन और लक्ष्य क्षेत्र

  1. ब्याज की जीन (भारत सरकार) (यहाँ CG32095 एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है), पर CG32095 के लिए खोज के साथ एक बीएसी प्राप्त करने के लिए www.flybase.org . खंड के शेयरों और अभिकर्मकों के तहत, CG32095 युक्त BACS के लिए, "जीनोमिक क्लोन" हकदार अनुभाग की जाँच करें. बीएसी कम से कम 10 केबी नदी के ऊपर और 5 केबी ब्याज के बहाव के जीन शामिल हैं सुनिश्चित करें. वैकल्पिक रूप से, पी [acman] वेक्टर 7 में क्लोन भी में पाया जा सकता http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. बीएसी क्लोन DH10B कोशिकाओं में आ गए और पी [acman] क्लोन EPI300 कोशिकाओं में आते हैं. जीनोमिक क्लोन recombineering के लिए उत्तरदायी हैं जो SW102 कोशिकाओं में तब्दील किया जाना चाहिए. "डर्टी minipreps" शुरू (एक स्तंभ का उपयोग और isopropanol का उपयोग डीएनए precipitating बिना एक Qiagen Miniprep) प्रदर्शन कर रहे हैंएक 5 मिलीलीटर हे / एन संस्कृति से बीएसी युक्त कोशिकाओं के साथ inoculated. DH 2 हे के 20 μl में ताजा बना डीएनए गोली की फिर से निलंबन के बाद, DH 2 हे के 100 μl में 1 μl पतला और electrocompetent SW102 electroporate को 1 μl का उपयोग करें. Electrocompetent SW102 निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए:
    1. पौंड के 4 मिलीलीटर में SW102 कोशिकाओं टीका लगाना. 32 में संस्कृति विकसित ° सीओ / n 250 rpm पर मिलाते हुए महत्वपूर्ण:. पुनर्संयोजन मशीनरी के शामिल होने की इच्छा है तो जब तक SW102 कोशिकाओं को 32 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान के संपर्क में किया जा कभी नहीं करना चाहिए.
    2. 44 मिलीलीटर लेग में संतृप्त SW102 संस्कृति के 1 मिलीलीटर टीका लगाना और 0.2-0.3 (आमतौर पर के बारे में 1-1.5 घंटा) के बीच 600 आयुध डिपो के लिए एक 32 डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन बढ़ने पर ध्यान दें:. अन्य recombineering प्रोटोकॉल के लिए एक छोटी मात्रा में संस्कृति बढ़ रही है की सिफारिश आयुध डिपो 600 0.6-0.7, लेकिन एक बड़ी मात्रा में एक कम घनत्व को बैक्टीरिया से बढ़ काफी परिवर्तन कुशल बढ़ जाती हैncy 12. इसके अलावा, इस संशोधन प्रतीक्षा समय कम कर देता है.
    3. 5 मिनट के लिए बर्फ का पानी घोल में संस्कृति शांत महत्वपूर्ण:. निम्नलिखित चरणों के दौरान कोशिकाओं कम तापमान पर रखा जाना चाहिए. यह अच्छी गुणवत्ता वाले electrocompetent कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    4. 10 मिनट के लिए 1500 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ठंड की 25 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस) 10% ग्लिसरॉल 13 में गोली धोने. सबसे पहले, बर्फ का पानी घोल में ट्यूब दोहन और घूमता द्वारा 5 मिलीलीटर में resuspend कोशिकाओं (विंदुक ऊपर और नीचे नहीं है) और फिर शेष 10% ग्लिसरॉल (20 मिलीलीटर) जोड़ें.
    5. 10 मिनट के लिए 1500 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 25 मिलीलीटर बर्फ ठंड 10% ग्लिसरॉल के साथ गोली एक दूसरी बार धोने.
    6. 10 मिनट के लिए 1500 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 25 मिलीलीटर बर्फ ठंड 10% ग्लिसरॉल के साथ गोली एक तीसरी बार धो लो.
    7. 10 मिनट के लिए 1500 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र और समर्थन त्यागनेernatant. सेल गोली इस बिंदु पर बहुत ढीला हो सकता है और जब discarding तैरनेवाला ध्यान रखा जाना चाहिए. ठंड 10% ग्लिसरॉल के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक tabletop microcentrifuge में 12,000 XG पर 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र ग्लिसरॉल / कोशिकाओं की ≈ 90 μl छोड़ने तैरनेवाला की सबसे त्यागें. कोशिकाओं को अब electroporated होने के लिए तैयार हैं. नोट: इस बिंदु पर कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस बाद में उपयोग के लिए -80 में संग्रहित किया जा सकता है. हालांकि, इस क्षमता कम हो सकती है.
    8. 1800 में वी, 25 μF, 200 Ω एक 1 मिमी क्युवेट का उपयोग कोशिकाओं में डीएनए Electroporate. Electroporation के बाद, समाज के 300 μl जोड़ने के लिए और 32 में कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए ठीक हो जाने डिग्री सेल्सियस (मिलाते हुए आवश्यक नहीं है). प्लेट अगर लेग पर कोशिकाओं के साथ साथ 25 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol के (या बदल बीएसी या पीएसी के आधार पर अन्य उचित एंटीबायोटिक) और 24-30 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  4. को लक्षित जीन के लिए अनुरूपता हथियार का चयन द्वारा डिजाइन किए हैंआईएनजी अपस्ट्रीम जीनोमिक डीएनए के 10 केबी और भारत सरकार को बहाव के सापेक्ष 5 केबी. 10 केबी के अंत में 500 बीपी और बढ़ाना 5 केबी अनुरूपता हथियार (धारा 2 देखें) (चित्रा 1) का चयन करें. ये 500 बीपी टुकड़े पी [acman] को 1.0 में भारत सरकार के आसपास के जीनोमिक क्षेत्र recombine के लिए इस्तेमाल किया अनुरूपता हथियार के रूप में सेवा करते हैं. ये टुकड़े अनुरूपता हाथ नीचे की ओर 3 से मेल खाती है कि इस क्षेत्र के लिए अनुरूपता हाथ और दाहिना हाथ (आरए) 'नदी के ऊपर 5 से मेल खाती है कि इस क्षेत्र के लिए बाएं हाथ (ला) के रूप में भेजा जाता है महत्वपूर्ण:. अनुरूपता हथियार BamHI शामिल नहीं होना चाहिए प्रतिबंध साइटों, प्लाज्मिड के linearization के रूप में (3.2 कदम में) एक BamHI प्रतिबंध पचाने के माध्यम से पूरा किया है.

2. पी [acman] को 1.0 में अनुरूपता हथियार डालें

  1. दो व्यक्ति पीसीआर प्रतिक्रियाओं सेट अप, एक आरए बढ़ाना ला और एक और बढ़ाना. ला के लिए, प्राइमरों attB1-मैंने SCEI ला एफ और BamHI ला R उपयोग और प्राइमरों BamHI-आर ए एफ और attB2-मैंने SCEI-RA-R उपयोगआरए (1 टेबल) बढ़ाना. कदम 1.2 या एक टेम्पलेट के रूप में ब्याज की बीएसी युक्त उबला हुआ रातोंरात जीवाणु संस्कृति के 0.5 μl से बीएसी डीएनए की 1 μl का प्रयोग करें. क्षमता proofreading साथ एक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग सुनिश्चित करें. इस कदम 2.8 और 3.13 में पीसीआर की जांच के अपवाद PCRs के साथ बाद के सभी पर लागू होता है. नोट: एक proofreading डीएनए पोलीमरेज़ के लिए एक्सटेंशन समय निर्माता के आधार पर नियमित Taq डीएनए पोलीमरेज़ से अलग हो सकता है. 15 सेकंड / केबी की दर से polymerizes जो PfuUltra द्वितीय फ्यूजन HotStart, इन चरणों में किया जा सकता है.
    ला / आरए पीसीआर
    1 μl बीएसी के कदम 1.2 से गंदा Miniprep से डीएनए
    0.25 μl प्रत्येक 20 माइक्रोन प्राइमर
    2.5 μl 10X PfuUltra द्वितीय बफर
    0.75 μl 10mM (प्रत्येक) dNTP
    0.5 μl PfuUltra द्वितीय फ्यूजन HotStart डीएनए पोलीमरेज़
    19.75 μl पानी
    25 μl कुल वॉल्यूम
    पीसीआर शर्तें
    चरण 1 एंजाइम सक्रिय करने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
    चरण 2 95 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड denature
    चरण 3 60 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड annealing
    Step4 72 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड विस्तार
    Step5 चरण 2 और 29 चक्र को दोहराने के लिए जाओ
    Step6 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो
  2. एक 1% agarose जेल पर नमूने को चलाने और एक Zymoclean डीएनए वसूली किट उत्पादों का उपयोग कर निकाल सकते हैं. बाँझ पानी के 10 μl के साथ Zymoclean स्तंभ से डीएनए Elute.
  3. (पीसीआर एस विस्तार अतिव्यापी द्वारा splicing के प्रदर्शन करना2.2 (चित्रा 2) में शुद्ध प्रत्येक प्रवर्धित उत्पाद से डीएनए की कुल 10-30 एनजी का उपयोग करते हुए दो टुकड़े के साथ ँ). यह आमतौर पर लगभग प्रत्येक शुद्ध पीसीआर उत्पाद के 1/20 वें है:
    ला / आरए पीसीआर Soe
    0.5 μl प्रत्येक ला और आरए शुद्ध पीसीआर उत्पाद लगभग 10-30 एनजी
    0.25 μl प्रत्येक 20 माइक्रोन प्राइमर
    2.5 μl 10X PfuUltra द्वितीय बफर
    0.75 μl 10mM (प्रत्येक) dNTP
    0.5 μl PfuUltra द्वितीय फ्यूजन HotStart डीएनए पोलीमरेज़
    19.25 μl पानी
    25 μl कुल वॉल्यूम
    पीसीआर शर्तें
    चरण 1 एंजाइम सक्रिय करने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
    चरण 2 95 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड denature
    चरण 3 55 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड (पानी रखना हथियारों के लिए अनुमति देने के लिए कम अस्थायी.) Annealing
    Step4 72 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड विस्तार
    Step5 चरण 2 और 1 चक्र दोहराने के लिए जाओ
    Step6 95 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड denature
    Step7 60 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड annealing
    Step8 72 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड विस्तार
    Step9 चरण 2 और 27 चक्र को दोहराने के लिए जाओ
    Step10 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो
  4. एक agarose जेल पर पीसीआर नमूना चलाने के लिए और जेल निकासी से 1.0 केबी बैंड की वसूली. इस attB1 ला BamHI-आरए attB2 कैसेट है.
  5. निर्माता द्वारा प्रदान की गई प्रोटोकॉल के बाद एक बी.पी. प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए गेटवे बी.पी. ClonaseII एनजाइम किट का प्रयोग करें.2.4 में उत्पन्न कैसेट दाता डीएनए और गंतव्य वेक्टर के रूप में पी [acman] को 1.0 के रूप में कार्य करेगा.
  6. ठंड 10% ग्लिसरॉल या ठंड DH 2 ओ के 30 μl जोड़कर TransforMax EPI300 electrocompetent कोशिकाओं के 50 μl पतला निर्माता द्वारा प्रदान की गई प्रोटोकॉल के बाद electrocompetent कोशिकाओं में बीपी प्रतिक्रिया की 1 μl रूपांतरण. पानी के अलावा electroporation के दौरान बिजली के निर्वहन (arcing) को रोकने के लिए बीपी की प्रतिक्रिया का काफी उच्च नमक एकाग्रता dilutes. 1800 में वी, 25 μF, 200 Ω एक 1 मिमी क्युवेट का उपयोग कोशिकाओं में डीएनए Electroporate.
  7. समाज के 300 μl जोड़ें और 37 में कोशिकाओं के 1 घंटे के लिए ठीक हो जाने डिग्री सेल्सियस (मिलाते हुए आवश्यक नहीं है). प्लेट लेग अगर पर कोशिकाओं + एम्प (पी [acman] को 1.0 एक एम्प प्रतिरोध जीन होता है) का 50 माइक्रोग्राम / एमएल. 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.
  8. पीसीआर पी [acman] को 1.0 (चित्र में गेटवे कैसेट के बहाव है टी 3 (टी 3 अनुक्रम का उपयोग पारंपरिक कॉलोनी पीसीआर द्वारा व्यक्तिगत कालोनियों की जांचउरे 1) और attB1-मैंने SCEI ला एफ प्राइमरों. सकारात्मक क्लोन 1.2 केबी पर चलाता है कि एक बैंड दिखाई देंगे.
  9. 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ लेग में एक सकारात्मक क्लोन की एक रात संस्कृति विकसित.
  10. 50 माइक्रोग्राम / निर्माता प्रोटोकॉल (Epicentre) के बाद नकल पर नियंत्रण के समाधान का उपयोग मिलीलीटर एम्पीसिलीन संस्कृति के साथ एक 10 मिलीलीटर लेग में ला और आरए युक्त पी [acman] को 1.0 वेक्टर बढ़ाना.
  11. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक Qiagen Miniprep प्रदर्शन करना.

3. पी [acman] को 1.0 में ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र recombining

दिन 1

  1. पौंड के 4 मिलीलीटर प्लस 25 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol (CHL) या उपयुक्त चयन एंटीबायोटिक में ब्याज की बीएसी युक्त SW102 कोशिकाओं टीका लगाना. 32 में संस्कृति विकसित ° सीओ / n 250 rpm पर मिलाते हुए महत्वपूर्ण:. उच्च तापमान पुनर्संयोजन मा को सक्रिय रूप अलावा 3.5 चरण में शामिल करने के दौरान, SW102 कोशिकाओं, 32 से अधिक डिग्री सेल्सियस तापमान के संपर्क में नहीं होना चाहिएइन कोशिकाओं के chinery.

2 दिन

  1. पी [acman] के डाइजेस्ट 0.4 ग्राम एक 25 μl प्रतिक्रिया में BamHI की ≈ 20 इकाइयों के साथ धारा 2 में उत्पन्न ला और आरए हथियार युक्त-KO-1.0. कम से कम 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते महत्वपूर्ण:. लंबे पाचन सभी डीएनए की पाचन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस पर बाद में झूठी सकारात्मक क्लोन की संख्या में कमी होगी.
  2. 44 मिलीलीटर लेग Chl (25 माइक्रोग्राम / एमएल) में संतृप्त SW102/BAC संस्कृति के 1.0 मिलीलीटर टीका लगाना और 0.2-0.3 (आमतौर पर के बारे में 1-1.5 घंटा) के बीच 600 आयुध डिपो के लिए एक 32 डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन पर होते हैं. गैर एचएस नियंत्रण के लिए एक अतिरिक्त समान नमूना शामिल करें. यह नमूना सिर्फ एच एस के अपवाद के साथ हर एक पहलू में प्रयोगात्मक एक तरह व्यवहार किया जाएगा. इस गैर गर्मी हैरान संस्कृति एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. गैर एचएस नियंत्रण प्लेट (कदम 3.13) पर कई कालोनियों की उपस्थिति आमतौर पर पचाया नहीं पी [acman] को 1.0 ला के साथ परिवर्तन को इंगित करता हैप्लाज्मिड / आरए.
  3. संस्कृति बढ़ रही है, जबकि एक जेल पर BamHI प्रतिबंधित पी [acman] को चलाते हैं. फिर जेल निकालने और पानी के 10 μl में डीएनए elute 55 से गरम डिग्री सेल्सियस नोट: किसी भी बफर में डीएनए elute मत करो. बफर में मौजूद साल्ट electroporation के दौरान बिजली के निर्वहन के कारण हो सकता है.
  4. नहाने के पानी में ठीक 15 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 42 पर गर्मी झटका संस्कृति. इस SW102 कोशिकाओं की recombineering मशीनरी को सक्रिय करेंगे. सदमे नियंत्रण संस्कृति गर्मी नहीं है.
  5. इसके तत्काल बाद गर्मी झटका, स्थानांतरण गर्मी हैरान और गैर एचएस नियंत्रण संस्कृतियों ठंडा 50 मिलीलीटर विहित ट्यूबों के लिए और 5 मिनट के लिए एक बर्फ के पानी के घोल में संस्कृतियों सर्द देना महत्वपूर्ण:. निम्नलिखित चरणों के दौरान कोशिकाओं कम तापमान पर रखा जाना चाहिए . यह अच्छी गुणवत्ता वाले electrocompetent कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  6. 10 मिनट के लिए 1500 XG पर संस्कृति अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ठंड की 25 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस) 10% ग्लिसरॉल 13 में गोली धोने. सबसे पहले,बर्फ के पानी के घोल (विंदुक ऊपर और नीचे नहीं है) और फिर शेष 10% ग्लिसरॉल (20 मिलीलीटर) जोड़ने में ट्यूब दोहन और घूमता द्वारा 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend.
  7. 10 मिनट के लिए 1500 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 25 मिलीलीटर बर्फ ठंड 10% ग्लिसरॉल एक दूसरी बार के साथ गोली धोने.
  8. 10 मिनट के लिए 1500 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 25 मिलीलीटर बर्फ ठंड 10% ग्लिसरॉल एक तिहाई समय के साथ गोली धोने.
  9. 10 मिनट के लिए 1500 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. सेल गोली इस बिंदु पर बहुत ढीला हो सकता है और जब discarding तैरनेवाला ध्यान रखा जाना चाहिए. ठंड 10% ग्लिसरॉल के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक tabletop microcentrifuge में 12,000 XG पर 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र . पानी / कोशिकाओं नोट की ≈ 90 μl छोड़ने तैरनेवाला की सबसे त्यागें: इस बिंदु कोशिकाओं में -80 डिग्री सेल्सियस पर बाद में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है. हालांकि, इस क्षमता कम हो सकती है.
  10. के 2 μl जोड़ें BamHI पचा पी [acman] (50 एनजी के लिए उद्देश्य) कोशिकाओं को और एक विंदुक टिप का उपयोग धीरे मिश्रण. एक 1 मिमी electroporation क्युवेट में कोशिकाओं स्थानांतरण और 1800 वी, 25 μF, 200 Ω पर electroporate.
  11. समाज के 300 μl जोड़ें और 32 में कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए ठीक हो जाने डिग्री सेल्सियस (मिलाते हुए आवश्यक नहीं है). प्लेट अगर लेग पर कोशिकाओं के साथ साथ 24-30 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन और सेते हैं.

3 दिन

  1. उचित अंतराल की मरम्मत का उपयोग कर कॉलोनी पीसीआर के लिए स्क्रीन. आरए और T7 और ला (1 टेबल) के लिए ला चेक प्राइमर के लिए प्राइमरों जाँच T3 और आर ए का प्रयोग करें. पीसीआर जांच आरए और लक्षित क्षेत्र की ओर पीसीआर जांच ला प्राइमरों 100-200 बीपी (1 टेबल) डिजाइन. . T3 या T7 के साथ पीसीआर जांच ला के साथ पीसीआर जांच आरए का उपयोग करते हुए पीसीआर प्रतिक्रियाओं से सकारात्मक कालोनियों 800-1000 बीपी (चित्रा 3) के नोट पर चलाता है कि एक बैंड दिखाएगा: यह एक के शामिल करने के बाद दोनों हथियार का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है बांहलेकिन अन्य नहीं कभी कभी मनाया जाता है.
  2. लेग 50 माइक्रोग्राम / रात भर के लिए मिलीलीटर एम्पीसिलीन के 4 मिलीलीटर में 32 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर सत्यापित कालोनियों आगे बढ़ें. बाद में उपयोग करने के लिए इन कोशिकाओं का एक जमे हुए शेयर करें.

4. लक्ष्य निर्धारण कैसेट के साथ जीनोमिक क्षेत्र की जगह

4 दिन

  1. एक टेम्पलेट और 5'HA-आरएफपी / कान एफ और 3'HA-आरएफपी / कान आर प्राइमरों (जैसे pENTR-RFP/KAN (linearize को एएससीआई और NheI साथ predigested) का उपयोग करते हुए पीसीआर द्वारा आरएफपी / कान पीटकर कैसेट बढ़ाना तालिका 1). आरएफपी / कान कैसेट संदर्भ 11 से अनुरोध किया जा सकता है.
  2. जेल बाँझ पानी के 20 μl में eluting पीसीआर उत्पाद शुद्ध. आरएफपी-कान कैसेट प्लस अनुरूपता हथियार 3 केबी आसपास चलाने चाहिए.
  3. 44 मिलीलीटर लेग एम्प (50 माइक्रोग्राम / एमएल) में संतृप्त SW102 / पी [acman] को संस्कृति (कदम 3.13) के 1 मिलीलीटर टीका लगाना और डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन 600 आयुध डिपो को 0.2-0.3 के बीच 32 पर होते हैं. गैर एचएस नियंत्रण के लिए एक अतिरिक्त समान नमूना शामिल करें. यह नमूना सिर्फ इलाज किया जाएगाएच एस के अपवाद के साथ हर एक पहलू में प्रयोगात्मक एक तरह.
  4. SW102 / पी [acman] को संस्कृति वांछित घनत्व पहुंचता बाद, 3.5 से 3.10 के लिए चरणों का पालन करें.
  5. Electrocompetent SW102 / पी [acman] को कोशिकाओं के 90 μl में कैसेट को निशाना बनाने का लगभग 100 एनजी Electroporate. एक 1 मिमी electroporation क्युवेट में कोशिकाओं स्थानांतरण और 1800 वी, 25 μF, 200 Ω पर electroporate. समाज के 300 μl जोड़ें और कोशिकाओं को 32 से कम 2 घंटे के लिए ठीक करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस (मिलाते हुए आवश्यक नहीं है). नोट: यह अत्यधिक कैसेट शुद्ध एक ताजा जेल का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
  6. लेग अगर + एम्प (50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर) + कान (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और 32 पर 24-30 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस में प्लेट कोशिकाओं

5 दिन

  1. 32 ° सीओ / एन में 5 अलग कालोनियों से संस्कृति के 5 मिलीलीटर बढ़ो

दिन 6

  1. एक "गंदा Miniprep" प्रदर्शन और जनसंपर्क के लिए देखने के लिए एक 1% agarose जेल पर प्राप्त डीएनए के आधे चलानेप्लाज्मिड एक कम आणविक भार के esence. Bellow के 12 केबी चलता है कि किसी भी प्लाज्मिड नहीं होना चाहिए. (चित्रा 4)
  2. एक सकारात्मक क्लोन से डीएनए के एक 1:500 कमजोर पड़ने बनाओ और TransforMax EPI300 के 50 μl में electroporate को 1 μl उपयोग महत्वपूर्ण:. एक कक्ष में कई plasmids के electroporation के रोकने के लिए डीएनए पतला करने के लिए सुनिश्चित करें. लेग अगर + एम्प (50 माइक्रोग्राम / एमएल) में प्लेट कोशिकाओं + कान (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और 37 में 18-24 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस

7 दिन

  1. लेग + की 10 मिलीलीटर में एक ही कॉलोनी टीका लगाना और हे / एन बढ़ने

दिवस 8

  1. कदम 4.10 से संतृप्त संस्कृति के साथ लेग मीडिया के बीज 100 मिलीलीटर. उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ साथ 5-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से कम 1,000 एक्स प्रतिलिपि नियंत्रण समाधान और सेते के 100 μl जोड़ें.
  2. एक maxiprep प्रदर्शन और अनुक्रमण द्वारा सही साइट में कैसेट की प्रविष्टि को सत्यापित.
  3. अनुक्रमण के अलावा, एक प्रतिबंध Enzym प्रदर्शनकिसी भी कम आणविक वजन प्लाज्मिड और अपने माता पिता का डीएनए शामिल नहीं किया था कि एक क्लोन से डीएनए के साथ ई पाचन परीक्षण. चयनित प्रतिबंध एंजाइमों प्रत्येक जीन के लिए अलग हो सकता है लेकिन लक्ष्य recombineered वेक्टर चिह्नित करने के लिए अन्वेषक के लिए अनुमति देते हैं कि एंजाइमों के एक समूह को खोजने के लिए है. उदाहरण के वैसे, CG32095 लक्ष्यीकरण वेक्टर क्रमानुसार Paci, एएससीआई, BamHI और AatII साथ पचा गया था. किसी भी गलत बैंड के सभी भविष्यवाणी बैंड और अभाव की उपस्थिति को लक्षित वेक्टर सही ढंग से (चित्रा 5) recombineered किया गया है कि पुष्टि करता है.

5. मक्खियों इंजेक्शन और Vivo में कैसेट जुटाने

  1. चुनाव के एक पूर्व निर्धारित लैंडिंग साइट में, ΦC31 इंटिग्रेस का उपयोग कर कैसेट इंजेक्षन. ऐसे इंद्रधनुष ट्रांसजेनिक्स (के रूप में बाहर विक्रेताओं, http://www.rainbowgene.com ), इंजेक्शन सेवाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है महत्वपूर्ण:. डीएनए हौसले पी होना चाहिएइंजेक्शन से पहले repared. हायर परिवर्तन दक्षता डीएनए साइट पर तैयार किया जाता है जब मनाया और उसी दिन इंजेक्ट किया जाता है.
  2. लैंडिंग साइट से कैसेट को लामबंद करने के लिए, ब्लूमिंगटन शेयर नंबर 25680 या 25679 का उपयोग करें. इन शेयरों में क्रमश: गुणसूत्र दो और तीन, पर एक गर्मी झटका प्रमोटर के Flippase और मैं SCEI बहाव, होते हैं. इसके अलावा, वे balancer के गुणसूत्र पर और वाई गुणसूत्र पर एक एच एस-छुपाया transgene होते हैं. चुने हुए स्टॉक से पुरुषों लीजिए और लैंडिंग साइट में को कैसेट ले जाने कुंवारी महिलाओं को पार. . सेट ~ 30 पार और महिलाओं के 2-3 दिनों के लिए अंडे देना करने की अनुमति नोट: यह लक्षित ठिकाना से एक अलग गुणसूत्र पर है कि स्टॉक का चयन करने के लिए सिफारिश की है.
  3. फ्लिप 30 शीशियों का एक नया सेट में माता - पिता, और लगातार तीन दिनों के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी झटका लार्वा, दिन में दो बार. गर्मी झटके एंजाइमों के उत्पादन को सक्रिय; flippase और मैं SCEI, और कोशिका मृत्यु जीन छुपाया
  4. गर्मी हैरान मक्खियों की F1 संतान से कुंवारी महिलाओं लीजिए, और y को पार - डब्ल्यू - पुरुषों. तीन कुंवारी और पार प्रति तीन पुरुषों, 150-200 पार के लिए निशाना लगाओ.
  5. आंख में आरएफपी का पता लगाने की अनुमति देता है कि एक फ्लोरोसेंट गुंजाइश के तहत F2 संतान स्क्रीन. सफेद और पीले रंग की जीन (- डब्ल्यू - वाई) के लिए उत्परिवर्ती हैं कि आरएफपी सकारात्मक आंखों के लिए स्क्रीन. इस जांच प्रक्रिया के सकारात्मक आरएफपी कैसेट की उपस्थिति के लिए चयन और जंगली प्रकार पीले जीन नोट द्वारा चिह्नित है जो पी [acman] वेक्टर (मिनी सफेद) और लैंडिंग साइट के अभाव के लिए चुनता है. यह कम समय है चुनावYW मक्खियों के लिए पहली स्क्रीन की तुलना में, आंखों में आरएफपी के लिए स्क्रीन Suming. डब्ल्यू - - मक्खियों जुटाना घटनाओं वाई की तुलना में, आंखों में आरएफपी युक्त कई कम मक्खियों, जिसके परिणामस्वरूप गर्मी झटके दौरान बहुत कुशल हैं.
  6. प्रत्येक जुटाना घटना अलग हो सकता है, के बाद से आरएफपी + मक्खी - डब्ल्यू - प्रत्येक वाई के साथ एक जोड़ी matings सेट करें. सही गुणसूत्र के लिए आरएफपी मानचित्र. सही गुणसूत्र लक्ष्यीकरण आमतौर पर मामलों की> 95% में मनाया जाता है.
  7. शेयरों की स्थापना और दक्षिणी ब्लाट विश्लेषण के लिए मानक तकनीक का उपयोग कर सही को निशाना बनाने की घटनाओं के लिए जाँच करें. एक 2 केबी जांच अपस्ट्रीम (बाएं हाथ) और डाउनस्ट्रीम (दाहिना हाथ) जीन को निशाना बनाया जा रहा है, और नष्ट ओआरएफ फैले 2 केबी (या यदि आवश्यक हो तो कम) डिजाइन. पहले दो जांच ओआरएफ समयुग्मक पीटकर में एक बैंड नहीं निकलेगा कि, जबकि wildtype में मौजूद नहीं है, समयुग्मक और विषमयुग्मजी knockouts में एक बैंड निकलेगा. एक त्वरित पीसीआर चया ओआरएफ भी संभव है, लेकिन यह एक बैंड की अनुपस्थिति पर निर्भर करता है.

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Representative Results

ला और आरए अनुरूपता हथियार के प्रवर्धन 500 बीपी उत्पादों का उत्पादन करना चाहिए और पीसीआर SOE प्रतिक्रिया एक 1.0 केबी उत्पाद (धारा 2.1-2.4, चित्रा 2) उपज चाहिए. खंड 2.5 में प्रदर्शन बी.पी. प्रतिक्रिया आम तौर पर उत्पाद पैदावार औसतन 5-100 कालोनियों का बहुत ही कुशल और जीवाणु परिवर्तन है. लगभग पीसीआर के साथ परीक्षण सभी कालोनियों उम्मीद पीसीआर उत्पाद दिखाने की जाँच करें.

Recombineering के पहले दौर (धारा 3) के दौरान पचा पी के परिवर्तन के बाद 20-40 कालोनियों प्राप्त करने की उम्मीद [acman] SW102 कोशिकाओं में ला और आरए हथियार युक्त-KO-1.0. इन क्लोन के 40-60% वांछित पुनर्संयोजन उत्पाद ले जाएगा. किसी भी कालोनियों के रूप में गर्मी हैरान कोशिकाओं की तुलना में अगर गैर गर्मी झटका नियंत्रण बहुत कुछ शामिल करना चाहिए. नमूना और नियंत्रण प्लेटें दोनों पर कालोनियों की एक ही नंबर की उपस्थिति आमतौर पर काटा हुआ प्लाज्मिड की उपस्थिति या कुछ अन्य दूषित पदार्थों को इंगित करता है. इस मामले में, प्रयोग मज़ाld के त्याग और दोहराया जाना, पी [acman] पचाने इस समय 3.2 कदम में वर्णित अनुदेश का पालन पूरा करने के लिए ला और आरए हथियार ले जाने-KO-1.0. ≈ 60 कालोनियों को प्राप्त किया गया, जिसमें पी [acman] को 1.0 में ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र की बहाली के लिए एक पीसीआर की जांच का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. कालोनियों के यहां 60% वांछित पुनर्संयोजन product.Care न्यायपालिका पीसीआर बैंड आमतौर पर गलत recombineering घटनाओं से संकेत मिलता है के बाद से मनाया पीसीआर उत्पादों, भविष्यवाणी आकार में चला रखा जाना चाहिए कि किए गए परीक्षण किया गया.

कभी कभी कोई कालोनियों recombineering के पहले दौर के बाद बढ़ेगा. उप इष्टतम दक्षता के साथ कोशिकाओं का उपयोग कर एक असफल recombineering प्रतिक्रिया के लिए सबसे आम कारण का प्रतिनिधित्व करता है. Washes के दौरान उनकी तैयारी और कोमल हैंडलिंग (कभी भंवर) के दौरान हर समय ठंड कोशिकाओं को ध्यान में रखते हुए उच्च गुणवत्ता सक्षम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमेशा इस्तेमाल करने की कोशिश हौसले पचा / पी [acman] को शुद्ध1.0 डीएनए उच्चतम दक्षता प्राप्त करने के लिए.

कभी कभी recombineering पैदावार कालोनियों लेकिन उन कालोनियों के पहले दौर पीसीआर की जांच परख के पास नहीं है. यह आमतौर पर गलत recombineering उत्पादों को इंगित करता है, लेकिन इस तरह के परिणाम भी प्राइमर सेट में से एक के साथ संभावित समस्याओं का संकेत हो सकता है. पीसीआर जांच ला प्राइमर को मान्य करने के लिए, attB1-मैंने SCEI ला एफ के साथ संयोजन में एक पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थापना की. पीसीआर जांच आरए attB2-मैंने SCEI-आरए आर के साथ एक पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थापना की. सत्यापित करने के लिए दोनों ही मामलों में एक टेम्पलेट के रूप में मूल बीएसी का उपयोग करें. ये पीसीआर प्रतिक्रियाओं की जांच प्राइमरों के अनुक्रम के आधार पर अलग अलग होंगे जो उम्मीद आकार के उत्पादों, उपज चाहिए. इस पर नियंत्रण के प्रयोग से सकारात्मक परिणाम सकारात्मक क्लोन का पता लगाने में असमर्थता प्राइमर अक्षमता की वजह से है कि संभावना से इनकार करेगा.

आप किसी भी सफलता के बिना ऊपर प्रोटोकॉल के बाद कई बार recombineering के पहले दौर की कोशिश की है और सभी का प्रदर्शन किया हैनियंत्रण का सुझाव दिया, हम 500 बीपी अनुरूपता हथियारों की एक नई जोड़ी को चुनने की सलाह देते हैं. वर्तमान समय में स्पष्ट नहीं कर रहे हैं कि कारण के लिए, कुछ जीनोमिक क्षेत्रों डीएनए पुनर्संयोजन के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. बस नए अनुरूपता हथियार डिजाइन और ब्याज की जीन की ओर या दूर से उन्हें चलती कभी कभी इन समस्याओं को हल करती है.

recombineering के दूसरे दौर (भाग 4) आम तौर पर बहुत अधिक कुशल है. आम तौर पर 30-50 कालोनियों वांछित निर्माण युक्त इनमें से 90-95% के साथ, परिवर्तन के बाद मनाया जाता है. इस चरण में सबसे आम समस्या झूठी सकारात्मक कालोनियों प्राप्त है. चित्रा 4 recombineering के दूसरे दौर (भाग 4) के बाद सही और गलत सकारात्मक क्लोन के उदाहरण से पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. पी के योजनाबद्धrocess एक पी [acman] उत्पन्न करने वाली को 1.0 को लक्षित वेक्टर. चान एट अल से संशोधित. (2012). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. पीसीआर (पीसीआर SOE) कदम 2.3 पर प्रदर्शन अतिव्यापी द्वारा splicing की योजनाबद्ध. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. पहले recombineering घटना की जेल दिखा दक्षता पीसीआर की जांच प्रत्येक लेन एक ही कॉलोनी का प्रतिनिधित्व करता है एक:.. कालोनियों बाएं हाथ के लिए परीक्षण किया. T7 और ला की जांच प्राइमरों का उपयोग एकीकरण बी:. T3 और आरए की जांच primers.1kb प्लस डीएनए सीढ़ी एक आणविक भार मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था का उपयोग कर नोट दाहिने हाथ एकीकरण के लिए परीक्षण एक के रूप में ही कालोनियों,: T3 की गरीब भड़काना के कारण T7 के सापेक्ष प्राइमर, दाहिने हाथ की जांच के बैंड काफी गहरे थे. जेल देखते समय यह ध्यान में रखा जाना चाहिए.

चित्रा 4
4 चित्रा. डीएनए agarose जेल डीएनए 4 संभावित सकारात्मक क्लोन से अलग किया. उच्च आणविक भार प्लास्मिड (पी [acman]) और recombineering के दूसरे दौर के बाद संभावित सकारात्मक क्लोन से पृथक कम आणविक वजन प्लाज्मिड (अव्यवस्थित टेम्पलेट) था दिखा रहा है और एक 1% agarose जेल पर दौड़ा ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग. क्लोन 1,3 और 4 सच सकारात्मक क्लोन कर रहे हैं. क्लोन के रूप में 2 एपी के सभी रूपों से विख्यात एक झूठी सकारात्मक है lasmid कि bellow के 12 केबी (डीएनए सीढ़ी लेन में सबसे बड़े आकार बैंड) चलाता है. 1 केबी प्लस डीएनए सीढ़ी एक आणविक भार मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट द्वारा वांछित पुनर्संयोजन घटना के लिए टेस्ट. ऊपर के उदाहरण में दिखाया गया है एक कंप्यूटर भविष्यवाणी को CG32095 से पहले और recombineering के दूसरे दौर के बाद पी [acman] के बैंडिंग पैटर्न. चार अलग एंजाइम का इस्तेमाल किया गया: Paci, एएससीआई, AatII और BamHI. सही ढंग से recombined उत्पाद इरादा परिवर्तन (तीर) के लिए छोड़कर अपने पैतृक पी [acman] को CG32095 के रूप में एक ही बैंड होगा. NEBcutter V2.0 बैंड पैटर्न भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

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Vivo में एक को लक्षित कैसेट की लामबंदी का वर्णन चित्रा 6. योजनाबद्ध. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

तालिका 1
तालिका 1. प्राइमर. बड़ा टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

जैव चिकित्सा अनुसंधान में आनुवंशिक मॉडल जीवों की शक्ति काफी हद तक आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपलब्ध उपकरणों पर आधारित है. छोटे मॉडल सी. विशेष रूप से एलिगेंस और ड्रोसोफिला बहुकोशिकीय विकास या समारोह में फंसा पूरा रास्ते और जीन परिवारों की सस्ती और तेजी से आणविक आनुवांशिक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. हाल के वर्षों में ड्रोसोफिला 14,15 में जीन से छेड़छाड़ के लिए उपकरण के विकास में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है. उदाहरण के लिए, व्यापक रूप से बीएसी डीएनए निर्माणों में हेरफेर करने के लिए माउस आनुवंशिकी में प्रयोग किया जाता है जो recombineering,, हाल ही में पी [acman] वेक्टर और ΦC31 की मध्यस्थता transgenesis 6 के उपयोग के माध्यम से, ड्रोसोफिला के लिए अनुकूलित किया गया था. विभिन्न चयन कैसेट पुनर्संयोजन सक्षम बैक्टीरिया 4,13 का उपयोग कर एक निर्माण के भीतर कहीं भी विशिष्ट दृश्यों के सम्मिलन या हटाए जाने के लिए अनुमति देते हैं. हम संशोधित किया है मूल पी [acman] यह निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि वेक्टर ड्रोसोफिला में अंतर्जात लोकी लक्ष्य है कि इन विवो मुताबिक़ पुनर्संयोजन वैक्टर में. इस नए वेक्टर आसानी से कट और पेस्ट क्लोनिंग तरीकों का उपयोग किया जा सकता है कि उन लोगों की तुलना में बड़ा अनुरूपता हथियार के साथ लक्षित कैसेट उत्पन्न करने के लिए एक सक्षम बनाता है. इसके अलावा, एक गेटवे क्लोनिंग कैसेट भी एक तेजी से और कुशलता से सिस्टम में नई जीनोमिक डीएनए शुरू करने की इजाजत दी, यह वेक्टर में शामिल किया गया है.

यहाँ वर्णित पद्धति का सबसे सरल है, हम तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण पाया है कई कदम उठाए हैं. चालाकी से डीएनए (> 15 केबी) के आकार के कारण, recombineering प्रतिक्रिया के पहले दौर (धारा 3) एक महत्वपूर्ण तकनीकी बाधा बन गया है. इसलिए, recombineering के इस दौर में एक बहुत ही कुशल पुनर्संयोजन प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. , कम घनत्व बढ़ कोशिकाओं दो के बजाय और बदले DH 2 की 10% ग्लिसरॉल के साथ कोशिकाओं तीन बार धोने की तरह प्रतीत होता है मामूली प्रोटोकॉल समायोजन, </ उप> हे 13, बहुत हमारी recombineering सक्षम कोशिकाओं के परिवर्तन दक्षता में सुधार हुआ है. इसके अलावा, सुनिश्चित करने के ख्याल रख रही ला / युक्त आर ए पी [acman] BamHI (3.1 चरण) कई झूठी सकारात्मक समाप्त के साथ पूरा करने के लिए काट रहा है.

अवांछनीय पुनर्संयोजन घटनाओं recombineering के दौरान एक बहुत ही आम समस्या का प्रतिनिधित्व करते हैं. उदाहरण के लिए, हम विभिन्न निर्माणों भीतर duplications और अनुवादन के मामलों को देखा है. इन घटनाओं ड्रोसोफिला परिवर्तन के दौरान और लक्ष्य विवो जीन में कई समस्याओं को जन्म दे सकता है. पीसीआर सत्यापन और अनुक्रमण विश्लेषण इन घटनाओं के सभी का पता नहीं लगा सकते हैं. इसलिए, एक प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण भ्रूण में डीएनए के इंजेक्शन से पहले अंतिम क्लोन उत्पाद पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए. यह अंतिम जांच महत्वपूर्ण साबित हो गया है और हमें अवांछित aberrations के होते हैं कि निर्माणों इंजेक्शन लगाने से बचने के लिए अनुमति दी गई है.

बस inj के पहले लक्ष्यीकरण वेक्टर मैक्सी preppingection और डीएनए ठंड कभी नहीं बहुत ड्रोसोफिला में इन बड़े निर्माणों के परिवर्तन दक्षता में सुधार. संक्षेप में, छोटे विवरण इन तकनीकों की सफलता में एक बड़ा फर्क है. प्रोटोकॉल को रेखांकित किया और विभिन्न स्रोतों और हमारे अपने अनुभव के एक नंबर से अंतर्दृष्टि का प्रतिनिधित्व यहां प्रदर्शन किया.

हम यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल उनकी अपनी प्रयोगशालाओं में recombineering तरीकों को अपनाने के लिए दूसरों की मदद करता है उम्मीद है, हम पद्धति को आगे सुधार और शोधन अभी भी संभव हो रहे हैं विश्वास करते हैं. कभी कभी, विशिष्ट जीनोमिक टुकड़े पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं कारणों के लिए recombineering का उपयोग कर हेरफेर करने के लिए मुश्किल हैं. इसके अलावा, अवांछित पृष्ठभूमि को खत्म करने के लिए हमारी सबसे अच्छा प्रयास के बावजूद, हम अभी भी जीनोमिक डीएनए के कुछ टुकड़ों को गलत तरीके से recombineered अंत उत्पादों का उत्पादन करते हैं कि लगता है. Recombineering प्रक्रिया का एक गहरी समझ के भविष्य और खुली चर्चा में अधिक इष्टतम प्रोटोकॉल उपज हो सकती हैविफलताओं और सफलता की कहानी recombineering व्यापक अनुसंधान समुदाय द्वारा इन शक्तिशाली तकनीक का सफल प्रयोग को बढ़ावा देगा.

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Disclosures

लेखकों यहाँ उल्लिखित तकनीक के संबंध में किसी भी प्रतिस्पर्धी हितों के लिए नहीं है.

Acknowledgments

हम ह्यूगो Bellen और अभिकर्मकों के लिए ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम आगे उपयोगी विचार विमर्श के लिए कोएन Venken, ह्यूगो Bellen और Buszczak और Hiesinger प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को धन्यवाद. इस काम के आर करने के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) से अनुदान द्वारा और एमबी (RO1GM086647), एमबी और PRH (RP100516) को टेक्सास के कैंसर की रोकथाम रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा एक अनुदान, और वेल्च को समर्थन किया था PRH के लिए फाउंडेशन (मैं-1657). एमबी जैव चिकित्सा अनुसंधान और PRH में एक ई और ग्रीर Garson Fogelson विद्वान है UT दक्षिण मेडिकल सेंटर में जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक यूजीन मैकडरमोट विद्वान है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

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References

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में मुताबिक़ पुनर्संयोजन Constructs Recombineering<em&gt; ड्रोसोफिला</em
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Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

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