Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Recombineering homologe recombinatie in Constructen Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

Homologe recombinatie technieken sterk vooruit

Abstract

De verdere ontwikkeling van technieken voor snelle, grootschalige manipulatie van endogene gen loci zal het gebruik van Drosophila melanogaster als een genetisch modelorganisme voor de menselijke-en vaatziekten gerelateerd onderzoek te verbreden. De afgelopen jaren hebben gezien de technische vooruitgang, zoals homologe recombinatie en recombineering. Echter, het genereren van eenduidige nulmutaties of tagging endogene eiwitten blijft een aanzienlijke inspanning voor de meeste genen. We beschrijven hier en demonstreren technieken voor het gebruik recombineering gebaseerde cloneringsmethoden vectoren die kunnen worden gebruikt om te richten en te manipuleren endogene loci in vivo genereren bijzonder hebben we een combinatie van drie technologieën vastgesteld:. (1) BAC transgenese / recombineering, ( 2) uiteinden-out homologe recombinatie en (3) Gateway-technologie om een ​​robuuste, efficiënte en flexibele methode voor het manipuleren van endogene genomische loci bieden. In dit protocol, bieden we stap-voor-stap informatie over hoe u (1) ontwerp individuatiel vectoren, (2) hoe grote fragmenten van genomisch DNA te klonen in de homologe recombinatie vector behulp kloof reparatie, en (3) hoe de genen van belang vervangen of taggen binnen deze vectoren met behulp van een tweede ronde van recombineering. Ten slotte zullen we ook een protocol voor hoe je deze cassettes te mobiliseren in vivo naar een knock-out, of een tag gen via knock-in te genereren. Deze methoden kunnen eenvoudig worden vastgesteld voor meerdere doelen in parallel en vormen een middel voor het manipuleren van de Drosophila genoom op een tijdige en efficiënte manier.

Introduction

Reinig moleculair-gedefinieerde manipulaties van enkele genen op hun endogene loci bieden een waardevol instrument om een groot aantal vragen aan eukaryote biologie relevante bestuderen. Drosophila reverse genetische technieken voor het genereren van het verlies-van-functie allelen had bewezen een uitdaging tot Golic en collega geïntroduceerd in vivo gene targeting middels homologe recombinatie Drosophila 1-3. Zij toonden aan dat specifieke genomische loci kunnen worden gericht met behulp van een lineair fragment van DNA uit een geïntegreerde transgene construct. Deze lineaire "donor" DNA in vivo gegenereerd door FRT-bemiddelde recombinatie (voor het uitsnijden van het DNA van het chromosoom als een circulair molecuul) gevolgd door linearisatie van het meganuclease I-SCEI. Hoewel deze methode is met succes gebruikt om een ​​verscheidenheid van gedefinieerde laesies genereren, is de techniek niet gemakkelijk schaalbaar is voor het manipuleren van vele genen in parallel omdat elke individueledubbele knockout construct vereist verschillende en aangepaste ontwerp. Zo zijn er problemen naadloos manipuleren van grote stukken DNA (> 5 kb) in vitro met klassieke restriction enzyme / ligatie klonen of PCR, en de grootte beperkingen van traditionele in vivo transformatievectoren vaak belemmeren dat spoedig homologe recombinatie richten vectoren. Om deze beperkingen te overwinnen, combineerden we de recombineering / transgenese P [Acman] systeem, dat de sub-klonen en transgenese van het mogelijk maakt tot 100 kb van DNA, met de uiteinden-out gentargeting methodologie om een ​​efficiënt en relatief snelle platform dat vergemakkelijkt Drosophila gene targeting.

Recombinatie-gemedieerde genetische manipulatie (recombineering) is een krachtige homologe recombinatie gebaseerde klonen technologie 4,5. In tegenstelling tot conventionele restrictie-enzym / ligase klonen is recombineering niet beperkt door de sequentie of Size van de gemanipuleerde DNA. Recombineering gebruikt een speciale E. coli-stam die recombinatie machines geleverd door een defecte λ profaag 4 havens. Deze techniek is onlangs goedgekeurd voor toepassing in Drosophila 6,7. Recombineering in Drosophila is gebaseerd op een gemodificeerde voorwaardelijk amplificeerbaar bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) vector genaamd P [Acman] 6,7. Deze vector draagt ​​twee oorsprongen van replicatie: OriV die hoog kopieaantal produceert op chemische inductie voor de zuivering van grote hoeveelheden DNA nodig voor sequencing en embryo injectie en ORIS, die onder basale omstandigheden low-copy number handhaaft. Bovendien, de P [Acman] vector is voorzien van een aanhechting van bacteriën (attB) plaats. De attB site als een substraat voor ΦC31 integrase gemedieerde transgenese is opname van grote DNA-fragmenten kunnen in een vooraf bepaalde landingsplaats in de Drosophila genoom 8,9.

We hebben gegenereerd een P [Acman] vector (aangeduid als P [Acman]-KO 1.0) die kunnen worden gebruikt als richtende vector voor ends-out homologe recombinatie 10,11. Op te nemen uiteinden-out gen targeting technologie in het systeem, voegden we twee FRT en twee I-SCEI sites. We hebben ook een Gateway cassette in deze vector gewijzigd om het proces van het opnemen van de homologie-armen in P [Acman]-KO 1.0 stroomlijnen. Dit geeft een snelle en eenvoudige manier om vrijwel elke genoomgebied plaats te introduceren in de targeting vector. In dit protocol beschrijven we hoe u een targeting vector met P [Acman]-KO 1.0, en hoe u deze vector mobiliseren in vivo aan de endogene locus richten ingenieur. Voor de toepassing van dit protocol zullen we de RFP / Kan cassette gebruiken om een ​​gen van belang vervangt, maar een verscheidenheid van cassettes die een antibioticum selectiemerker bevatten kunnen worden gebruikt met dit protocol. We hebben ontworpen en met succes een reeks cassettesgenvervanging en tagging 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Selectie van BAC en Regio aan Target

  1. Om een BAC verwerven met het gen van belang (RVI) (hier CG32095 wordt als voorbeeld gebruikt), zoeken naar CG32095 bij www.flybase.org . Onder de rubriek voorraden en reagentia, controleer de sectie getiteld "Genomic Clones" voor BAC's bevatten CG32095. Zorg ervoor dat de BAC ten minste 10 kb stroomopwaarts en 5 kb stroomafwaarts het gen van belang. Als alternatief kunnen klonen in de P [Acman] vector 7 ook te vinden op http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. De BAC-klonen komen in DH10B cellen en de P [Acman] klonen komen in EPI300 cellen. De genomische klonen moeten worden omgezet in SW102-cellen, die vatbaar zijn voor recombineering. "Vuile minipreps" worden uitgevoerd (een Qiagen miniprep zonder toepassing van een kolom en neerslaan van het DNA met isopropanol) uitgaandevan een 5 ml O / N cultuur geënt met cellen met de BAC. Na resuspensie van de vers gemaakte DNA pellet in 20 ul van dH 2 O, verdun 1 ui in 100 ul van dH 2 O en gebruik 1 pi tot elektrocompetente SW102 electroporate. Om ervoor elektrocompetente SW102 gebruiken het volgende protocol:
    1. Inoculeren SW102 cellen in 4 ml LB. Groeien kweken bij 32 ° CO / N schudden bij 250 rpm. Belangrijk: SW102 cellen moet nooit worden blootgesteld aan een temperatuur hoger dan 32 ° C, tenzij de inductie van recombinatie machines gewenst.
    2. Inoculeren 1 ml van de verzadigde SW102 cultuur in 44 ml LB en groeien op een 32 ° C shaker aan OD 600 tussen de 0,2-0,3 (meestal ongeveer 1-1,5 uur). OPMERKING: Andere recombineering protocollen raden groeit de cultuur in een kleiner volume aan OD 600 0.6-0.7 echter groeien de bacteriën een lagere dichtheid in groter volume verhoogt transformatie efficiency 12. Daarnaast is deze wijziging de wachttijd.
    3. Koel de cultuur in ijs-water slurry gedurende 5 minuten. Belangrijk: Tijdens de volgende stappen cellen bij lage temperaturen worden bewaard. Dit is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een goede kwaliteit elektrocompetente cellen.
    4. Centrifugeer cultuur bij 4 ° C bij 1500 xg gedurende 10 minuten. Gooi supernatant en was pellet in 25 ml koud (4 ° C) 10% glycerol 13. Eerste, resuspendeer cellen in 5 ml door te tikken en wervelende de buis in ijs-water slurry (NIET pipet OP EN NEER) en voeg vervolgens de resterende 10% glycerol (20 ml).
    5. Centrifugeer bij 4 ° C bij 1500 xg gedurende 10 min, gooi supernatant en was de pellet een tweede keer met 25 ml ijskoude 10% glycerol.
    6. Centrifugeer bij 4 ° C bij 1500 xg gedurende 10 min, gooi supernatant en was de pellet een derde keer met 25 ml ijskoude 10% glycerol.
    7. Centrifugeer bij 4 ° C bij 1500 g gedurende 10 min en gooi supernatant. De cel pellet kan op dit punt heel los zijn en zorg moeten worden genomen bij het weggooien van het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml koude 10% glycerol. Breng de cellen een 1,5 ml buis en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 12.000 x g in een tafelblad microcentrifuge bij 4 ° C. Gooi meeste supernatant verlaten ≈ 90 gl glycerol / cellen. De cellen zijn nu klaar om te worden geëlektroporeerd. OPMERKING: Op dit punt cellen bij -80 ° C voor later gebruik opgeslagen kunnen worden. Dit kan echter competentie afnemen.
    8. Elektroporatie van DNA in cellen met een 1 mm cuvette bij 1800 V, 25 uF, 200 Ω. Na elektroporatie wordt 300 pl SOC en liet de cellen herstellen gedurende 2 uur bij 32 ° C (schudden is niet nodig). Cellaag op LB agar plus 25 ug / ml chlooramfenicol (of andere geschikte antibiotica naargelang de getransformeerde BAC of PAC) en incubeer bij 32 ° C gedurende 24-30 uur.
  4. Homologie armen voor gentargeting zijn ontworpen door selecting 10 kb van genomisch DNA stroomopwaarts en 5 kb stroomafwaarts ten opzichte van de Indiase overheid. Selecteer 500 bp aan het eind van de 10 kb en 5 kb homologie armen te versterken (zie hoofdstuk 2) (Figuur 1). Deze 500 bp fragmenten dienen als de homologie armen gebruikt om de genomische regio rond de Indiase overheid in P [Acman] KO 1.0 recombineren. Deze fragmenten worden genoemd linkerarm (LA) voor de regio die correspondeert met de upstream 5 'homologie-arm en rechter arm (RA) van het gebied dat overeenkomt met het stroomafwaartse 3'-homologie-arm. Belangrijk: Homologie armen moet niet BamHI bevatten restrictieplaatsen, de linearisatie van het plasmide (in stap 3.2) wordt bewerkstelligd via een BamHI restrictie digest.

2. Plaats de Homologie Arms in P [Acman]-KO 1.0

  1. Instellen van twee afzonderlijke PCR-reacties, een om versterken de LA en een andere om de RA versterken. Voor de LA, gebruiken primers attB1-I-SCEI-LA-F en BamHI-LA-R en gebruik de primers BamHI-RA-F en attB2-I-SCEI-RA-Rhet amplificeren van de RA (tabel 1). Met 1 pl BAC DNA van stap 1.2 of 0.5 gl gekookte bacteriële kweek die gedurende de nacht BAC plaats als een template. Zorg ervoor dat u een DNA-polymerase te gebruiken met proeflezen vermogen. Dit geldt voor alle volgende PCR-met uitzondering van de PCR check in stappen 2.8 en 3.13. OPMERKING: Verlenging tijd voor een proofreading DNA polymerase anders dan gewone Taq DNA-polymerase afhankelijk van de fabrikant kan zijn. PfuUltra II Fusion HotStart dat polymeriseert bij een snelheid van 15 sec / kb, kan worden gebruikt in deze stap.
    LA / RA PCR
    1 ui DNA van vuile miniprep uit stap 1.2 van Bac
    0.25 pl Elk 20 uM Primer
    2,5 pl 10X PfuUltra II Buffer
    0.75 pi 10mm (elk) dNTP
    0.5 ul PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase
    19.75 pi Water
    25 gl Totaal Volume
    PCR Voorwaarden
    Step1 95 ° C 2 min te activeren enzym
    Step2 95 ° C 20 sec denatureren
    Step3 60 ° C 20 sec gloeien
    Step4 72 ° C 20 sec verlenging
    Step5 Ga naar stap 2 en herhaal 29 cycli
    Step6 4 ° C Hold
  2. Voer monsters op een 1% agarose gel en extraheer producten met een Zymoclean DNA herstel kit. Elueer het DNA uit de kolom Zymoclean met 10 pl steriel water.
  3. Voeren splicing door overlappende extensie (PCR SOE) met de twee fragmenten met 10-30 ng van totaal DNA van elk geamplificeerd product gezuiverd op 2.2 (figuur 2). Dit is meestal ongeveer 1/20 e van elke gezuiverde PCR product:
    LA / RA PCR-Soe
    0.5 pi elk LA en RA gezuiverde PCR product ongeveer 10-30 ng
    0.25 pi elk 20 uM Primer
    2,5 pl 10X PfuUltra II Buffer
    0.75 pi 10mm (elk) dNTP
    0.5 ul PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase
    19.25 pi Water
    25 gl Totaal Volume
    PCR Voorwaarden
    Step1 95 ° C 2 min te activeren enzym
    Step2 95 ° C 20 sec denatureren
    Step3 55 ° C 20 sec gloeien (Lower temp. Om voor de armen te gloeien)
    Step4 72 ° C 20 sec verlenging
    Step5 Ga naar stap 2 en herhaal 1 cyclus
    Step6 95 ° C 20 sec denatureren
    Step7 60 ° C 20 sec gloeien
    Step8 72 ° C 20 sec verlenging
    Step9 Ga naar stap 2 en herhaal 27 cycli
    Stap 10 4 ° C Hold
  4. Voer het PCR monster op een agarosegel en herstellen van de 1,0 kb band door gelextractie. Dit is de attB1-LA-BamHI-RA-attB2 cassette.
  5. Gebruik Gateway BP ClonaseII Enzyme kit voor het opzetten van een BP reactie volgens het protocol van de fabrikant.De cassette gegenereerd in 2.4 zal optreden als de donor-DNA en de P [Acman]-KO 1.0 als bestemming vector.
  6. Verdun 50 pi TransforMax EPI300 elektrocompetente cellen door toevoeging van 30 ul koude 10% glycerol of koud dH 2 O. Transformeren 1 ul van de BP-reactie in elektrocompetente cellen volgens het protocol van de fabrikant. De toevoeging van water verdunt de vrij hoge zoutconcentratie van de BP reactie op elektrische ontlading (vonken) tijdens elektroporatie voorkomen. Elektroporatie van DNA in cellen met een 1 mm cuvette bij 1800 V, 25 uF, 200 Ω.
  7. Voeg 300 ui SOC en laat cellen herstellen gedurende 1 uur bij 37 ° C (schudden is niet nodig). Plaat cellen op LB-agar + 50 ug / ml Amp (P [Acman]-KO 1.0 bevat een versterker resistentiegen). Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 18-24 uur.
  8. PCR check individuele kolonies door conventionele kolonie PCR met behulp van T3 (T3 volgorde is stroomafwaarts van de Gateway cassette in de P [Acman]-KO 1.0 (Figure 1) en attB1-I-SCEI-LA-F primers. Positieve klonen zal een band die draait op 1,2 kb tonen.
  9. Groei een overnacht cultuur van een positieve kloon in LB met 50 ug / ml ampicilline.
  10. Versterken de P [Acman]-KO 1.0 vector die het LA en RA in een 10 ml LB met 50 ug / ml ampicilline culture met behulp van copy control oplossing volgens protocol van de fabrikant (Epicentre).
  11. Voer een Qiagen miniprep volgens protocol van de fabrikant.

3. Recombineren de Genomic regio van belang in P [Acman]-KO 1.0

Dag 1

  1. Inoculeren SW102 cellen met de BAG van belang in 4 ml LB plus 25 ug / ml chlooramfenicol (Chl) of de juiste keuze antibioticum. Groeien kweken bij 32 ° CO / N schudden bij 250 rpm. Belangrijk: Behalve tijdens de inductie in stap 3.5 moeten SW102 cellen niet worden blootgesteld aan een temperatuur boven 32 ° C, zoals hoge temperatuur activeert de recombinatie machines van deze cellen.

Dag 2

  1. Digest 0,4 ug van de P [Acman]-KO-1.0 met de LA en RA armen gegenereerd in paragraaf 2 met ≈ 20 eenheden van BamHI in een 25 ul reactie. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 3 uur. Belangrijk: Long digestie is essentieel voor digestie van DNA te waarborgen. Hierdoor wordt het aantal valse positieven klonen later afnemen.
  2. Inoculeer 1,0 ml van de verzadigde SW102/BAC cultuur in 44 ml LB-Chl (25 ug / ml) en groeien op een 32 ° C schudder OD 600 tussen 0,2-0,3 (gewoonlijk ongeveer 1-1,5 uur). Voorzien van een extra identiek monster zonder HS control. Dit monster wordt behandeld, net als de experimentele men in elk aspect behalve de HS. Deze niet-warmte-geschokt cultuur dient als een negatieve controle. Het verschijnen van vele kolonies op de niet-HS controleplaat (stap 3.13) geeft meestal transformatie met onverteerde P [Acman] KO 1.0 LA/ RA plasmide.
  3. Terwijl de cultuur groeit, lopen de BamHI-restricted P [Acman]-KO op een gel. Dan gel-extract en elueren van het DNA in 10 ul van water opgewarmd tot 55 ° C. OPMERKING: DNA niet elueren in een buffer. Zouten aanwezig in de buffer kan elektrische ontlading veroorzaken tijdens elektroporatie.
  4. Heat-shock de cultuur bij 42 ° C gedurende precies 15 minuten in het waterbad. Dit zal de recombineering machines van SW102-cellen te activeren. Laat de controle cultuur niet warm shock.
  5. Onmiddellijk na hitte-shock, overdracht warmte-geschokt en non-HS controle kweken om gekoelde 50 ml canonieke buizen en laat de culturen kou in een ijs-water slurry gedurende 5 minuten. Belangrijk: Tijdens de volgende stappen cellen bij lage temperaturen MOET worden gehouden . Dit is cruciaal voor een goede kwaliteit elektrocompetente cellen te verkrijgen.
  6. Centrifugeer cultuur bij 1500 xg gedurende 10 minuten. Gooi supernatant en was pellet in 25 ml koud (4 ° C) 10% glycerol 13. Ten eerste,resuspendeer cellen in 5 ml door te tikken en wervelende de buis in ijs-water slurry (NIET pipet OP EN NEER) en voeg vervolgens de resterende 10% glycerol (20 ml).
  7. Centrifugeer bij 4 ° C bij 1500 xg gedurende 10 min, gooi supernatant en was het pellet met 25 ml ijskoude 10% glycerol een tweede keer.
  8. Centrifugeer bij 4 ° C bij 1500 xg gedurende 10 min, gooi supernatant en was het pellet met 25 ml ijskoude 10% glycerol een derde keer.
  9. Centrifugeer bij 4 ° C bij 1500 g gedurende 10 min en gooi supernatant. De cel pellet kan op dit punt heel los zijn en zorg moeten worden genomen bij het weggooien van het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml koude 10% glycerol. Breng de cellen een 1,5 ml buis en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 12.000 x g in een tafelblad microcentrifuge bij 4 ° C. Gooi meeste supernatant verlaten ≈ 90 gl water / cellen. OPMERKING: Op dit moment cellen bij -80 ° C voor later gebruik worden opgeslagen. Dit kan echter competentie afnemen.
  10. Voeg 2 pi van de BamHI-verteerd P [Acman] (streven naar 50 ng) aan de cellen toe en meng voorzichtig met een pipet tip. Overdracht van cellen in een 1 mm elektroporatie cuvette en electroporate bij 1800 V, 25 uF, 200 Ω.
  11. Voeg 300 ui SOC en liet de cellen herstellen gedurende 2 uur bij 32 ° C (schudden is niet nodig). Cellaag op LB agar plus 50 ug / ml ampicilline en incubeer bij 32 ° C gedurende 24-30 uur.

Dag 3

  1. Scherm voor een goede gap-reparatie behulp kolonie PCR. Gebruik T3 en RA controleren primers voor de RA en de T7 en LA cheque primer voor de LA (tabel 1). Het ontwerp van de PCR-Check-RA en PCR-Check-LA primers 100-200 bp naar de gerichte regio (tabel 1). . Positieve kolonies van PCR-reacties met behulp van PCR-Check-RA met T3 of PCR-Check-LA met T7 zal een band die draait op 800-1000 bp (figuur 3) OPMERKING tonen: Het is cruciaal om beide armen te testen sinds de oprichting van een armmaar niet de andere soms waargenomen.
  2. Kweek PCR geverifieerde kolonies bij 32 ° C in 4 ml LB 50 ug / ml ampicilline voor overnacht. Maak een bevroren voorraad van deze cellen voor later gebruik.

4. Het vervangen van de Genomic Gewest met de Targeting Cassette

Dag 4

  1. Versterken de RFP / KAN knockout cassette met PCR met behulp pENTR-RFP/KAN (voorverteerd met Ascl en Nhel te lineariseren) als sjabloon en de 5'HA-RFP / Kan-F en 3'HA-RFP / Kan-R primers ( Tabel 1). RFP / KAN cassette kan worden opgevraagd uit referentie 11.
  2. Gel zuiveren het PCR-product eluting in 20 ui steriel water. De RFP-KAN cassette plus de homologie armen moeten rondrennen 3 kb.
  3. Inoculeer 1 ml van de verzadigde SW102 / P [Acman] KO-cultuur (stap 3.13) in 44 ml LB-Amp (50 ug / ml) en groeien op 32 ° C schudder OD 600 tussen 0.2-0.3. Voorzien van een extra identiek monster zonder HS control. Dit monster zal alleen worden behandeldzoals experimentele die in elk aspect behalve de HS.
  4. Na de SW102 / P [Acman]-KO cultuur de gewenste dichtheid bereikt, volgt u de stappen 3,5-3,10.
  5. Electroporate ongeveer 100 ng targeting cassette in 90 ui elektrocompetente SW102 / P [Acman] KO-cellen. Overdracht van cellen in een 1 mm elektroporatie cuvette en electroporate bij 1800 V, 25 uF, 200 Ω. Voeg 300 ul van SOC en laat cellen te herstellen gedurende 2 uur bij 32 ° C (schudden is niet nodig). OPMERKING: Het wordt sterk aangeraden om een frisse gel gezuiverd cassette gebruiken.
  6. Cellaag in LB agar + Amp (50 ug / ml) + Kan (50 ug / ml) en incubeer gedurende 24-30 uur bij 32 ° C.

Dag 5

  1. Grow 5 ml van de cultuur uit 5 verschillende kolonies bij 32 ° CO / N.

Dag 6

  1. Voer een "vuile miniprep" en run de helft van de verkregen DNA op een 1% agarosegel om te zoeken naar de presence van een laagmoleculair plasmide. Er mag geen sprake zijn van plasmide die balg 12 kb loopt. (Figuur 4)
  2. Maak een 1:500 verdunning van DNA van een positieve kloon en gebruiken 1 pi tot electroporate in 50 ul van TransforMax EPI300. Belangrijk: Zorg ervoor dat het DNA te verdunnen tot elektroporatie van meerdere plasmiden te voorkomen in een cel. Cellaag in LB agar + Amp (50 ug / ml) + Kan (50 ug / ml) en geïncubeerd gedurende 18-24 uur bij 37 ° C

Dag 7

  1. Inoculeren een enkele kolonie in 10 ml LB + en groeien O / N.

Dag 8

  1. Zaad 100 ml LB-medium met verzadigde cultuur van stap 4.10. Voeg het juiste antibiotica plus 100 ul van 1000 X kopieerbeveiliging oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 5-6 uur.
  2. Voer een maxiprep en controleer het inbrengen van de cassette in de juiste plaats door sequencing.
  3. Naast sequencing, het uitvoeren van een restrictie enzyme digestie proef met DNA uit een kloon die geen laag molecuulgewicht en zijn parentale plasmide DNA bevatte. De verschillende restrictie-enzymen geselecteerd voor elk gen worden, maar het doel is om een ​​groep van enzymen waarmee de onderzoeker de recombineered vector kenmerkend voorbeeld. Bij wijze van voorbeeld werd het CG32095 targeting vector serie geknipt met Pacl, Ascl, BamHI en AatII. Het uiterlijk van de voorspelde banden en afwezigheid van onjuiste banden bevestigt dat de targeting vector correct recombineered (figuur 5).

5. Injecteren Vliegen en Mobiliseren Cassette In Vivo

  1. Injecteer de cassette met ΦC31 integrase, in een vooraf bepaalde landingsplaats van keuze. Externe leveranciers, zoals Rainbow Transgene ( http://www.rainbowgene.com ), kan worden gebruikt voor injectie services. Belangrijk: Het DNA moet vers worden pgerepareerd vóór de injectie. Hogere efficiëntie transformatie wordt waargenomen wanneer het DNA wordt bereid op het terrein en geïnjecteerd op dezelfde dag.
  2. Om de cassette uit de landingsplaats te mobiliseren, te gebruiken Bloomington voorraad nummer 25680 of 25679. Deze voorraden bevatten flippase en I-SCEI stroomafwaarts van een heat shock promotor, op chromosoom twee en drie, respectievelijk. Bovendien bevatten ze een hs-hid transgen op balancer chromosoom en het Y-chromosoom. Verzamel mannetjes uit de gekozen voorraad en over te steken naar maagdelijke vrouwtjes dragen van de KO cassette in de landingsplaats. . Set ~ 30 kruisen en laat vrouwtjes om eieren te leggen voor 2-3 dagen OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de voorraad die op een ander chromosoom van de gerichte locus kiezen.
  3. Flip ouders een nieuwe set van 30 flacons en hitteschok larven bij 37 ° C gedurende 1 uur, tweemaal per dag gedurende drie opeenvolgende dagen. De warmte schokken activeert de productie van enzymen, flippase en I-SCEI, en de celdood gen verborgen
  4. Verzamel maagdelijke vrouwtjes van de F1 nakomelingen van de warmte-geschokt vliegen, en over te steken naar y - w - mannetjes. Streven naar 150-200 kruisen, drie maagden en drie mannetjes per kruis.
  5. Screenen de F2 nakomelingen onder een tl-scope die detectie van RFP in het oog maakt. Scherm voor RFP positieve ogen die mutant voor de witte en gele genen (y - w -). Deze screening positief selecteert voor de aanwezigheid van de RFP cassette en selecteert de afwezigheid van het P [Acman] vector (mini-wit) en landingsplaats dat aangegeven wordt door het wild type geel-gen. Opmerking: Het is minder tijd -conervan uitgaand om te screenen op RFP in het oog, dan naar de homepage voor yw vliegen. De gebeurtenissen mobilisatiestrategieën zeer efficiënt tijdens de hitte schokken, wat veel minder vliegen die RFP in het oog ten opzichte van y - w - vliegen.
  6. Opgezet enkel paar paringen met elke y - w - RFP + vlieg, omdat elke gebeurtenis mobilisatie verschillend kunnen zijn. Wijs de RFP naar de juiste chromosoom. Correct chromosoom targeting wordt typisch waargenomen in> 95% van de gevallen.
  7. Vaststellen voorraden en controleer de juiste targeting evenementen met behulp van standaard technieken voor Zuidelijk Blot analyse. Ontwerp een 2 kb probe stroomopwaarts (linkerarm) en downstream (rechterarm) van het gen het doelwit, en 2 kb (of korter indien nodig) verspreid over de verwijderde ORF. De eerste twee probes een band op in de homozygote en heterozygote knockouts, dat niet in het wildtype, terwijl het ORF niet opbrengst een band in de homozygote knockout. Een snelle PCR-fof ORF is ook mogelijk, maar dit is afhankelijk van het ontbreken van een band.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Amplificatie van de RA en LA homologie-armen moet produceren 500 bp producten en SOE PCR-reactie moet opleveren een 1,0 kb product (Secties 2.1-2.4, Figuur 2). De BP reactie uitgevoerd in paragraaf 2.5 is typisch zeer efficiënt en bacteriële transformatie van het product rendementen 5-100 kolonies gemiddeld. Bijna alle getest met PCR kolonies controleren tonen de verwachte PCR-product.

Tijdens de eerste ronde van recombineering (hoofdstuk 3) verwacht 20-40 kolonies te krijgen na de transformatie van de verteerde P [Acman]-KO-1.0 met de LA en RA armen in SW102 cellen. 40-60% van deze klonen het gewenste recombinatie product dragen. De niet-warmte-shock controle mag bevatten weinig of geen kolonies ten opzichte van het warmte geschokt cellen. Het uiterlijk van hetzelfde aantal kolonies op zowel monster en controle platen geeft meestal de aanwezigheid van ongesneden plasmide of een andere verontreiniging. In dit geval, het experiment Should worden weggegooid en herhaald, ditmaal verteren van de P [Acman]-KO-1.0 die de LA en RA armen tot voltooiing na de in stap 3.2 beschreven instructie. Een voorbeeld van een PCR controle voor het ophalen van genomisch gebied plaats naar P [Acman]-KO 1.0 waarin ≈ 60 kolonies werden verkregen wordt weergegeven in figuur 3. Hier 60% van de geteste kolonies droeg de gewenste recombinatie product.Care moet worden dat de waargenomen PCR-producten draaien op de voorspelde grootte, aangezien afwijkende PCR bands dan meestal ingevuld recombineering gebeurtenissen.

Af en toe geen kolonies zal groeien na de eerste ronde van recombineering. Met behulp van cellen met suboptimale efficiëntie is de meest voorkomende oorzaak van een mislukte recombineering reactie. Het houden van de cellen kou te allen tijde tijdens de voorbereiding en voorzichtige behandeling tijdens de wasbeurten (NOOIT vortex) is van cruciaal belang voor het verkrijgen van hoge kwaliteit competente cellen. Probeer altijd vers verteerd / gezuiverd P [Acman]-KO-1.0 DNA om het hoogste rendement te verkrijgen.

Soms is de eerste ronde van de recombineering opbrengsten koloniën, maar die kolonies niet door de PCR-check-test. Dit geeft gewoonlijk ingevuld recombineering producten, maar dit resultaat kan ook op mogelijke problemen met een van de primer sets. Om de PCR-Check-LA primer te valideren, het opzetten van een PCR-reactie in combinatie met de attB1-I-SCEI-LA-F. Om te controleren PCR-check-RA opzetten van een PCR-reactie met de attB2-I-SCEI-RA-R. In beide gevallen dient u de originele BAC als een sjabloon. Deze PCR reacties moeten producten van de verwachte grootte, die variëren afhankelijk van de sequentie van de primers controle opleveren. Positieve resultaten van deze controle-experiment zal uitsluiten van de mogelijkheid dat een onvermogen om positieve klonen te detecteren is te wijten aan primer inefficiëntie.

Als je de eerste ronde van recombineering meerdere malen na de bovenstaande protocol zonder succes hebben geprobeerd en hebben alle uitgevoerdestelde controles, adviseren wij te kiezen voor een nieuw paar 500 bp homologie armen. Om redenen die niet duidelijk op dit moment zijn een aantal genomische regio's zeer resistent tegen DNA recombinatie. Simply ontwerpen van nieuwe homologie-armen en deze naar of van het gen van belang bewegende wellicht verhelpen van deze problemen.

De tweede ronde van recombineering (hoofdstuk 4) is meestal veel efficiënter. Normaal 30-50 kolonies worden waargenomen na transformatie met 90-95% van die met de gewenste construct. Het meest voorkomende probleem bij deze stap is het verkrijgen van vals-positieve kolonies. Figuur 4 toont voorbeelden van ware en valse positieve klonen na de tweede ronde van recombineering (hoofdstuk 4).

Figuur 1
Figuur 1. Schema van de process een P [Acman] produceren-KO 1.0 targeting vector. Aangepast van Chan et al.. (2012). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Schematische voorstelling van splicing door overlappende PCR (PCR SOE) uitgevoerd op stap 2.3. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. PCR-check gel die de efficiëntie van de eerste recombineering evenement Elke baan staat voor een enkele kolonie A:.. Kolonies getest op linkerarm. integratie met T7 en LA-check primers B: Hetzelfde als A kolonies, getest rechterarm integratie met T3 en RA-check primers.1kb Plus DNA Ladder werd gebruikt als een moleculair gewicht marker. OPMERKING: Vanwege de slechte priming van T3 primer opzichte van T7, de banden van de rechter arm controle waren beduidend donkerder. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het bekijken van de gel.

Figuur 4
Figuur 4. DNA agarose gel met hoog molecuulgewicht plasmiden (P [Acman]) en een laag molecuulgewicht plasmide (onverteerd template) geïsoleerd van mogelijke positieve klonen na de tweede ronde van recombineering. DNA werd geïsoleerd uit 4 mogelijke positieve klonen en ontving een 1% agarosegel gekleurd met ethidium bromide. Klonen 1,3 en 4 zijn echte positieve klonen. Kloon 2 is een vals positief zoals opgemerkt door de alle vormen van ap lasmid die loopt balg 12 kb (de grootste maat band in DNA ladder laan). 1 kb DNA Ladder Plus werd gebruikt als een molecuulgewicht marker.

Figuur 5
Figuur 5. Test voor de gewenste recombinatiegebeurtenis door restrictie-enzym digestie. In het bovenstaande voorbeeld wordt een computer-voorspelde bandpatroon van de P [Acman]-KO CG32095 voor en na de tweede ronde van recombineering. Vier verschillende enzymen werden gebruikt: Pacl, Ascl, AatII en BamHI. Correct gerecombineerde product zal dezelfde banden als haar ouderlijke P [Acman]-KO CG32095 hebben behalve de beoogde verandering (pijlpunten). NEBcutter V2.0 werd gebruikt om de band patroon voorspellen.

0346/50346fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50346/50346fig6.jpg "/>
Figuur 6. Schematische beschrijving van de mobilisatie van een targeting cassette in vivo. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Tabel 1
Tabel 1. Primers. Klik hier om een grotere tafel te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kracht van genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek is grotendeels gebaseerd op de tools beschikbaar voor genetische manipulatie. De kleine modellen C. elegans en Drosophila in het bijzonder zorgen voor goedkope en snelle moleculair genetische analyses van complete trajecten en gen families betrokken bij meercellige ontwikkeling of functie. De afgelopen jaren hebben significante vooruitgang in de ontwikkeling hulpmiddel gezien voor het manipuleren van genen in Drosophila 14,15. Zo werd recombineering, die op grote schaal wordt gebruikt in muisgenetica Bac DNA constructen manipuleren onlangs aangepast voor Drosophila, door het gebruik van de P [Acman] ΦC31 en vector-gemedieerde transgenese 6. Andere selectie cassettes zorgen voor het invoegen of verwijderen van specifieke sequenties overal binnen een construct met recombinatie bevoegde bacteriën 4,13. We hebben wijzigde het oorspronkelijke P [Acman] vector zodat het kan worden gebruikt voor het construeren Drosophila richten. Deze nieuwe vector laat toe gericht cassettes met homologie-armen groter dan die die gemakkelijk kunnen worden gemaakt met knippen en plakken kloneringswerkwijzen genereren. Bovendien is een Gateway-kloneringscassette ook opgenomen in deze vector, waardoor een snel en efficiënt introduceren nieuwe genomisch DNA in het systeem.

Hoewel de meeste van de hier beschreven methode is eenvoudig, er verschillende stappen we kritisch voor het succes van de techniek gevonden. Vanwege de grootte van het gemanipuleerde DNA (> 15 kb), de eerste ronde van recombineering reactie (deel 3) vormt een belangrijke technische hindernis. Vandaar dat deze ronde van recombineering vereist een zeer efficiënte recombinatie protocol. Ogenschijnlijk kleine aanpassingen protocol, zoals het kweken van de cellen lagere dichtheid, wassen van de cellen drie keer in plaats van twee en 10% glycerol in plaats van dH 2 </ Sub> O 13, zijn sterk verbeterd de transformatie-efficiëntie van onze recombineering competente cellen. Daarnaast, zorg ervoor zorgen dat de LA / RA met P [Acman] wordt gesneden tot voltooiing met BamHI (Stap 3.1) elimineert veel valse positieven.

Ongewenste recombinatie gebeurtenissen vormen een andere vrij veel voorkomend probleem tijdens recombineering. Zo hebben we gevallen van dubbel werk en de translocatie waargenomen binnen diverse constructies. Deze gebeurtenissen kunnen leiden tot meerdere problemen tijdens Drosophila transformatie en in vivo gene targeting. PCR verificatie en sequencing analyse kan niet detecteren al deze gebeurtenissen. Daarom moet een restrictie-enzymanalyse worden uitgevoerd op de uiteindelijke gekloneerde product vóór injectie van DNA in embryo. Deze laatste controle heeft bewezen kritisch en heeft ons toegestaan ​​om te voorkomen dat het injecteren van constructies die ongewenste afwijkingen bevatten.

Maxi-prepping de targeting vector vlak voor injeel en nooit het DNA bevriezen sterk verbetert de efficiëntie van de omzetting van deze grote constructen in Drosophila. Kortom, kleine details maken een groot verschil in het succes van deze technieken. De protocollen beschreven en gedemonstreerd hier inzichten uit een aantal verschillende bronnen en onze eigen ervaring vertegenwoordigen.

Hoewel we hopen dat het protocol hier gepresenteerde helpt anderen om recombineering methoden in hun eigen laboratoria te nemen, geloven wij verdere verbeteringen en verfijningen aan de methode zijn nog steeds mogelijk. Soms specifieke genomische fragmenten moeilijk te manipuleren met recombineering om redenen die niet geheel duidelijk. Bovendien, ondanks onze inspanningen om ongewenste achtergrondgeluiden te elimineren, hebben we nog steeds vinden dat bepaalde stukjes genoom DNA de neiging om verkeerd recombineered eindproducten te produceren. Een dieper begrip van de recombineering proces kan meer optimale protocollen op in de toekomst en open discussie overrecombineering mislukkingen en succesverhalen zal het succesvolle gebruik van deze krachtige technieken door de bredere onderzoeksgemeenschap te bevorderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende belangen met betrekking tot de hier beschreven technieken.

Acknowledgments

We zouden graag bedanken Hugo Bellen en de Bloomington Stock Centrum voor reagentia. We verdere danken Koen Venken, Hugo Bellen en alle leden van de Buszczak en Hiesinger labs voor behulpzaam discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Health om ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) en MB (RO1GM086647), een subsidie ​​van de Cancer Prevention Research Institute van Texas naar MB en PRH (RP100516) en de Welch Foundation (I-1657) te PRH. MB is een EE en Greer Garson Fogelson Scholar in biomedisch onderzoek en PRH is een Eugene McDermott Scholar in biomedisch onderzoek aan de UT Southwestern Medical Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Tags

Genetica Biotechniek Moleculaire Biologie Biomedische Technologie Fysiologie, Genetica (dieren en planten) recombineering, Homologe recombinatie Knock-out recombinatie genetische manipulatie gen-targeting gen genen DNA PCR Primers sequencing diermodel
Recombineering homologe recombinatie in Constructen<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter