Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Recombineering homolog rekombination Konstruktionerna i Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

Homolog rekombination tekniker avancera kraftigt

Abstract

Den fortsatta utvecklingen av tekniker för snabb, storskalig manipulering av endogena genloci kommer att bredda användningen av Drosophila melanogaster som en genetisk modell organism för human-sjukdom relaterad forskning. De senaste åren har tekniska framsteg som homolog rekombination och recombineering. Dock genererar entydiga null mutationer eller tagga proteiner endogena fortfarande en betydande insats för de flesta gener. Här beskriver vi och demonstrera tekniker för att använda recombineering-baserade kloning metoder för att generera vektorer som kan användas för att rikta och manipulera endogena loci in vivo Specifikt har vi etablerat en kombination av tre tekniker:. (1) BAC transgenes / recombineering, ( 2) ändar ut homolog rekombination och (3) Gateway teknik för att ge en robust, effektiv och flexibel metod för att manipulera endogena genomiska loci. I detta protokoll, ger vi steg-för-steg-information om hur du (1) utformning individual vektorer, (2) hur man klona stora fragment av genomisk DNA i homolog rekombination vektor gap-reparation, och (3) hur man kan ersätta eller tagga gener av intresse inom dessa vektorer med hjälp av en andra omgång av recombineering. Slutligen ger vi också ett protokoll för hur man kan utnyttja dessa kassetter in vivo för att generera en knockout, eller en taggad gen via knock-in. Dessa metoder kan lätt anpassas till flera mål parallellt och ger ett medel för att manipulera Drosophila genomet i ett snabbt och effektivt sätt.

Introduction

Rengör molekylärt definierade manipulationer av enstaka gener hos deras endogena loci erbjuder ett ovärderligt verktyg för att studera en myriad av frågor av betydelse för eukaryot biologi. Drosophila omvända genetiska tekniker för att generera förlust av funktion alleler hade visat sig vara utmanande tills Golic och kollegor infördes vivo genmålsökning använder homolog rekombination till Drosophila 1-3. De visade att specifika genomiska loci kan riktas med hjälp av ett linjärt fragment av DNA från en integrerad transgen konstruktion. Denna linjära "donator" DNA genereras in vivo genom FRT-medierad rekombination (för att skära ut DNA från kromosomen som en cirkulär molekyl) följt av linearisering med meganuclease I-SCEI. Även om denna metod har använts för att generera ett antal olika definierade lesioner har tekniken inte varit lätt skalbara för manipulering av ett stort antal gener parallellt, eftersom varje enskilddubbla knockoutkonstruktet kräver distinkt och egen design. Till exempel, svårigheter att sömlöst manipulera stora fragment av DNA (> 5 kb) in vitro med användning av klassisk restriktionsenzym / lige kloning eller PCR, samt de begränsningar storleken av traditionell in vivo transformationsvektorer stör ofta med att snabbt skapa homolog rekombination inriktning vektorer. För att övervinna dessa begränsningar, kombinerat vi recombineering / transgenes P [acman] systemet, vilket gör att sub-kloning och genmodifiering av upp till 100 kb av DNA, med ändarna ut genmålinriktning metodik för att skapa en effektiv och relativt snabb plattform som underlättar Drosophila genmålsökning.

Rekombination-medierad genetisk ingenjörskonst (recombineering) är en kraftfull homolog rekombination-baserad kloning teknik 4,5. I motsats till konventionell restriktionsenzym / ligas kloning, är recombineering inte begränsad av en gensekvens eller size av manipulerade DNA. Recombineering använder en speciell E. coli-stam som härbärgerar rekombination maskiner från en defekt λ profag 4. Denna teknik har nyligen antagits för användning i Drosophila 6,7. Recombineering i Drosophila bygger på en modifierad villkorligt amplifierbar bakteriell artificiell kromosom (BAC) vektor kallas P [acman] 6,7. Denna vektor bär två replikationsursprung: oriV, som producerar högt-kopietal vid kemisk induktion för rening av stora mängder av DNA som krävs för sekvensering och embryo injektionen och oris, som upprätthåller låg-kopietal enligt basala förhållanden. Dessutom P [acman] vektor är utrustad med en bakteriell infästning (attB)-ställe. Den attB-ställe fungerar som ett substrat för ΦC31 integras-förmedlad transgenes som tillåter inkorporering av stora DNA-fragment till en förutbestämd landningsplats inom Drosophila genomet 8,9.

Vi har genererat en P [acman] vektor (kallat P [acman]-KO 1.0) som kan användas som en målsökande vektor för slutar-out homolog rekombination 10,11. Att införliva ändar ut genmålinriktning teknik i systemet, har vi lagt två FRT och två I-SCEI webbplatser. Vi har även inkluderat en Gateway kassett inom denna modifierade vektor för att effektivisera processen för att införliva homologiarmarna i P [acman]-KO 1.0. Detta ger ett snabbt och enkelt sätt att införa praktiskt taget vilken genomisk region av intresse i den målsökande vektorn. I detta protokoll kommer vi att beskriva hur man kan konstruera en målsökande vektor med P [acman]-KO 1.0, och hur man kan utnyttja denna vektor in vivo för att rikta den endogena lokus. För detta protokoll kommer vi att använda RFP / Kan kassett för att ersätta en gen av intresse, men en mängd olika kassetter som innehåller ett antibiotikum selektionsmarkör kan användas med detta protokoll. Vi har designat och framgångsrikt använt en uppsättning kassetter förgenersättning och taggning 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Val av BAC och region till Target

  1. Att skaffa sig en BAC med genen av intresse (indiska) (här CG32095 används som exempel), sök efter CG32095 på www.flybase.org . Under avsnittet bestånden och reagenser, kontrollera avsnittet, "genomiska kloner" för BAC innehåller CG32095. Kontrollera att BAC omfattar minst 10 kb uppströms och 5 kb nedströms genen av intresse. Alternativt, kan kloner i P [acman] vektor 7 också hittas på http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. The BAC-kloner kommer i DH10B celler och P [acman] kloner kommer i EPI300 celler. De genomkloner måste omvandlas till SW102 celler, som kan bli föremål för recombineering. "Dirty minipreps" utförs (en Qiagen miniprep utan att använda en kolumn och utfällning av DNA med isopropanol) börjarfrån en 5 ml O / N-kulturen ympades med celler innehållande BAC. Efter resuspension av nyligen gjorda DNA pelleten i 20 pl dH 2 O, späd 1 pl till 100 pl dH 2 O och använd 1 pl att electroporate elektrokompetenta SW102. För att göra elektrokompetenta SW102 använder följande protokoll:
    1. Inokulera SW102 celler i 4 ml LB. Odla kulturen vid 32 ° CO / N skakning vid 250 rpm Viktigt:. SW102 celler ska aldrig utsättas för en temperatur högre än 32 ° C, såvida inte induktion av rekombination maskiner önskas.
    2. Inokulera 1 ml av den mättade SW102 kultur i 44 ml LB och växa på en 32 ° C skakare för att OD 600 mellan 0,2 till 0,3 (vanligen ca 1 till 1,5 h) ANMÄRKNING:. Andra recombineering protokoll rekommenderar växande kulturen i en mindre volym till OD 600 0,6 till 0,7, men växande bakterierna till en lägre densitet i en större volym signifikant ökar transformation efficieNCY 12. Dessutom reducerar denna modifiering väntetiden.
    3. Kyl kulturen i is-vatten slurry i 5 min Viktigt:. Under de följande stegen cellerna skall hållas vid låga temperaturer. Detta är avgörande för att uppnå god kvalitet elektrokompetenta celler.
    4. Centrifugera kultur vid 4 ° C vid 1500 x g under 10 min. Kassera supernatanten och tvätta pelleten i 25 ml kall (4 ° C) 10% glycerol 13. Först, (Pipettera INTE UPP OCH NED) återsuspendera cellerna i 5 ml genom att knacka och snurra röret i is-vatten slurry och sedan lägga resterande 10% glycerol (20 ml).
    5. Centrifugera vid 4 ° C vid 1500 x g under 10 min, kasta supernatanten och tvätta pelleten en andra gång med 25 ml iskall 10% glycerol.
    6. Centrifugera vid 4 ° C vid 1500 x g under 10 min, kasta supernatanten och tvätta pelleten en tredje gång med 25 ml iskall 10% glycerol.
    7. Centrifugera vid 4 ° C vid 1500 xg under 10 minuter och kassera supernatant. Cellpelleten kan vara mycket löst vid denna punkt och försiktighet bör iakttas när kasta supernatanten. Återsuspendera pelleten i 1 ml kall 10% glycerol. Överföra celler till ett 1,5 ml rör och centrifugera i 30 sekunder vid 12.000 xg i en bordsskiva mikrocentrifug vid 4 ° C. Släng de flesta av supernatanten lämnar ≈ 90 il glycerol / celler. Cellerna är nu redo att ska elektroporeras Anmärkning. Vid denna punkt celler kan förvaras vid -80 ° C för senare användning. Detta kan dock minska kompetens.
    8. Electroporate DNA in i celler med hjälp av en 1 mm kyvett vid 1800 V, 25 mF, 200 Ω. Efter elektroporering, tillsätt 300 | il av SOC och låta cellerna återhämta sig i 2 timmar vid 32 ° C (skakning krävs inte). Tavla celler på LB-agar plus 25 pg / ml kloramfenikol (eller andra lämpliga antibiotika beroende på den transformerade BAC eller PAC) och inkubera vid 32 ° C under 24 till 30 tim.
  4. Homologiarmar för riktad genmodifiering är designade av utvaldaing 10 kb av genomisk DNA uppströms och 5 kb nedströms i förhållande till de indiska myndigheterna. Välj 500 bp i slutet av 10 kb och 5 kb homologiarmar att förstärka (se avsnitt 2) (Figur 1). Dessa 500 bp fragment tjäna som homologiarmarna används för att återförena den genomiska regionen kring de indiska myndigheterna i P [acman] KO 1.0. Dessa fragment kallas vänster arm (LA) för regionen som motsvarar den uppströms 5 'homologiarmen och högra arm (RA) för regionen som motsvarar den nedströms 3'-homologiarmen Viktigt:. Homologiarmar bör inte innehålla BamHI restriktionsställen, som linjärisering av plasmiden (i steg 3.2) sker genom ett BamHI restriktionsdigerering.

2. Sätt homologiarmarna i P [acman]-KO 1.0

  1. Ställ in två individuella PCR-reaktioner, en för att förstärka LA och en annan för att förstärka RA. För LA, använder primers attB1-I-SCEI-LA-F och BamHI-LA-R och använda primers BamHI-RA-F och attB2-I-SCEI-RA-Rför amplifiering av RA (tabell 1). Använd 1 pl BAC DNA från steg 1,2 eller 0,5 pl kokt natten bakteriekultur innehållande BAC av intresse som en mall. Se till att använda en DNA-polymeras med korrekturläsning förmåga. Detta gäller alla efterföljande PCR-med undantag av PCR kontrollen i steg 2.8 och 3.13 OBS:. Förlängning tid för korrekturläsning DNA-polymeras kan skilja sig från vanliga Taq DNA-polymeras beroende på tillverkare. PfuUltra II Fusion hotstart, som polymeriserar vid en hastighet av 15 sek / kb, kan användas i dessa steg.
    LA / RA-PCR
    1 il DNA från smutsiga miniprep från steg 1.2 av Bac
    0,25 | il Varje 20 pM Primer
    2,5 | il 10X PfuUltra II Buffert
    0,75 | il 10 mM (vardera) dNTP
    0,5 | il PfuUltra II Fusion hotstart DNA Polymerase
    19,75 | il Vatten
    25 | il Total volym
    PCR-betingelser
    Steg 1 95 ° C 2 minuter för att aktivera enzymet
    Steg 2 95 ° C 20 sek denaturera
    Steg 3 60 ° C 20 sek glödgning
    Steg 4 72 ° C 20 sek förlängning
    Steg 5 Gå till steg 2 och upprepa 29 cykler
    Steg 6 4 ° C Håll
  2. Kör prov på en 1% agaros-gel och extrahera produkter med hjälp av en Zymoclean kit DNA återhämtning. Eluera DNA från Zymoclean kolonnen med 10 | il sterilt vatten.
  3. Utför skarvning genom överlappande förlängning (PCR SOE) med de två fragment med 10-30 ng totalt DNA från vardera förstärkt produkt renas på 2,2 (Figur 2). Detta är vanligtvis runt 1/20: e varje renad PCR-produkt:
    LA / RA-PCR-Soe
    0,5 il vardera LA och RA renade PCR-produkten cirka 10-30 ng
    0,25 il vardera 20 pM Primer
    2,5 | il 10X PfuUltra II Buffert
    0,75 | il 10 mM (vardera) dNTP
    0,5 | il PfuUltra II Fusion hotstart DNA Polymerase
    19,25 | il Vatten
    25 | il Total volym
    PCR-betingelser
    Steg 1 95 ° C 2 minuter för att aktivera enzymet
    Steg 2 95 ° C 20 sek denaturera
    Steg 3 55 ° C 20 sek glödgning (Lägre temp. Att tillåta vapen att glödga)
    Steg 4 72 ° C 20 sek förlängning
    Steg 5 Gå till steg 2 och upprepa en cykel
    Steg 6 95 ° C 20 sek denaturera
    Steg 7 60 ° C 20 sek glödgning
    Step8 72 ° C 20 sek förlängning
    Step9 Gå till steg 2 och upprepa 27 cykler
    Step10 4 ° C Håll
  4. Kör PCR-prov på en agarosgel och återvinna 1,0 kb-bandet genom gel extraktion. Detta är den attB1-LA-BamHI-RA-attB2 kassetten.
  5. Använd Gateway BP ClonaseII Enzyme kit att inrätta en BP-reaktion efter protokollet från tillverkaren.Kassetten genereras i 2.4 kommer att fungera som donator DNA och P [acman]-KO 1.0 som destination vektor.
  6. Späd 50 il TransforMax EPI300 elektrokompetenta celler genom att tillsätta 30 pl kall 10% glycerol eller kallt dH 2 O. Transform 1 ul av BP-reaktion in i elektrokompetenta celler enligt det protokoll som tillhandahålls av tillverkaren. Tillsatsen av vatten späder den relativt höga saltkoncentrationen i BP-reaktion för att förhindra elektrisk urladdning (överslag) under elektroporering. Electroporate DNA in i celler med hjälp av en 1 mm kyvett vid 1800 V, 25 mF, 200 Ω.
  7. Tillsätt 300 | il av SOC och låta cellerna återhämta sig i 1 h vid 37 ° C (skakning krävs inte). Tavla celler på LB-agar + 50 pg / ml Amp (P [acman]-KO 1.0 innehåller en gen Amp resistens). Inkubera plattorna vid 37 ° C under 18-24 timmar.
  8. PCR kontrollera enskilda kolonier genom konventionell koloni-PCR med T3 (T3 sekvens är nedströms Gateway kassetten i P [acman]-KO 1,0 (Figure 1) och attB1-I-SCEI-LA-F-primers. Positiva kloner kommer att visa ett band som körs vid 1,2 kb.
  9. Odla en över natten kultur av en positiv klon i LB med 50 | ig / ml ampicillin.
  10. Amplify P [acman]-KO 1,0 vektorn innehållande LA och RA i en 10 ml LB med 50 | ig / ml ampicillin odling med användning av lösning kopieringskontroll att följa tillverkarens protokoll (Epicentre).
  11. Utför en Qiagen miniprep enligt tillverkarens protokoll.

Tre. Rekombination av genomregion av intresse i P [acman]-KO 1.0

Dag 1

  1. Inokulera SW102 celler innehållande BAC av intresse i 4 ml LB plus 25 pg / ml kloramfenikol (Chl) eller lämpligt val antibiotika. Odla kulturen vid 32 ° CO / N skakning vid 250 rpm Viktigt:. Förutom under induktion i steg 3,5, bör SW102 celler inte utsättas för en temperatur högre än 32 ° C, så hög temperatur aktiverar rekombination maChinery av dessa celler.

Dag 2

  1. Digest 0,4 pg av P [acman]-KO-1.0 innehåller LA och RA armarna genererade i avsnitt 2 med ≈ 20 enheter BamHI i en 25 pl reaktion. Inkubera vid 37 ° C under minst 3 tim Viktigt:. Lång matsmältning är avgörande för att säkerställa nedbrytning av alla DNA. Detta kommer att minska antalet falska positiva kloner senare.
  2. Inokulera 1,0 ml av den mättade SW102/BAC kultur i 44 ml LB-Chl (25 | ig / ml) och växa på en 32 ° C skakare för att OD 600 mellan 0,2-0,3 (vanligen ca 1 till 1,5 h). Inkludera ett ytterligare identiskt prov för icke-HS kontroll. Detta prov kommer att behandlas precis som den experimentella en i varje enskild aspekt med undantag för HS. Denna icke-värme-chockade kulturen tjänar som en negativ kontroll. Utseendet på många kolonier på den icke-HS styrplattan (steg 3.13) tyder oftast transformation med osmält P [acman] KO 1,0 LA/ RA-plasmiden.
  3. Medan kulturen växer, kör BamHI-begränsade P [acman]-KO på en gel. Sedan gel-extrakt och eluera DNA i 10 l vatten värms upp till 55 ° C. OBS: Inte eluera DNA i någon buffert. Salter som är närvarande i bufferten kan orsaka elektrisk urladdning under elektroporering.
  4. Heat-shock kulturen vid 42 ° C under exakt 15 minuter i vattenbadet. Detta kommer att aktivera recombineering maskineri av SW102 celler. Värm inte chock kontroll kulturen.
  5. Omedelbart efter värmechock, överföra värme-chockad och icke-HS kulturer kontrollsystem för kylda 50 ml kanoniska rör och låt kulturer chill i ett is-vatten slurry i 5 min Viktigt:. Under de följande stegen cellerna skall hållas vid låga temperaturer . Detta är avgörande för att uppnå god kvalitet elektrokompetenta celler.
  6. Centrifugera kultur vid 1500 xg under 10 min. Kassera supernatanten och tvätta pelleten i 25 ml kall (4 ° C) 10% glycerol 13. Först,suspendera cellerna i 5 ml genom att knacka och snurra röret i is-vatten slurry (Pipettera ej UPP OCH NED) och tillsätt sedan resterande 10% glycerol (20 ml).
  7. Centrifugera vid 4 ° C vid 1500 x g under 10 min, kasta supernatanten och tvätta pelleten med 25 ml iskall 10% glycerol en andra gång.
  8. Centrifugera vid 4 ° C vid 1500 x g under 10 min, kasta supernatanten och tvätta pelleten med 25 ml iskall 10% glycerol en tredje gång.
  9. Centrifugera vid 4 ° C vid 1500 x g under 10 min och kassera supernatanten. Cellpelleten kan vara mycket löst vid denna punkt och försiktighet bör iakttas när kasta supernatanten. Återsuspendera pelleten i 1 ml kall 10% glycerol. Överföra celler till ett 1,5 ml rör och centrifugera i 30 sekunder vid 12.000 xg i en bordsskiva mikrocentrifug vid 4 ° C. Kassera mesta av supernatanten lämnar ≈ 90 ul vatten / celler OBS. Vid denna punkt celler kan förvaras vid -80 ° C för senare användning. Detta kan dock minska kompetens.
  10. Tillsätt 2 | il av BamHI-digererad P [acman] (sikta på 50 ng) till cellerna och blanda försiktigt med användning av en pipettspets. Överför celler till ett 1 mm elektroporeringskyvett och elektroporera vid 1800 V, 25 mF, 200 Ω.
  11. Tillsätt 300 | il av SOC och låta cellerna återhämta sig i 2 timmar vid 32 ° C (skakning krävs inte). Tavla celler på LB-agar plus 50 | ig / ml ampicillin och inkubera vid 32 ° C under 24 till 30 tim.

Dag 3

  1. Skärm för korrekt gap-reparation med koloni-PCR. Använd T3 och RA kolla primers för RA och T7 och LA check primer för LA (Tabell 1). Utforma PCR-Check-RA och PCR-Check-LA primers 100-200 bp mot riktade regionen (tabell 1). Positiva kolonier från PCR-reaktioner med hjälp av PCR-Check-RA med T3 eller PCR-Check-LA med T7 visar ett band som kör på 800-1000 bp (Figur 3) OBS:. Det är viktigt att testa båda armarna eftersom införlivandet av en armmen inte den andra är ibland observeras.
  2. Grow PCR-verifierade kolonier vid 32 ° C i 4 ml LB 50 ng / ml ampicillin for overnight. Gör en fryst lager av dessa celler för senare användning.

4. Byta genomregionen med inriktning Cassette

Dag 4

  1. Amplify RFP / KAN knockout kassetten genom PCR med användning pENTR-RFP/KAN (predigested med Ascl och Nhel för att linjärisera) som mall och den 5'HA-RFP / Kan-F och 3'HA-RFP / Kan-R-primrar ( Tabell 1). RFP / KAN kassetten kan begäras från referens 11.
  2. Gel rena PCR-produkten eluerades i 20 pl sterilt vatten. RFP-KAN kassett plus homologiarmar ska springa runt 3 kb.
  3. Inokulera 1 ml av den mättade SW102 / P [acman]-KO kultur (steg 3,13) i 44 ml LB-Amp (50 pg / ml) och växa på 32 ° C skakare för att OD 600 mellan 0,2-0,3. Inkludera ett ytterligare identiskt prov för icke-HS kontroll. Detta prov kommer att behandlas precissom den experimentella en i varje enskild aspekt med undantag för HS.
  4. Efter SW102 / P [acman]-KO kulturen når den önskade densiteten, följ steg från 3,5 till 3,10.
  5. Electroporate cirka 100 ng inriktning kassetten i 90 pl elektrokompetenta SW102 / P [acman]-KO-celler. Överför celler till ett 1 mm elektroporeringskyvett och elektroporera vid 1800 V, 25 mF, 200 Ω. Tillsätt 300 ul av SOC och låta cellerna att återhämta sig under 2 timmar vid 32 ° C (skaka inte krävs) OBS:. Det rekommenderas att använda en ny gelrenade kassett.
  6. Plate celler i LB-agar + Amp (50 | ig / ml) + Kan (50 | ig / ml) och inkubera under 24-30 timmar vid 32 ° C.

Dag 5

  1. Odla 5 ml av kultur från 5 olika kolonier vid 32 ° CO / N.

Dag 6

  1. Utför en "smutsig miniprep" och kör hälften av den erhållna DNA på en 1% agarosgel för att leta efter presence av en låg-molekylvikt-plasmid. Det borde inte vara någon plasmid som körs bälg 12 kb. (Figur 4)
  2. Gör en 1:500 utspädning av DNA från en positiv klon och använd 1 pl att electroporate i 50 pl TransforMax EPI300 Viktigt:. Kontrollera att späda DNA för att förhindra elektroporering av flera plasmider i en cell. Plate celler i LB-agar + Amp (50 | ig / ml) + Kan (50 | ig / ml) och inkubera under 18-24 timmar vid 37 ° C

Dag 7

  1. Inokulera en enda koloni i 10 ml LB + och växa O / N.

Dag 8

  1. Seed 100 ml LB-medium med mättad kultur från steg 4,10. Lägg lämpliga antibiotika plus 100 | il av 1000 X kopieringskontroll lösning och inkubera vid 37 ° C under 5-6 timmar.
  2. Utför en maxiprep och verifiera införandet av kassetten i det korrekta stället genom sekvensering.
  3. Utöver sekvensering, utföra en begränsning enzyme digerering testet med DNA från en klon som inte innehöll någon låg molekylvikt plasmiden och dess föräldra-DNA. Den begränsning utvalda enzymer kommer att vara olika för varje gen, men målet är att hitta en grupp av enzymer som gör att utredaren att karakterisera recombineered vektor. Som exempel, var CG32095 målsökningsvektom seriellt ned med PacI, Ascl, BamHI och Aatll. Utseendet på alla förutspådde band och avsaknad av felaktiga band bekräftar att målsökningsvektom korrekt har recombineered (Figur 5).

Fem. Injektion Flugor och mobilisera Kassett In Vivo

  1. Injicera mha ΦC31 integras, in i en fördefinierad landningsplats av valet. Externa leverantörer, såsom Rainbow Transgenics ( http://www.rainbowgene.com ), kan användas för injektion tjänster Viktigt:. DNA måste vara nytagna prepared före injektion. Högre transformationseffektivitet observeras när DNA framställs på plats och injiceras samma dag.
  2. Att mobilisera kassetten från landningsplatsen, använd Bloomington lager nummer 25680 eller 25679. Dessa lager innehåller Flippase och jag-SCEI nedströms en värmechock promotor, på kromosom två och tre, respektive. Dessutom innehåller de en hs-hid transgenen på balanseraren kromosomen och på Y-kromosomen. Samla hanar från den valda lager och över till jungfruliga honor bär KO kassetten i landningsplatsen. . Set ~ 30 korsningar och tillåter honor att lägga ägg i 2-3 dagar OBS: Det rekommenderas att välja det lager som ligger på en annan kromosom från den riktade lokus.
  3. Flip föräldrar till en ny uppsättning av 30 injektionsflaskor och värmechock larver vid 37 ° C under en timme, två gånger om dagen, tre dagar i rad. Värmen chocker aktivera produktionen av enzymerna, flippas och I-SCEI, och celldöd genen gömde
  4. Samla jungfruliga hondjur från F1 avkomman av värme-chockade flugor, och över till y - w - män. Sikta på 150-200 kors, tre jungfrur och tre hanar per kors.
  5. Sikta de F2 avkomma under ett fluorescerande räckvidd som möjliggör detektion av RFP i ögat. Skärm för RFP positiva ögon som är mutant för de vita och gula gener (y - w -). Denna screening process väljer positivt för förekomst av RFP kassetten och väljer för frånvaron av P [acman] vektor (mini-vit) och landningsplats, som präglas av vild-typ gul gen OBS. Det är mindre tid -consuming att screena för RFP i ögat, än att första skärm för yw flugor. De mobilisering händelser är mycket effektiva under värme chocker, vilket resulterar i många färre flugor innehållande RFP i ögat, jämfört med y - w - flugor.
  6. Inrätta enda par parningar med varje y - w - RFP + fluga, eftersom varje mobilisering händelse kan vara olika. Karta RFP till rätt kromosom. Korrekt kromosom Riktad typiskt observeras i> 95% av fallen.
  7. Upprätta bestånden och kontrollera korrekt inriktning händelser med standardmetoder för Southern blot-analys. Designa en 2 kb prob uppströms (vänster arm) och nedströms (höger arm) i den gen som målinriktad, och 2 kb (eller kortare om det är nödvändigt) spänner över raderade ORF. De första två sönder kommer att ge ett band på homozygota och heterozygota knockouts, som inte är närvarande i vildtyp, medan ORF inte kommer att ge ett band i homozygot knockout. En snabb PCR feller ORF är också möjligt, men detta bygger på frånvaron av ett band.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Förstärkning av LA och RA homologiarmar ska producera 500 bp produkter och PCR-SOE reaktion bör ge en 1,0 kb produkten (avsnitten 2.1-2.4, Figur 2). BP reaktionen i avsnitt 2.5 är normalt mycket effektiv och bakteriell omvandling av produktutbytena 5-100 kolonier i genomsnitt. Nästan alla kolonier testades med PCR kolla visar den förväntade PCR-produkten.

Under den första omgången av recombineering (avsnitt 3) räkna med att få 20-40 kolonier efter omvandlingen av det rötade P [acman]-KO-1.0 innehåller LA och RA armarna i SW102 celler. 40-60% av dessa kloner kommer att bära den önskade rekombinationsprodukten. Den icke-heat shock kontroll bör innehålla väldigt få om några kolonier jämfört med värme-chockade celler. Utseendet på samma antal kolonier på både provet och kontrollplattor tyder vanligen förekomst av oskuren plasmid eller någon annan förorening. I detta fall, experimentet should kasseras och upprepas, denna gång smälta P [acman]-KO-1.0 bär LA och RA vapen till färdigställande enligt instruktionerna som beskrivs i steg 3.2. Ett exempel på en PCR-kontroll för hämtning av genomisk region av intresse in i P [acman]-KO 1,0 där ≈ 60 kolonier erhölls visas i figur 3. Här 60% av kolonierna testades genomfördes önskad rekombination product.Care måste tas till att de observerade PCR-produkter körs på den förutsagda storleken, eftersom avvikande PCR band brukar indikera felaktiga recombineering händelser.

Ibland inga kolonier kommer att växa efter den första omgången av recombineering. Använda celler med suboptimal effektivitet utgör den vanligaste orsaken till en misslyckad recombineering reaktion. Hålla cellerna kallt vid alla tidpunkter under sin framställning och varsam hantering under de tvättar (ALDRIG virvel) är kritisk för att erhålla högkvalitativa kompetenta celler. Försök att alltid använda färska smält / renat P [acman]-KO-1.0 DNA för att uppnå högsta verkningsgrad.

Ibland den första omgången av recombineering avkastning kolonierna men dessa kolonier inte klarar PCR check-analysen. Detta tyder oftast felaktiga recombineering produkter men ett sådant resultat kan också indikera potentiella problem med en av primeruppsättningarna. För att validera PCR-Check-LA primer, inrätta en PCR-reaktion i kombination med attB1-I-SCEI-LA-F. För att verifiera PCR-kontroll-RA inrättat en PCR-reaktion med attB2-I-SCEI-RA-R. I båda fallen använda den ursprungliga BAC som en mall. Dessa PCR-reaktioner bör ge produkter av förväntad storlek, vilket kommer att variera beroende på sekvensen av kontrollen primers. Positiva resultat från denna kontroll experiment kommer att utesluta möjligheten att en oförmåga att upptäcka positiva kloner beror på primer ineffektivitet.

Om du har provat den första omgången av recombineering flera gånger följa ovanstående protokoll utan någon framgång och har utfört allaföreslog kontroller, rekommenderar vi att välja ett par nya 500 bp homologiarmar. Av skäl som inte är klart i dagsläget, vissa genomiska regioner är mycket motståndskraftiga mot DNA-rekombination. Helt enkelt utforma nya homologiarmar och flytta dem mot eller bort från den intressanta genen ibland löser dessa problem.

Den andra omgången av recombineering (avsnitt 4) är typiskt mycket effektivare. Normalt 30-50 kolonier observerades efter transformation, med 90-95% av dessa innehåller den önskade konstruktionen. Det vanligaste problemet i detta steg är att få falskt positiva kolonier. Figur 4 visar exempel på sant och falskt positiva kloner efter andra omgången av recombineering (avsnitt 4).

Figur 1
Figur 1. Schematisk av process att generera en P [acman]-KO 1,0 målsökande vektor. Modifierad från Chan et al. (2012). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Schematisk av skarvning genom överlappande PCR (PCR SOE) utförs på steg 2.3. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. PCR-check gel som visar effektiviteten av första recombineering händelsen Varje bana representerar en enda koloni A:.. Kolonier testas för vänster arm. integration med T7 och LA-kontroll primers B: Samma kolonier som A, testade för höger arm integration med T3 och RA-check primers.1kb Plus DNA Ladder användes som molekylviktsmarkör OBS:. på grund av dålig priming av T3 primer förhållande till T7, var banden i höger arm kontrollen betydligt mörkare. Detta bör beaktas när man tittar på gelén.

Figur 4
Figur 4. DNA agarosgel som visar hög molekylvikt plasmider (P [acman]) och lågmolekylära plasmiden (osmält mall) isolerad från potentiellt positiva kloner efter andra omgången av recombineering. DNA isolerades från 4 potentiella positiva kloner och körde på en 1% agarosgel färgad med etidiumbromid. Kloner 1,3 och 4 är sanna positiva kloner. Klon 2 är ett falskt positivt som noterats av alla de former av ap lasmid som körs bälg 12 kb (den största storleken bandet i DNA stege lane). 1 kb Plus DNA Ladder användes som molekylviktsmarkör.

Figur 5
Figur 5. Test för önskad rekombinationshändelse genom restriktionsenzym-digerering. I exemplet ovan visas en dator-förutspådde bandmönster av P [acman]-KO CG32095 före och efter den andra rundan av recombineering. Fyra olika enzymer användes: PacI, Ascl, Aatll och BamHI. Korrekt rekombinerad produkt kommer att ha samma band som sin föräldraledighet P [acman]-KO CG32095 undantag för den avsedda ändringen (pilspetsar). NEBcutter V2.0 användes för att förutsäga bandmönstret.

0346/50346fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50346/50346fig6.jpg "/>
Figur 6. Schematisk beskriver mobilisering av en målsökande kassett in vivo. Klicka här för att visa en större bild .

Tabell 1
Tabell 1. Primers. Klicka här för att se större tabell .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kraften av genetiska modellorganismer inom biomedicinsk forskning i stor utsträckning bygger på de verktyg som finns för genetisk manipulation. De små modellerna C. elegans och Drosophila framför allt möjliggöra billiga och snabba molekylärgenetiska analyser av kompletta banor och familjer gen inblandad i flercellulär utveckling eller funktion. De senaste åren har sett betydande framsteg i utvecklingen av verktyg för att manipulera gener i Drosophila 14,15. Till exempel var recombineering, som ofta används i mus genetik att manipulera Bac DNA-konstruktioner, som nyligen anpassad för Drosophila, genom användning av P [acman] vektor och ΦC31-medierad transgenes 6. Olika val kassetter möjliggöra införande eller borttagande av specifika sekvenser som helst inom en konstruktion med rekombinationsexperiment kompetenta bakterier 4,13. Vi har ändrat det ursprungliga P [acman] vektor så att den kan användas för att konstruera Drosophila. Denna nya vektor möjliggör en att generera riktade kassetter med större homologiarmar än de som lätt kan göras med hjälp av klipp och klistra metoder kloning. Vidare har en Gateway-kloning kassett också införlivats i denna vektor, tillåter en att snabbt och effektivt införa ny genomisk DNA i systemet.

Även om de flesta av de metoder som beskrivs här är enkel, det finns flera steg som vi har funnit kritisk för framgången av tekniken. På grund av storleken av den manipulerade DNA (> 15 kb), utgör den första omgången av recombineering reaktion (avsnitt 3) ett betydande tekniskt hinder. Därför kräver denna omgång av recombineering en mycket effektiv rekombination protokoll. Synes små protokoll justeringar, som att odla cellerna till lägre densitet, tvätta cellerna tre gånger istället för två och med 10% glycerol i stället för dH 2 </ Sub> O 13, har förbättrats avsevärt transformationseffektiviteten av våra recombineering kompetenta celler. Dessutom, var noga med att kontrollera att LA / RA med P [acman] skärs till fullbordande med BamHI (Steg 3.1) eliminerar många falska positiva.

Oönskade rekombinationshändelser representerar en annan ganska vanligt problem under recombineering. Till exempel har vi observerat fall av dubbelarbete och flyttningar inom olika konstruktioner. Dessa händelser kan leda till flera problem under Drosophila omvandling och in vivo riktad genmodifiering. PCR-kontroll och sekvensering analys kan inte upptäcka alla dessa händelser. Därför måste en restriktionsenzymanalys utföras på den klonade slutprodukten före injektion av DNA i embryon. Denna sista kontrollen har visat kritisk och har tillåtit oss att undvika att injicera konstruktioner som innehåller oönskade avvikelser.

Maxi-prepping målsökningsvektom strax före injektion och aldrig frysning DNA förbättrar avsevärt transformationseffektiviteten av dessa stora konstruktioner i Drosophila. Kort sagt, små detaljer gör stor skillnad i framgången för dessa tekniker. De protokoll som beskrivs och demonstreras här representerar insikter från en rad olika källor och vår egen erfarenhet.

Medan vi hoppas det protokoll som presenteras här hjälper andra att anta recombineering metoder i sina egna laboratorier, tror vi ytterligare förbättringar och förbättringar av metodiken är fortfarande möjligt. Ibland specifika genomiska fragment är svåra att manipulera med recombineering av skäl som inte är helt uppenbara. Dessutom, trots våra bästa ansträngningar för att eliminera oönskad bakgrund, finner vi fortfarande att vissa delar av genomisk DNA tenderar att producera felaktigt recombineered slutprodukter. En djupare förståelse av recombineering processen kan ge mer optimala protokollen i framtiden och öppen diskussion omrecombineering misslyckanden och framgångar kommer att främja en framgångsrik användning av dessa kraftfulla tekniker med bredare forskarsamhället.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande intressen i fråga om att de tekniker som beskrivs här.

Acknowledgments

Vi vill tacka Hugo Bellen och Bloomington Stock Centrum för reagenser. Vi tackar ytterligare Koen Venken, Hugo Bellen och alla medlemmar i Buszczak och Hiesinger labb för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of Health i ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) och MB (RO1GM086647), ett bidrag från Cancer Prevention Research Institute of Texas till MB och PRH (RP100516), och Welch Foundation (I-1657) till PRH. MB är en EE och Greer Garson Fogelson Scholar i biomedicinsk forskning och PRH är en Eugene McDermott Scholar i biomedicinsk forskning vid UT Southwestern Medical Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Tags

Genetik 77 bioteknik molekylärbiologi Medicinsk teknik fysiologi, Genetik (djur och växter) Recombineering, Homolog rekombination Knock-out rekombination genteknik Riktad genmodifiering gen gener DNA PCR Primers sekvensering djurmodell
Recombineering homolog rekombination Konstruktionerna i<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter