Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Recombineering مثلي التركيبات التوحد في Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

مثلي تقنيات إعادة التركيب تقدم كبير

Abstract

سوف التطوير المستمر لتقنيات سريع، والتلاعب على نطاق واسع من مواضع الجينات الذاتية توسيع استخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن باعتباره النموذج الحي الوراثية للبحوث المتصلة الأمراض التي تصيب البشر. وقد شهدت السنوات الأخيرة التقدم التقني مثل إعادة التركيب مثلي وrecombineering. ومع ذلك، وتوليد الطفرات باطل لا لبس فيه أو البروتينات الذاتية علامات يبقى جهدا كبيرا لمعظم الجينات. هنا، نحن تصف وشرح تقنيات واستخدام أساليب الاستنساخ القائم على recombineering لتوليد نواقل التي يمكن استخدامها لاستهداف ومعالجة مواضع الذاتية في الجسم الحي على وجه التحديد، وقد أنشأنا مجموعة من ثلاث تقنيات: (1) نقل الجينات BAC / recombineering، ( 2) تنتهي إجراءات المغادرة مثلي إعادة التركيب و (3) التكنولوجيا بوابة لتوفير وسيلة قوية وفعالة ومرنة لمعالجة مواضع الجيني الذاتية. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم التفاصيل خطوة بخطوة حول كيفية (1) تصميم individuaناقلات لتر، (2) كيفية استنساخ شظايا كبيرة من الحمض النووي الجيني في ناقلات إعادة التركيب مثلي باستخدام إصلاح الفجوة، و (3) كيفية استبدال أو علامة الجينات في المصالح داخل هذه النواقل باستخدام الجولة الثانية من recombineering. وأخيرا، فإننا نقدم أيضا بروتوكول لكيفية تعبئة هذه الأشرطة في الجسم الحي لتوليد بالضربة القاضية، أو الجينات المرتبطة دلاليا عبر الضربة القاضية في. ويمكن بسهولة أن اعتمدت هذه الأساليب لأهداف متعددة في نفس الوقت وتوفير وسيلة لمعالجة جينوم ذبابة الفاكهة في الوقت المناسب وبطريقة فعالة.

Introduction

تنظيف التلاعب المعرفة جزيئيا من الجينات واحد في مواضع بهم الذاتية تقدم أداة لا تقدر بثمن لدراسة عدد لا يحصى من الأسئلة ذات الصلة لعلم الأحياء حقيقية النواة. ذبابة الفاكهة عكس التقنيات الوراثية لتوليد الأليلات الخسارة من وظيفة قد ثبت أن تكون صعبة حتى قدم [غليك] وزملاؤه في استهداف الجينات في الجسم الحي باستخدام إعادة التركيب مثلي لذبابة الفاكهة 1-3. وأظهروا أن يمكن استهداف مواضع الجيني محددة باستخدام جزء طولي من الحمض النووي من بناء متكامل المعدلة وراثيا. يتم إنشاء هذا خطي DNA "المانحة" في الجسم الحي من خلال إعادة التركيب FRT بوساطة (لاستئصال الحمض النووي من الكروموسوم كما جزيء دائري)، يليه الخطية مع meganuclease I-SCEI. على الرغم من أن هذه المنهجية استخدمت بنجاح لتوليد مجموعة متنوعة من الآفات محددة، ولم تكن هذه التقنية قابلة للتطوير بسهولة للتلاعب العديد من الجينات في نفس الوقت لأن كل indiviبناء خروج المغلوب المزدوج يتطلب تصميم متميز والعرف. على سبيل المثال، صعوبات في التلاعب بسلاسة شظايا كبيرة من الحمض النووي (> 5 KB) في المختبر باستخدام الكلاسيكية تقييد انزيم / ربط استنساخ أو PCR، فضلا عن القيود التقليدية في حجم ناقلات تحول الجسم الحي في كثير من الأحيان تتداخل مع التولد السريع لإعادة التركيب مثلي استهداف ناقلات. للتغلب على هذه القيود، ونحن الجمع بين P [acman] نظام recombineering / نقل الجينات، والذي يسمح الفرعي الاستنساخ ونقل الجينات تصل إلى 100 كيلو بايت من الحمض النووي، مع استهداف نهايات المغادرة الجين منهجية لتأسيس منصة فعالة وسريعة نسبيا والتي يسهل استهداف الجين ذبابة الفاكهة.

إعادة التركيب بوساطة الهندسة الوراثية (recombineering) هي قوية القائم على إعادة التركيب مثلي تكنولوجيا الاستنساخ 4،5. وعلى النقيض من التقليدية تقييد انزيم / يغاز الاستنساخ، recombineering لا يقتصر بواسطة تسلسل أو الاحجام(ه) من الحمض النووي التلاعب بها. يستخدم Recombineering لE. خاص سلالة القولونية التي تؤوي آلات إعادة التركيب التي يقدمها λ معيبة طليعة العاثية 4. وقد اعتمدت هذه التقنية مؤخرا لاستخدامها في ذبابة الفاكهة 6،7. Recombineering في ذبابة الفاكهة تعتمد على amplifiable مشروط كروموسوم اصطناعي البكتيرية المعدلة (BAC) ناقلات دعا P [acman] 6،7. هذا ناقلات تحمل اثنين من أصل النسخ المتماثل: OriV، التي تنتج رقم ونسخة عالية على الاستقراء الكيميائية لتنقية كميات كبيرة من الحمض النووي المطلوبة لتسلسل وحقن الجنين وأوريس، التي تحافظ على رقم ونسخة منخفضة في ظل ظروف القاعدية. بالإضافة إلى ذلك، ف [acman] وقد تم تجهيز ناقلات مع المرفقات (attB) موقع البكتيرية. موقع attB بمثابة الركيزة لΦC31 integrase بوساطة نقل الجينات التي تسمح بإدماج شظايا الحمض النووي كبير في موقع الهبوط محددة سلفا داخل ذبابة الفاكهة الجينوم 8،9.

لقد ولدت P [acman] ناقلات (المشار إليها باسم P [acman]-KO 1.0) التي يمكن استخدامها كناقل استهداف لغايات المغادرة مثلي إعادة التركيب 10،11. لدمج إنتهاء المغادرة استهداف الجينات التكنولوجيا في النظام، واضاف نحن اثنان FRT وموقعين I-SCEI. لقد تضمنت ايضا كاسيت بوابة ضمن هذه النواقل تعديل لتبسيط عملية دمج الأسلحة تناظر إلى P [acman]-KO 1.0. هذا يوفر وسيلة سريعة وبسيطة لإدخال عمليا أي منطقة الجيني من الفائدة في ناقلات الاستهداف. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح كيفية مهندس ناقلات استهداف باستخدام P [acman]-KO 1.0، وكيفية تعبئة هذه النواقل في الجسم الحي لاستهداف موضع الذاتية. لغرض هذا البروتوكول سوف نستخدم RFP / اساسه كاسيت ليحل محل الجينات في المصالح، ولكن مجموعة متنوعة من أشرطة الكاسيت التي تحتوي على علامة اختيار المضادات الحيوية يمكن استخدامها مع هذا البروتوكول. لقد قمنا بتصميم واستخدمت بنجاح مجموعة من أشرطة الكاسيت للاستبدال الجينات ووضع علامات 10،11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. اختيار BAC ومن منطقة إلى استهداف

  1. للحصول على BAC مع الجينات في المصالح (الحكومة العراقية) (هنا يتم استخدام CG32095 كمثال)، والبحث عن CG32095 في www.flybase.org . تحت قسم الأسهم والكواشف، والتحقق من مقطع بعنوان "استنساخ الجينوم" لتسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي التي تحتوي على CG32095. تأكد من أن يتضمن BAC لا يقل عن 10 KB المنبع والمصب 5 KB الجينات في المصالح. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن الحيوانات المستنسخة في P [acman] ناقلات 7 يمكن العثور عليها في http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. استنساخ BAC تأتي في الخلايا DH10B وP [acman] استنساخ تأتي في EPI300 الخلايا. في حاجة إلى استنساخ الجينوم إلى أن تتحول إلى SW102 الخلايا، والتي هي قابلة للrecombineering. "minipreps القذرة" يتم تنفيذ (أ miniprep QIAGEN دون استخدام عمود وعجل الحمض النووي باستخدام الأيزوبروبانول) انطلاقمن 5 مل O / N ثقافة تلقيح مع الخلايا التي تحتوي على البكالوريا. بعد إعادة تعليق بيليه الحمض النووي الطازجة في 20 ميكرولتر من DH 2 O، وتمييع 1 ميكرولتر في 100 ميكرولتر من DH 2 O واستخدام 1 ميكرولتر ل electroporate SW102 electrocompetent. لجعل SW102 electrocompetent استخدام بروتوكول التالية:
    1. تطعيم SW102 الخلايا في 4 مل من LB. تنمو ثقافة في 32 ° CO / N اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة هام: لا ينبغي أبدا أن تتعرض الخلايا SW102 إلى درجة حرارة أعلى من 32 درجة مئوية ما لم هو المطلوب تحريض آلات إعادة التركيب.
    2. تطعيم 1 مل من SW102 المشبعة ثقافة إلى 44 مل LB وتنمو على 32 ° C شاكر إلى OD 600 بين 0.2-0.3 (عادة حوالي 1-1.5 ساعة) ملاحظة: بروتوكولات recombineering غيرها من يوصي نموا في الثقافة في حجم أصغر لل OD 600 0،6-0،7، ومع ذلك تزايد البكتيريا إلى مناطق ذات كثافة أقل في حجم أكبر بشكل ملحوظ التحول efficieNCY 12. وبالإضافة إلى ذلك، هذا التعديل يقلل من وقت الانتظار.
    3. تبريد الثقافة في الطين الماء المثلج لمدة 5 دقائق هامة: خلال الخطوات التالية يجب أن تبقى الخلايا في درجات الحرارة المنخفضة. هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على خلايا electrocompetent ذات نوعية جيدة.
    4. أجهزة الطرد المركزي الثقافة في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل بيليه في 25 مل من البرد (4 ° C) 10٪ الجلسرين 13. أولا، وخلايا resuspend في 5 مل من خلال استغلال ويحوم الأنبوب في الطين الماء المثلج (لا ماصة صعودا وهبوطا) ثم قم بإضافة ما تبقى من الجلسرين 10٪ (20 مل).
    5. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف ويغسل بيليه للمرة الثانية مع 25 مل الجليد الباردة الجلسرين 10٪.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف ويغسل بيليه للمرة الثالثة مع 25 مل الجليد الباردة الجلسرين 10٪.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة وتجاهل سوبernatant. بيليه الخلية قد تكون فضفاضة جدا في هذه المرحلة، وينبغي توخي الحذر عند التخلص من طاف. Resuspend الكرية في 1 مل من البرد 10٪ الجلسرين. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية على 12،000 XG في microcentrifuge الطاولة في 4 درجات مئوية. تجاهل معظم طاف مغادرة ≈ 90 ميكرولتر من الجلسرين / الخلايا. الخلايا هي الآن جاهزة للelectroporated ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن أن يتم تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. ومع ذلك، وهذا قد يقلل من الكفاءة.
    8. Electroporate الحمض النووي في الخلايا باستخدام مم كفيت 1 في 1،800 V، 25 المكثف، 200 Ω. بعد electroporation، إضافة 300 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب والسماح للخلايا استرداد لمدة 2 ساعة على 32 درجة مئوية (الهز غير مطلوب). لوحة الخلايا على أجار LB بالإضافة إلى 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (أو المضادات الحيوية الأخرى المناسبة اعتمادا على BAC حولت أو PAC) واحتضان عند 32 درجة مئوية لمدة 24-30 ساعة.
  4. تم تصميم الأسلحة تناظر لاستهداف الجينات التي حددجي 10 كيلو بايت من الحمض النووي الجيني المنبع والمصب 5 KB النسبية إلى الحكومة العراقية. حدد 500 BP في نهاية ال 10 KB و5 KB الأسلحة تناظر لتضخيم (انظر القسم 2) (الشكل 1). هذه الشظايا 500 BP بمثابة أسلحة تستخدم لإعادة تجميع تناظر المنطقة المحيطة الجيني الحكومة العراقية إلى P [acman] KO 1.0. ويشار إلى هذه الشظايا كما الذراع الأيسر (LA) للمنطقة الذي يتوافق مع المنبع 5 'الذراع التماثل والذراع الأيمن (RA) للمنطقة الذي يتوافق مع المصب 3' الذراع التماثل هام: يجب أن لا تحتوي على أسلحة التماثل BamHI مواقع التقييد، كما الخطية من البلازميد (في الخطوة 3.2) ويتم إنجاز عبر خلاصة تقييد BamHI.

2. إدراج الأسلحة التماثل إلى P [acman]-KO 1.0

  1. إنشاء شركتين الفردية تفاعلات PCR، واحدة لتضخيم LA وأخرى لتضخيم RA. لLA، استخدم الاشعال attB1-I-SCEI-LA-F وBamHI-LA-R واستخدام الاشعال BamHI-RA-F وattB2-I-SCEI-RA-Rلتضخيم RA (الجدول 1). استخدم 1 ميكرولتر من الحمض النووي BAC من الخطوة 1.2 أو 0.5 ميكرولتر من مغلي ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها تحتوي BAC الاهتمام كقالب. تأكد من استخدام البلمرة DNA مع تصحيح التجارب المطبعية القدرة. وهذا ينطبق على جميع تقارير إنجاز المشروعات اللاحقة، مع استثناء من الاختيار PCR في خطوات 2.8 و 3.13 ملاحظة:. وقت التمديد لالبلمرة DNA تصحيح التجارب المطبعية قد تكون مختلفة عن العادية البلمرة DNA طق اعتمادا على الشركة المصنعة. PfuUltra الثاني فيوجن HotStart، التي يبلمر بمعدل 15 ثانية / كيلو بايت، ويمكن استخدامها في هذه الخطوات.
    LA / RA PCR
    1 ميكرولتر الحمض النووي من القذرة miniprep من الخطوة 1.2 باك
    0.25 ميكرولتر كل 20 ميكرومتر التمهيدي
    2.5 ميكرولتر 10X PfuUltra الثاني الواق
    0.75 ميكرولتر 10MM (كل) dNTP
    0.5 ميكرولتر PfuUltra الثاني فيوجن HotStart البلمرة DNA
    19.75 ميكرولتر ماء
    25 ميكرولتر اجمالى حجم التداول
    شروط PCR
    STEP1 95 ° C 2 دقيقة لتنشيط انزيم
    STEP2 95 ° C 20 ثانية تفسد
    STEP3 60 ° C 20 ثانية الصلب
    STEP4 72 ° C 20 ثانية التمديد
    Step5 انتقل إلى الخطوة 2 وكرر 29 دورات
    Step6 4 ° C امسك
  2. تشغيل العينات على agarose هلام 1٪ واستخراج المنتجات باستخدام Zymoclean عدة الانتعاش الحمض النووي. أزل الحمض النووي من العمود Zymoclean مع 10 ميكرولتر من الماء المعقم.
  3. تنفيذ الربط عن طريق التداخل بين التمديد (PCR SOE) مع اثنين من شظايا باستخدام 10-30 نانوغرام من الحمض النووي من مجموع كل منتج تضخيم تنقيته في 2.2 (الشكل 2). هذا هو عادة حوالي 1/20 من كل ال PCR المنتج المنقى:
    LA / RA-PCR سو
    0.5 ميكرولتر كل LA وRA المنقى PCR المنتج حوالي 10-30 نانوغرام
    0.25 ميكرولتر كل 20 ميكرومتر التمهيدي
    2.5 ميكرولتر 10X PfuUltra الثاني الواق
    0.75 ميكرولتر 10MM (كل) dNTP
    0.5 ميكرولتر PfuUltra الثاني فيوجن HotStart البلمرة DNA
    19.25 ميكرولتر ماء
    25 ميكرولتر اجمالى حجم التداول
    شروط PCR
    STEP1 95 ° C 2 دقيقة لتنشيط انزيم
    STEP2 95 ° C 20 ثانية تفسد
    STEP3 55 ° C 20 ثانية الصلب (السفلى درجة الحرارة. للسماح للأسلحة ليصلب)
    STEP4 72 ° C 20 ثانية التمديد
    Step5 انتقل إلى الخطوة 2 وتكرار دورة 1
    Step6 95 ° C 20 ثانية تفسد
    STEP7 60 ° C 20 ثانية الصلب
    Step8 72 ° C 20 ثانية التمديد
    Step9 انتقل إلى الخطوة 2 وكرر 27 دورات
    Step10 4 ° C امسك
  4. تشغيل العينة PCR على هلام الاغاروز واسترداد KB الفرقة 1.0 بواسطة استخراج الهلام. هذا هو الكاسيت attB1-LA-BamHI-RA-attB2.
  5. استخدام بوابة BP ClonaseII عدة إنزيم لإعداد رد فعل BP بعد بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة.سوف كاسيت ولدت في 2.4 بمثابة الحمض النووي المانحة وP [acman]-KO 1.0 كما متجه الوجهة.
  6. تمييع 50 ميكرولتر من TransforMax EPI300 الخلايا electrocompetent بإضافة 30 ميكرولتر من البرد الجلسرين 10٪ أو باردة DH 2 O. تحويل 1 ميكرولتر من رد فعل BP إلى خلايا electrocompetent بعد بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة. إضافة الماء يخفف من تركيز الملح عالية نسبيا من رد فعل BP لمنع التفريغ الكهربائي (الانحناء) خلال electroporation. Electroporate الحمض النووي في الخلايا باستخدام مم كفيت 1 في 1،800 V، 25 المكثف، 200 Ω.
  7. إضافة 300 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب والسماح الخلايا استرداد لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (الهز غير مطلوب). لوحة الخلايا على LB-أجار + 50 ميكروغرام / مل من الأمبير (P [acman]-KO 1.0 يحتوي على الأمبير المقاومة الجينات). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
  8. PCR تحقق المستعمرات الفردية التقليدية مستعمرة PCR باستخدام T3 (تسلسل T3 هو المصب من الكاسيت في بوابة P [acman]-KO 1.0 (الشكللدى عودتهم 1) وattB1-I-SCEI-LA-F الاشعال. سوف استنساخ الإيجابية عرض الفرقة التي يعمل في 1.2 كيلو بايت.
  9. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها من استنساخ إيجابية في LB مع 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين.
  10. تضخيم P [acman]-KO 1.0 ناقلات تحتوي على LA وRA في LB 10 مل مع 50 ميكروغرام / مل ثقافة الأمبيسلين باستخدام حلول التحكم نسخة بعد بروتوكول الشركة المصنعة (EPICENTRE).
  11. إجراء miniprep QIAGEN بعد بروتوكول الشركة المصنعة.

3. إعادة توحيد الإقليم الجينوم الاهتمام إلى P [acman]-KO 1.0

يوم 1

  1. تطعيم SW102 الخلايا التي تحتوي على BAC من الفائدة إلى 4 مل من LB بالإضافة إلى 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (كلوروفيل) أو المضادات الحيوية الاختيار المناسب. تنمو ثقافة في 32 ° CO / N اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة هام: الى جانب ذلك خلال الاستقراء في الخطوة 3.5، لا ينبغي أن يتعرض SW102 الخلايا إلى درجة حرارة أعلى من 32 درجة مئوية، وارتفاع درجة الحرارة ينشط إعادة التركيب أماهتشينري من هذه الخلايا.

يوم 2

  1. هضم 0.4 ميكروغرام من P [acman]-KO-1.0 التي تحتوي على الأسلحة وLA RA ولدت في الباب 2 مع ≈ 20 وحدة من BamHI في رد فعل ميكرولتر 25. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 ساعة هام: الهضم طويلة أمر بالغ الأهمية لضمان الهضم من كل DNA. هذا سيقلل من عدد من ايجابيات كاذبة الحيوانات المستنسخة في وقت لاحق.
  2. تطعيم 1.0 مل من ثقافة SW102/BAC المشبعة إلى 44 مل LB-كلوروفيل (25 ميكروغرام / مل)، وتنمو على 32 ° C شاكر إلى OD 600 بين 0.2-0.3 (عادة حوالي 1-1.5 ساعة). وتشمل عينة متطابقة إضافية للسيطرة غير HS. سيتم التعامل مع هذه العينة تماما مثل واحد تجريبية في كل جانب واحد مع استثناء من HS. هذه الثقافة غير حرارة صدمت بمثابة سيطرة سلبية. ظهور العديد من المستعمرات على لوحة التحكم غير HS (الخطوة 3.13) يشير عادة مع عسر الهضم تحول P [acman] KO 1.0 LA/ RA البلازميد.
  3. في حين أن الثقافة ينمو، تشغيل BamHI المقيدة P [acman]-KO على هلام. ثم هلام استخراج وأزل الحمض النووي في 10 ميكرولتر من المياه ارتفعت درجة حرارة تصل إلى 55 درجة مئوية. ملاحظة: لا أزل الحمض النووي في أي العازلة. أملاح موجودة في المخزن المؤقت قد يسبب التفريغ الكهربائي خلال electroporation.
  4. حرارة صدمة الثقافة في 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بالضبط في حمام مائي. وسوف يؤدي هذا إلى تنشيط الآلية recombineering من SW102 الخلايا. لا تسخن صدمة ثقافة السيطرة.
  5. فورا بعد الصدمة الحرارية، ونقل الحرارة من الصدمة والارتباك والثقافات تحكم غير HS لالمبردة 50 مل أنابيب الكنسي، والسماح للالبرد الثقافات في الطين الماء المثلج لمدة 5 دقائق هامة: خلال الخطوات التالية يجب أن تبقى الخلايا في درجات الحرارة المنخفضة . هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على خلايا electrocompetent ذات نوعية جيدة.
  6. أجهزة الطرد المركزي في الثقافة 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل بيليه في 25 مل من البرد (4 ° C) 10٪ الجلسرين 13. أولا،resuspend الخلايا في 5 مل من خلال استغلال ويحوم الأنبوب في الطين الماء المثلج (لا ماصة صعودا وهبوطا) ثم قم بإضافة ما تبقى من الجلسرين 10٪ (20 مل).
  7. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف ويغسل بيليه مع 25 مل الجليد الباردة الجلسرين 10٪ للمرة الثانية.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف ويغسل بيليه مع 25 مل الجليد الباردة الجلسرين 10٪ للمرة الثالثة.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف. بيليه الخلية قد تكون فضفاضة جدا في هذه المرحلة، وينبغي توخي الحذر عند التخلص من طاف. Resuspend الكرية في 1 مل من البرد 10٪ الجلسرين. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية على 12،000 XG في microcentrifuge الطاولة في 4 درجات مئوية. تجاهل معظم طاف مغادرة ≈ 90 ميكرولتر من المياه / خلايا ملاحظة: عند هذه النقطة الخلايا يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. ومع ذلك، وهذا قد يقلل من الكفاءة.
  10. إضافة 2 ميكرولتر من BamHI-P يهضم [acman] (الهدف لمدة 50 نانوغرام) إلى الخلايا وتخلط بلطف باستخدام طرف ماصة. نقل الخلايا في 1 ملم كفيت electroporation وelectroporate في 1،800 V، 25 المكثف، 200 Ω.
  11. إضافة 300 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب والسماح للخلايا استرداد لمدة 2 ساعة على 32 درجة مئوية (الهز غير مطلوب). لوحة الخلايا على أجار LB بالإضافة إلى 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين واحتضان عند 32 درجة مئوية لمدة 24-30 ساعة.

يوم 3

  1. الشاشة لمناسبة الفجوة الإصلاح باستخدام PCR مستعمرة. استخدام T3 و RA تحقق الاشعال لRA وT7 وLA التمهيدي الاختيار للLA (الجدول 1). تصميم PCR-تحقق-RA وPCR-تحقق-LA الاشعال 100-200 BP تجاه المنطقة المستهدفة (الجدول 1). سوف المستعمرات إيجابية من تفاعلات PCR باستخدام PCR-تحقق-RA مع T3 أو PCR-تحقق-LA مع T7 تظهر الفرقة التي يعمل في 800-1،000 بي بي (الشكل 3) ملاحظة: من المهم جدا لاختبار كل الأسلحة منذ التأسيس واحد ذراعولكن ليس من جهة أخرى لوحظ في بعض الأحيان.
  2. تنمو PCR-التحقق المستعمرات على 32 درجة مئوية في 4 مل من LB +50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين ليلة وضحاها. جعل الأسهم المجمدة من هذه الخلايا لاستخدامها لاحقا.

4. استبدال المنطقة الجينوم مع كاسيت الاستهداف

يوم 4

  1. تضخيم RFP / KAN كاسيت خروج المغلوب بواسطة PCR باستخدام pENTR-RFP/KAN (مهضوم مع زقاق وNheI إلى خطي) كقالب و5'HA-RFP / اساسه-F و3'HA-RFP / اساسه-R الاشعال ( الجدول 1). ويمكن طلب كراسة الشروط / KAN كاسيت من مرجع 11.
  2. هلام تنقية المنتج PCR يبلغ حجمه في 20 ميكرولتر من الماء المعقم. ينبغي للكاسيت RFP-KAN بالإضافة إلى الأسلحة تناظر تشغيل حوالي 3 كيلو بايت.
  3. تطعيم 1 مل من المشبعة SW102 / P [acman] الثقافة-KO (الخطوة 3.13) إلى 44 مل LB-الأمبير (50 ميكروغرام / مل)، وتنمو على 32 ° C شاكر إلى OD 600 بين 0.2-0.3. وتشمل عينة متطابقة إضافية للسيطرة غير HS. سيتم التعامل مع هذه العينة فقطمثل واحد تجريبية في كل جانب واحد مع استثناء من HS.
  4. بعد SW102 / P [acman] ثقافة KO يصل إلى الكثافة المطلوبة، اتبع الخطوات 3،5-3،10.
  5. Electroporate ما يقرب من 100 نانوغرام من استهداف كاسيت إلى 90 ميكرولتر من electrocompetent SW102 / P [acman] خلايا-KO. نقل الخلايا في 1 ملم كفيت electroporation وelectroporate في 1،800 V، 25 المكثف، 200 Ω. إضافة 300 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب وتسمح للخلايا لاسترداد لمدة 2 ساعة على 32 درجة مئوية (الهز غير مطلوب) ملاحظة: ينصح بشدة استخدام هلام الطازج النقي كاسيت.
  6. لوحة الخلايا في أجار LB + الأمبير (50 ميكروغرام / مل) + اساسه (50 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 24-30 ساعة عند 32 درجة مئوية.

يوم 5

  1. تنمو 5 مل من ثقافة في الفترة من 5 مستعمرات مختلفة في 32 ° CO / N.

يوم 6

  1. تنفيذ "القذرة miniprep" وتشغيل نصف من الحمض النووي التي تم الحصول عليها على agarose هلام 1٪ للبحث عن العلاقات العامةesence من الوزن الجزيئي المنخفض البلازميد. لا ينبغي أن يكون هناك أي البلازميد الذي يمتد رفع الصوت عاليا 12 كيلو بايت. (الشكل 4)
  2. جعل التخفيف 1:500 من الحمض النووي من استنساخ الإيجابية واستخدام 1 ميكرولتر ل electroporate في 50 ميكرولتر من TransforMax EPI300 هام: تأكد لتخفيف الحمض النووي لمنع electroporation من البلازميدات متعددة في خلية واحدة. لوحة الخلايا في أجار LB + الأمبير (50 ميكروغرام / مل) + اساسه (50 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 18-24 ساعة عند 37 ° C

يوم 7

  1. تطعيم مستعمرة واحدة في 10 مل من LB + وتنمو O / N.

اليوم 8

  1. مل البذور 100 من وسائل الإعلام LB مع ثقافة مشبعة من الخطوة 4.10. إضافة المضادات الحيوية المناسبة بالإضافة إلى 100 ميكرولتر من 1،000 X نسخة حلول التحكم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعة.
  2. إجراء maxiprep والتحقق من إدراج الكاسيت في الموقع الصحيح من خلال التسلسل.
  3. بالإضافة إلى التسلسل، تنفيذ انزيمات تقييداختبار البريد الهضم مع الحمض النووي من استنساخ التي لم تحتو على أي الوزن الجزيئي المنخفض البلازميد والحمض النووي الأبوية. فإن إنزيمات التقييد اختيارها أن تكون مختلفة عن كل الجينات لكن الهدف هو العثور على مجموعة من الإنزيمات التي تسمح للمحقق لتوصيف ناقلات recombineered. على سبيل المثال، تم هضمها متجه استهداف CG32095 متسلسل مع باتشي، زقاق، BamHI وAatII. ظهور جميع نطاقات التنبؤ بها وعدم وجود أي فرق غير صحيحة يؤكد أن استهداف ناقلات تم recombineered بشكل صحيح (الشكل 5).

5. عن طريق الحقن الذباب وتعبئة كاسيت في فيفو

  1. حقن كاسيت باستخدام ΦC31 integrase، إلى موقع الهبوط محددة مسبقا من خيار. الموردين الخارجيين، مثل قوس قزح المعدلة وراثيا ( http://www.rainbowgene.com )، ويمكن استخدامها لخدمات حقن هام: يجب أن يكون الحمض النووي طازجة Prepared قبل الحقن. ويلاحظ ارتفاع كفاءة التحويل عند إعداد الحمض النووي في الموقع وحقن في اليوم نفسه.
  2. لتعبئة الكاسيت من موقع الهبوط، واستخدام بلومنجتون الأوراق المالية رقم 25680 أو 25679. هذه المخزونات تحتوي Flippase وI-SCEI المصب من المروج الصدمة الحرارية، على الكروموسوم الثاني والثالث، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، أنها تحتوي على التحوير HS-HID على كروموسوم موازن وعلى كروموسوم Y-. جمع الذكور من الأسهم المختارة وعبور للإناث العذراء تحمل كاسيت KO في موقع الهبوط. . مجموعة ~ 30 الصلبان والسماح الإناث لوضع البيض لمدة 2-3 أيام ملاحظة: من المستحسن اختيار الأوراق المالية التي هي على كروموسوم يختلف عن موضع المستهدفة.
  3. الآباء الوجه إلى مجموعة جديدة من 30 قارورة، واليرقات الحرارة صدمة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، مرتين في اليوم، لمدة ثلاثة أيام متتالية. الصدمات الحرارية تنشيط إنتاج الإنزيمات؛ flippase وI-SCEI، وموت الخلايا الجينات اختبأ
  4. جمع الإناث العذراء من ذرية F1 من الذباب الحرارة بالصدمة، والعبور إلى ذ - ث - ذكور. تهدف ل150-200 الصلبان، وثلاثة العذارى وثلاثة ذكور لكل الصليب.
  5. فحص ذرية F2 تحت نطاق الفلورسنت التي تسمح الكشف عن طلب تقديم العروض في العين. الشاشة لطلب تقديم العروض عيون الإيجابية التي هي متحولة عن الجينات الأبيض والأصفر (Y - ث -). هذه عملية الفرز يختار بشكل إيجابي لوجود الكاسيت طلب تقديم العروض ويختار لغياب P [acman] ناقلات (ميني الأبيض) والهبوط الموقع، الذي يتميز البرية من نوع الجين الأصفر ملاحظة: لقد حان الوقت أقل يخدعبافتراض أن يحجب لطلب تقديم العروض في العين، من أن الشاشة الأولى لذباب ستشغل. الأحداث تعبئة هي فعالة جدا أثناء الصدمات الحرارية، مما أدى في كثير من الذباب أقل تحتوي على طلب تقديم العروض في العين، بالمقارنة مع ذ - ث - الذباب.
  6. إعداد التزاوج زوج واحد مع كل ذ - ث - RFP + الطاير، لأن كل حدث تعبئة قد تكون مختلفة. خريطة طلب تقديم العروض للكروموسوم الصحيح. وعادة ما لوحظ الاستهداف كروموسوم الصحيح في> 95٪ من الحالات.
  7. إنشاء مخزون والتحقق من الأحداث التي تستهدف الصحيح باستخدام التقنيات القياسية للتحليل لطخة الجنوبية. تصميم 2 كيلوبايت التحقيق المنبع (الذراع الأيسر) والمصب (الذراع الأيمن) من استهدافهم الجين، و 2 كيلو بايت (أو أقصر إذا لزم الأمر) تغطي ORF حذف. فإن تحقيقات الأولين تسفر عن الفرقة في بالضربة القاضية متماثل ومتخالف، غير موجودة في wildtype، في حين سوف ORF لا تسفر عن الفرقة في خروج المغلوب متماثلة اللواقح. A السريع PCR وأو ORF هو أيضا ممكن، ولكن هذا يعتمد على عدم وجود الفرقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التضخيم من LA والأسلحة تناظر RA يجب أن ينتج 500 منتجات BP ورد فعل PCR-الشركات المملوكة للدولة يجب أن تسفر عن 1.0 كيلوبايت المنتج (2،1-2،4 أقسام؛ الشكل 2). رد فعل BP أجريت في القسم 2.5 هو عادة تحول فعالة جدا والبكتيرية من غلة المنتج 5-100 المستعمرات في المتوسط. ما يقرب من جميع مستعمرات اختبار PCR مع الاختيار إظهار المنتج PCR المتوقعة.

خلال الجولة الأولى من recombineering (القسم 3) تتوقع الحصول على المستعمرات 20-40 بعد تحول P يهضم [acman]-KO-1.0 التي تحتوي على LA والأسلحة RA إلى SW102 الخلايا. سوف 40-60٪ من هذه الحيوانات المستنسخة تحمل المنتج المطلوب إعادة التركيب. يجب أن يحتوي على السيطرة صدمة غير عدد قليل جدا من الحرارة إن وجدت المستعمرات بالمقارنة مع الخلايا حرارة بصدمة. ظهور نفس العدد من المستعمرات على كل عينة لوحات التحكم وعادة ما يشير الى وجود البلازميد تقطيعه أو بعض الملوثات الأخرى. في هذه الحالة، فإن التجربة شويتم تجاهل دينار والمتكررة، وهذه المرة هضم P [acman]-KO-1.0 تحمل LA والأسلحة RA لإتمام اتباع تعليمات موضح في الخطوة 3.2. ويرد مثال على الاختيار PCR لاسترجاع المنطقة الجيني من الاهتمام إلى P [acman]-KO 1.0 التي تم الحصول عليها ≈ 60 المستعمرات في الشكل 3. هنا 60٪ من المستعمرات اختبارها التي يجب أن تؤخذ في product.Care إعادة التركيب المطلوب أن المنتجات PCR الملحوظة في حجم تشغيل توقع، منذ العصابات PCR الشاذة تشير عادة الأحداث recombineering غير صحيحة.

أحيانا لا مستعمرات سوف تنمو بعد الجولة الأولى من recombineering. باستخدام الخلايا بكفاءة دون المستوى الأمثل تمثل السبب الأكثر شيوعا للحصول على رد فعل recombineering فشلت. حفظ الخلايا الباردة في جميع الأوقات أثناء إعدادها والتعامل معها لطيف خلال يغسل (NEVER دوامة) أمر بالغ الأهمية للحصول على الخلايا المختصة ذات جودة عالية. محاولة استخدام دائما هضمها طازجة / تنقيته P [acman]-KO-1.0 الحمض النووي للحصول على أعلى كفاءة.

أحيانا الجولة الأولى من غلة recombineering المستعمرات ولكن تلك المستعمرات لا يجتاز فحص PCR الاختيار. وهذا يدل عادة منتجات recombineering غير صحيحة ولكن مثل هذه النتيجة قد تشير أيضا إلى مشاكل محتملة مع واحدة من مجموعات التمهيدي. للتحقق من صحة التمهيدي PCR-تحقق-LA، إعداد رد فعل PCR في تركيبة مع attB1-I-SCEI-LA-F. للتحقق من تعيين PCR-الاختيار-RA يصل رد فعل PCR مع attB2-I-SCEI-RA-R. في كلتا الحالتين استخدام BAC الأصلي كقالب. وينبغي لهذه التفاعلات PCR تسفر المنتجات من الحجم المتوقع، والتي سوف تختلف تبعا لتسلسل الاشعال الاختيار. سوف نتائج إيجابية من هذه التجربة التحكم يستبعد إمكانية أن عدم القدرة على الكشف عن استنساخ إيجابية ويرجع ذلك إلى عدم الكفاءة التمهيدي.

إذا كنت قد حاولت الجولة الأولى من recombineering عدة مرات بعد بروتوكول أعلاه دون أي نجاح، وكان اداؤها جميعاقترح الضوابط، ونحن نوصي اختيار زوج جديد من 500 BP الأسلحة التماثل. وذلك لأسباب ليست واضحة في الوقت الحاضر، وبعض مناطق الجينوم مقاومة لإعادة التركيب الحمض النووي للغاية. ببساطة تصميم الأسلحة تناظر جديدة وتحريكها نحو أو بعيدا عن الجينات في المصالح في بعض الأحيان يحل هذه المشاكل.

الجولة الثانية من recombineering (القسم 4) هو أكثر كفاءة بكثير عادة. ويلاحظ عادة 30-50 المستعمرات بعد التحول، مع 90-95٪ من هذه التي تحتوي على التركيبة المطلوبة. المشكلة الأكثر شيوعا في هذه الخطوة هو الحصول على المستعمرات إيجابية كاذبة. الشكل 4 يوضح أمثلة من الحيوانات المستنسخة إيجابية صحيحة وكاذبة بعد الجولة الثانية من recombineering (القسم 4).

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي من عrocess لتوليد P [acman] 1.0-KO استهداف ناقلات. تم التعديل من تشان وآخرون. (2012). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. التخطيطي من الربط عن طريق تداخل PCR (PCR الشركات المملوكة للدولة) التي أجريت على الخطوة 2.3. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل (3)
الشكل (3). PCR-تحقق هلام تظهر كفاءة أول حدث recombineering كل حارة يمثل مستعمرة واحدة A:. المستعمرات اختبار الذراع الأيسر. التكامل باستخدام T7 والاشعال LA-B الاختيار: نفس المستعمرات وA، اختبار التكامل الذراع اليمنى باستخدام T3 و RA-الاختيار primers.1kb زائد واستخدمت سلم الحمض النووي كعلامة الوزن الجزيئي ملاحظة: نظرا لسوء فتيلة من T3 التمهيدي نسبة إلى T7، كانت عصابات من الشيك الذراع اليمنى قتامة بشكل ملحوظ. وينبغي أخذ هذا في الاعتبار عند عرض هلام.

الشكل 4
الشكل 4. الحمض النووي agarose هلام تظهر ارتفاع البلازميدات الوزن الجزيئي (P [acman])، وانخفاض الوزن الجزيئي البلازميد (قالب مهضوم) المعزولة من الحيوانات المستنسخة الإيجابية المحتملة بعد الجولة الثانية من recombineering. تم عزل الحمض النووي من 4 استنساخ الإيجابية المحتملة وركض على agarose هلام 1٪ ملطخة إيثيديوم بروميد. استنساخ 1،3 و 4 هي استنساخ إيجابية حقيقية. استنساخ 2 هو واحد إيجابية كاذبة كما لوحظ من قبل جميع أشكال AP lasmid التي تدير رفع الصوت عاليا 12 KB (أكبر حجم الفرقة في الحمض النووي حارة سلم). تم استخدام 1 كيلوبايت زائد DNA سلم كعلامة الوزن الجزيئي.

الرقم 5
الشكل 5. يظهر اختبار للحدث المطلوب إعادة التركيب من قبل تقييد انزيم هضم. في المثال أعلاه جهاز كمبيوتر توقع النطاقات نمط P [acman]-KO CG32095 قبل وبعد الجولة الثانية من recombineering. واستخدمت أربعة إنزيمات مختلفة: باتشي، زقاق، AatII وBamHI. صحيح منتج معاد سيكون لها نفس العصابات كبه الوالدين P [acman]-KO CG32095 باستثناء التغيير المقصود (السهام). وقد استخدم NEBcutter V2.0 للتنبؤ نمط الفرقة.

0346/50346fig6highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50346/50346fig6.jpg "/>
الشكل (6). تخطيطي يصف تعبئة شريط كاسيت تستهدف في الجسم الحي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الجدول 1
الجدول 1. الاشعال. انقر هنا لمشاهدة الجدول أكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويستند قوة الكائنات نموذج الجينية في مجال البحوث الطبية الحيوية إلى حد كبير على الأدوات المتاحة للتلاعب الجيني. نماذج صغيرة C. ايليجانس وذبابة الفاكهة على وجه الخصوص تسمح للتحاليل وراثية جزيئية غير مكلفة وسريعة من مسارات كاملة وعائلات الجينات المتورطين في التنمية متعددة الخلايا أو وظيفة. وقد شهدت السنوات الأخيرة تقدما كبيرا في تطوير أداة لمعالجة الجينات في ذبابة الفاكهة 14،15. على سبيل المثال، تم تكييفها recombineering، والذي يستخدم على نطاق واسع في علم الوراثة الماوس للتلاعب يبني DNA باك، في الآونة الأخيرة لذبابة الفاكهة، من خلال استخدام P [acman] النواقل ونقل الجينات ΦC31 بوساطة 6. أشرطة اختيار مختلفة تسمح للالإدراج أو الحذف من تسلسل معين في أي مكان ضمن التركيبة باستخدام البكتيريا المختصة إعادة التركيب 4،13. قمنا بتعديل الأصلي P [acman] ناقلات بحيث يمكن استخدامها لبناء ذبابة الفاكهة. هذا ناقلات جديدة تمكن واحد لتوليد استهداف الأشرطة مع الأسلحة تناظر أكبر من تلك التي يمكن أن يتم بسهولة باستخدام قص ولصق أساليب الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، كما تم دمج شريط كاسيت عبارة-الاستنساخ في هذه النواقل، مما يسمح احد لوإدخال بكفاءة بسرعة الحمض النووي الجيني الجديد في النظام.

ورغم أن معظم المنهجية الموصوفة هنا واضح وصريح، هناك العديد من الخطوات وجدنا حاسم لنجاح هذه التقنية. ونظرا لحجم التلاعب الحمض النووي (> 15 KB)، في الجولة الأولى من رد فعل recombineering (القسم 3) يشكل عقبة فنية كبيرة. وبالتالي، هذه الجولة من recombineering يتطلب بروتوكول إعادة التركيب فعالة جدا. تعديلات طفيفة على ما يبدو بروتوكول، مثل تزايد الخلايا لكثافة أقل، وغسل الخلايا ثلاث مرات بدلا من اثنين ومع الجلسرين 10٪ بدلا من DH 2 </ دون> O 13، وتحسنت كثيرا من كفاءة التحول من الخلايا المختصة recombineering لدينا. وبالإضافة إلى ذلك، مع الحرص على التأكد من LA / RA تحتوي P [acman] هو قطع لإنجاز مع BamHI (الخطوة 3.1) يلغي الكثير من ايجابيات كاذبة.

أحداث إعادة التركيب غير مرغوب فيه تمثل مشكلة شائعة أخرى خلال recombineering. على سبيل المثال، لاحظنا حالات الازدواجية ونقل المواقع في مختلف بنيات. ويمكن لهذه الأحداث تؤدي إلى مشاكل متعددة خلال التحول ذبابة الفاكهة والجينات في الجسم الحي الاستهداف. التحقق PCR وتحليل التسلسل لا يمكن الكشف عن كل هذه الأحداث. وبالتالي، لا بد من إجراء تحليل انزيم التقييد على المنتج النهائي المستنسخة قبل حقن الحمض النووي في الأجنة. وقد ثبت هذا الاختيار النهائية الحرجة وأتاح لنا تجنب حقن بنيات التي تحتوي على الانحرافات غير المرغوب فيها.

ماكسي الإستعداد متجه تستهدف فقط قبل ينجection وأبدا تجميد DNA يحسن كثيرا من كفاءة تحويل هذه التركيبات كبيرة في ذبابة الفاكهة. باختصار، التفاصيل الصغيرة تحدث فرقا كبيرا في نجاح هذه التقنيات. أوجز البروتوكولات وأظهرت هنا تمثل رؤى من عدد من المصادر المختلفة وتجربتنا الخاصة.

في حين أننا نأمل بروتوكول المعروضة هنا يساعد الآخرين لتبني أساليب recombineering في مختبراتهم الخاصة، ونحن نعتقد مزيد من التحسينات والتحسينات على المنهجية لا تزال ممكنة. أحيانا، شظايا الجيني محددة يصعب التلاعب باستخدام recombineering وذلك لأسباب ليست واضحة تماما. وعلاوة على ذلك، على الرغم من بذل قصارى جهدنا للقضاء على الخلفية غير المرغوب فيها، لا نزال نجد أن قطعة معينة من الحمض النووي الجيني تميل إلى إنتاج recombineered بشكل غير صحيح المنتجات النهائية. فهم أعمق لعملية recombineering قد تسفر بروتوكولات أكثر الأمثل في مناقشة المستقبل والمفتوح للسوف recombineering الفشل وقصص نجاح تعزيز نجاح استخدام هذه التقنيات القوية من قبل المجتمع البحثي الأوسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لم يكن لديك أي مصالح متنافسة في ما يخص التقنيات المذكورة هنا.

Acknowledgments

ونود أن نشكر هوغو Bellen ومركز الأسهم بلومنجتون لالكواشف. نشكر مزيد كوين Venken، هوغو Bellen وجميع أعضاء مختبرات Buszczak وHiesinger لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة إلى ACR (T32GM083831)، PRH (RO1EY018884) وMB (RO1GM086647)، وهو منحة من الوقاية من السرطان معهد بحوث من تكساس إلى MB وPRH (RP100516)، وولش مؤسسة (I-1657) إلى PRH. MB هو EE وغرير غارسون Fogelson الباحث العلمي في أبحاث الطب الحيوي وPRH هو ماكديرموت الباحث يوجين في البحوث الطبية الحيوية في UT مركز ساوث ويسترن الطبي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Tags

علم الوراثة، العدد 77، الهندسة الحيوية، علم الأحياء الجزيئية، والهندسة الطبية الحيوية، علم وظائف الأعضاء،
Recombineering مثلي التركيبات التوحد في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter