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Immunology and Infection

संक्रमण को रोकने के लिए एक नई दृष्टिकोण के रूप में पीआरपी: तैयारी और doi: 10.3791/50351 Published: April 9, 2013

Summary

प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमण एक महत्वपूर्ण नैदानिक ​​जटिलता है. इस अध्ययन के एक प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा (पीआरपी) का उपयोग प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमण को रोकने के दृष्टिकोण का वर्णन, निरंतर प्लेटलेट एकाग्रता के साथ पीआरपी की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, और पीआरपी के नव पहचान रोगाणुरोधी संपत्तियों और ऐसे रोगाणुरोधी संपत्तियों की जांच के लिए संबंधित प्रोटोकॉल की रिपोर्ट

Introduction

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प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमण एक महत्वपूर्ण नैदानिक ​​जटिलता Staphylococcus aureus (एस aureus) एक सबसे आम सूक्ष्मजीवों के प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमण से अलग है. यह एक biofilm कि प्रत्यारोपण के सतहों को शामिल किया गया है और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी संक्रमण 1,2 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं का निर्माण करने में सक्षम है. प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमण के उपचार अक्सर दोहराया debridements और लंबे समय तक parenteral एंटीबायोटिक चिकित्सा के लिए लंबे समय तक अस्पताल में भर्ती की आवश्यकता है. एंटीबायोटिक प्रतिरोधी मामलों में प्रत्यारोपण के हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है. बैक्टीरिया की बढ़ती एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध के रूप में रोग नियंत्रण और रोकथाम (सीडीसी) के लिए केंद्र द्वारा किया गया है के लिए भेजा "दुनिया के सबसे अहम स्वास्थ्य समस्याओं में से एक है." समय में, नए और प्रभावी antimicrobial उपचार के विकास के बिना, यह संभव है कि बहु - दवा प्रतिरोधी रोगज़नक़ों पारंपरिक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ untreatable होगा. प्रत्यारोपण की रोकथाम से जुड़ेसंक्रमण इसलिए महत्वपूर्ण है और इस तरह के संक्रमण को रोकने के लिए उपन्यास रोगनिरोधी एजेंट या दृष्टिकोण की जरूरत है.

प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा (पीआरपी) ऑटोलॉगस रक्त है कि 30 से अधिक वृद्धि कारक है जो हड्डी और हड्डी का ग्राफ़्ट 3-5 चिकित्सा के साथ मदद कर सकते हैं एक एकाग्रता है. हड्डी पुनर्जनन और कोमल ऊतकों परिपक्वता बढ़ाने के लिए पीआरपी का आवेदन करने के लिए तेजी से किया गया है विभिन्न विकास प्लेटलेट्स द्वारा जारी कारकों के उच्च एकाग्रता की वजह से क्लीनिक में सूचना दी.

पीआरपी के कई विशेषताओं से संकेत मिलता है कि पीआरपी भी गुण रोगाणुरोधी 6-9 हो सकता है. पीआरपी प्लेटलेट्स की एक बड़ी संख्या है, leukocytes (जो बैक्टीरिया और कवक के खिलाफ मेजबान बचाव कार्यों के अधिकारी हो सकते हैं) के एक उच्च एकाग्रता, और कई रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स 7,8,10 शामिल हैं. हृदय शल्य चिकित्सा के रोगियों की एक बड़ी काउहोट के हाल के एक अध्ययन में यह पता चला था कि पीआरपी जेल के घाव बंद signif दौरान intraoperative उपयोगicantly सतही और गहरे उरोस्थि 11 संक्रमण की घटनाओं में कमी आई है. इन कारणों से और टिप्पणियों के लिए, हम धारणा है कि पीआरपी, इसकी अच्छी तरह से अध्ययन चिकित्सा को बढ़ावा देने के गुण के अलावा, रोगाणुरोधी गुण है. पीआरपी का उपयोग करने के लिए संक्रमण को रोकने के संभावित लाभ में शामिल हैं: (i) पीआरपी कम पारंपरिक एंटीबायोटिक उपचार के लिए तुलना करने के लिए प्रतिरोध पैदा होने की संभावना है. पीआरपी के उपचार को बढ़ावा देने के गुण एक मुहर प्रदान बैक्टीरियल लगाव को रोकने के लिए इस तरह के संक्रमण के लिए बाधाओं को कम करने के रूप में रोगज़नक़ों और मानव कोशिकाओं के प्रत्यारोपण 12 सतहों के लिए दौड़ रहे हैं, (ii) पीआरपी भी गुण है कि जो संक्रमण की रोकथाम पर एक synergistic प्रभाव हो सकता है चिकित्सा को बढ़ावा देने के 13. (Iii) पीआरपी स्वाभाविक biocompatible, और सुरक्षित और संक्रामक रोगों के खतरे से मुक्त है.

हमारा लक्ष्य लंबी अवधि के लिए एक नया दृष्टिकोण के रूप में पीआरपी का उपयोग करने के लिए रोकने के प्रत्यारोपण से जुड़े infections. इस अध्ययन का उद्देश्य पीआरपी तैयार एक दो बार centrifugation दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, इन विट्रो रोगाणुरोधी संपत्तियों में पीआरपी की जांच, और ऐसे रोगाणुरोधी संपत्तियों के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए किया गया था.

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Protocol

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1. तैयारी और पीआरपी के सक्रियकरण

1.1 खून आकर्षित

  1. Isoflurane के साँस लेना (शामिल करने के लिए 2% 2 हे और रखरखाव के लिए 1%) खरगोश anesthetize.
  2. एक 20 मिलीलीटर सिरिंज में 2 मिलीलीटर .129 एम त्रिकोणीय सोडियम साइट्रेट (एक anticoagulent समाधान) ड्रा. त्रिकोणीय सोडियम साइट्रेट समाधान 50 मिलीलीटर आसुत एच 2 हे में 1.897 छ त्रिकोणीय सोडियम साइट्रेट भंग और एक 0.22 सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर के साथ फ़िल्टरिंग द्वारा तैयार किया जाता है.
  3. खरगोश कान का उपयोग कर 70% इथेनॉल जीवाणुरहित.
  4. खून आकर्षित (जैसे 5 मिलीग्राम) के माध्यम से खरगोश कान नस से एक तितली (25 जी) सुई सिरिंज जुड़े.
  5. कोमल आंदोलन द्वारा त्रिकोणीय सोडियम साइट्रेट समाधान के साथ रक्त मिश्रण. रक्त और त्रिकोणीय सोडियम साइट्रेट समाधान की मात्रा का अनुपात 09:01 है.

1.2 पीआरपी तैयारी (1 चित्रा)

  1. एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब anticoagulated रक्त स्थानांतरण. 10 μl की अशेष भाजक रखनारक्त आधारभूत प्लेटलेट hemocytometry गिनती का उपयोग कर का निर्धारण.
  2. 300 XG स्विंग बाहर एक रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए (आर टी) रक्त अपकेंद्रित्र. त्वरण और ब्रेक वेग कम करने के लिए (1 चित्रा) सेट.
  3. Centrifugation के बाद रक्त तीन परतों में अलग है. नीचे की परत में मुख्य रूप से लाल रक्त कोशिकाओं है, मध्यम परत (सामान्यतः "buffy कोट" के रूप में जाना जाता है) केंद्रित प्लेटलेट्स और leukocytes का बना है, और ऊपर परत मुख्य रूप से प्लाज्मा, जो रक्त के तरल घटक है और प्लेटलेट्स ( चित्रा 1). ध्यान से एक सेल संस्कृति हुड अपकेंद्रित्र ट्यूब परिवहन, परतों परेशान नहीं है. एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब का उपयोग कर एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक pipettor में प्लाज्मा के सभी, buffy कोट, और 2-3 मिमी मोटी लाल रक्त कोशिका परत स्थानांतरण.
  4. हस्तांतरित नमूना आरटी पर 15 मिनट के लिए 3000 XG पर एक दूसरी बार अपकेंद्रित्र. शीर्ष परत (तैरनेवाला) प्लेटलेट गरीब (पीपीपी) प्लाज्मा एक माना जाता हैएक नया ट्यूब को सौंप दिया है.
  5. शेष रक्त के नमूने में प्लेटलेट एकाग्रता समायोजन पीपीपी 2.0 10 6 प्लेटलेट्स एक्स / μl (hemocytometry द्वारा निर्धारित) प्राप्त करने के लिए उपयोग कर पीआरपी प्राप्त करते हैं.

1.3 पीआरपी सक्रियण

  1. 1000 IU / मिलीलीटर के काम एकाग्रता के लिए 5 मिलीग्राम 10% कैल्शियम क्लोराइड के साथ 5000 आइयू गोजातीय थ्रोम्बिन भंग पीआरपी सक्रियण समाधान तैयार.
  2. पीआरपी और पीपीपी सक्रियण समाधान जोड़ें, और बार - बार और पीआरपी पीपीपी जैल फार्म pipetting द्वारा समाधान मिश्रण. सक्रियण पीआरपी या पीपीपी के लिए समाधान की मात्रा का अनुपात 01:04 है.

2 इन विट्रो पीआरपी Kill वक्र परख का उपयोग रोगाणुरोधी टेस्ट (2 चित्रा)

  1. एक बाँझ inoculating पाश का प्रयोग, एस के कई कालोनियों को जोड़ने अपने रातोंरात प्लेट संस्कृति से एक प्लास्टिक की ट्यूब में 5 म्यूएलर Hinton शोरबा (MHB) मिलीलीटर में aureus. भंवर संक्षेप में और फिर 37 पर 2 घंटे के लिए नमूना सेते हैं डिग्री सेल्सियस अगला, बैक्टीरियल मीडिया के ऑप्टिकल घनत्व एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग निर्धारित किया गया था और एक ऑप्टिकल ~ 1 के बराबर घनत्व को समायोजित 10 x 8 CFU / मिलीलीटर पूर्व निर्धारित मानक वक्र पर आधारित है.
  2. एक 100x पीबीएस का उपयोग करने के लिए 1 10 6 CFU / एमएल x प्राप्त करने और बर्फ पर inoculums जगह कमजोर पड़ने बनाओ.
  3. सेट अप और बाँझ, डिस्पोजेबल 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूबों लेबल, और निम्न नमूना के रूप में प्रत्येक ट्यूब में 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए 1 तालिका में संकेत दिया समूहों को तैयार.
  4. पीआरपी, पीपीपी, या पीबीएस polystyrene ट्यूबों के लिए 1, सक्रियण (जेल गठन) के लिए थ्रोम्बिन समाधान द्वारा पीछा जोड़ें. अगला, MHB जोड़ने और फिर एस. aureus inoculums (1 x 10 6 CFU / एमएल) 1 x 10 5 CFU / एमएल के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए.
  5. 37 डिग्री के साथ सी 150 rpm पर कक्षीय आंदोलन ट्यूबों सेते हैं.
  6. पूर्व निर्धारित समय अंक (0 उदाहरण के लिए, 1, और 2 घंटे), प्रत्येक ट्यूब में दोहराने (pipetting इस के माध्यम से समाधान मिश्रणमहत्वपूर्ण कदम है क्योंकि बैक्टीरिया पीआरपी जेल के अंदर फंस जा सकता है). नमूने के 10 μl लो, serially बाँझ 0.9% खारा के साथ कमजोर और एक Tryptic सोया (TSA, 5% भेड़ रक्त के साथ) अगर CFU गिनती के लिए थाली पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के एक 100 μl अशेष भाजक विंदुक.
  7. संस्कृति अगर 37 पर रातोंरात प्लेटें डिग्री सेल्सियस, तो गिनती और प्लेट कालोनियों रिकॉर्ड. X-अक्ष और CFU / y-अक्ष पर मिलीलीटर समय (एचआर) के साथ एक logarithimic पैमाने पर प्लॉट डेटा.

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Representative Results

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पीआरपी reproducibly एक दो बार centrifugation दृष्टिकोण (चित्रा 1) का उपयोग कर तैयार किया जाता है. पीआरपी को मजबूत वर्तमान (अप करने के लिए 100 गुना CFUs में कमी) Methicillin प्रतिरोधी एस के खिलाफ इन विट्रो रोगाणुरोधी संपत्तियों में पाया जाता है (MRSA) aureus (3 चित्रा) है, जो आमतौर पर दुनिया भर में अस्पतालों में 14 में पाया जाता है. इसी तरह, पीआरपी मेथिसिलिन संवेदनशील एस के खिलाफ मजबूत रोगाणुरोधी संपत्तियों (MSSA) aureus, समूह ए स्ट्रैपटोकोकस, और नेइसेरिया gonorrhoeae.

दो बार centrifugation दृष्टिकोण एक ही प्लेटलेट (यानी 2.0 10 x 6 प्लेटलेट्स μl /) एकाग्रता लेकिन साथ पीआरपी के अधिग्रहण की अनुमति देता है केंद्रित (~ 10 बार रक्त में आधारभूत से ऊपर, चित्रा 4) और हमें लगातार रोगाणुरोधी निष्कर्ष प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, कोई महत्वपूर्ण मतभेद अलग अलग जानवरों से Prps (यानी के बीच CFU निष्कर्ष में) खरगोश देखा गया है.

समूह पीआरपी / / पीपीपी पीबीएस MHB MRSA inoculum
नियंत्रण कोई नहीं 1800 μl 200 μl
नियंत्रण कोई नहीं 2000 μl कोई नहीं
नियंत्रण पीबीएस + थ्रोम्बिन (200 μl) 1600 μl 200 μl
पीपीपी पीपीपी + थ्रोम्बिन (200 μl) 1600 μl 200 μl
पीआरपी पीआरपी + थ्रोम्बिन (200 μl) 1600 μl 200 μl

तालिका 1. पीआरपी के रोगाणुरोधी मूल्यांकन के लिए प्रायोगिक नमूने हैं.


चित्रा 1. पीआरपी तैयारी एक दो बार centrifugation प्रक्रिया (ए) प्रथम centrifugation का उपयोग कर. 1 centrifugation के बाद तीन परतों का गठन कर रहे हैं, और शीर्ष दो परतों (यानी प्लाज्मा और buffy कोट परतों) और नीचे की परत (यानी लाल रक्त कोशिका परत) के 2-3 मिमी एक दूसरे बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. (बी) द्वितीय centrifugation. 2 centrifugation के बाद, ऊपर परत एक नया बाँझ ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर रहा है और पीपीपी के रूप में नामित है. पीपीपी के साथ शेष 2.0 10 6 प्लेटलेट्स μl / एक्स के एक प्लेटलेट एकाग्रता के लिए निकाला जाता है और पीआरपी के रूप में नामित है.

चित्रा 2
चित्रा 2. रोगाणुरोधी propertie का आकलन करने के लिए सेट अप प्रायोगिकपीआरपी को मारने के वक्र परख का उपयोग, पीआरपी या पीपीपी परीक्षण नलियों को जोड़ा जाता है, और तुरंत थ्रोम्बिन समाधान के साथ सक्रिय है. अगला, MHB जोड़ा जाता है बैक्टीरियल inoculums द्वारा पीछा किया. नमूने की aliquots अलग अलग समय बिंदुओं पर लिया जाता है और CFU गिनती के लिए चढ़ाया.

चित्रा 3
चित्रा 3. पीआरपी, पीपीपी, या पीबीएस थ्रोम्बिन, MHB शोरबा, और MRSA inoculum के साथ एक बाँझ 5 मिलीग्राम polystyrene ट्यूब में रखा जाता है और फिर incubated 37 पर पूर्व निर्धारित समय के अंक में (यानी 1 और 2 ° C 150 rpm पर कक्षीय आंदोलन के साथ है. ) घंटा, नमूने की aliquots ले लिया है और CFU गिनती के लिए चढ़ाया. (ए) CFU डेटा और (बी) 10 -2 कमजोर पड़ने पर प्रतिनिधि थाली छवियों. MRSA विकास की महत्वपूर्ण कमी (~ 2 घंटे में 100 गुना) प्राप्त है usinछ पीआरपी पीपीपी और PBS नियंत्रण की तुलना में. यह MSSA, समूह ए स्ट्रैपटोकोकस, और नेइसेरिया gonorrhoeae के रूप में अच्छी तरह से जैसे बैक्टीरिया के लिए सच है.

चित्रा 4
चित्रा 4. पूरे रक्त का रक्त स्मीयरों (बाएं) और पीआरपी (दाएं) पीआरपी दो बार centrifugation दृष्टिकोण से तैयार ~ 10 बार पूरे रक्त की तुलना में प्लेटलेट्स की संख्या है.

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Discussion

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प्लेटलेट संपन्न प्लाज्मा तेजी से किया गया है नैदानिक ​​अपनी चिकित्सा को बढ़ावा देने के 15-17 गुण के कारण अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है. वर्तमान अध्ययन में, पीआरपी संक्रमण की रोकथाम के लिए एक नया दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तुत किया गया था. पीआरपी MRSA, MSSA, समूह ए स्ट्रैपटोकोकस और नेइसेरिया gonorrhoeae के खिलाफ मजबूत रोगाणुरोधी गुण है पाया गया था. पीआरपी का प्रमुख लाभ पारंपरिक एंटीबायोटिक उपचार की तुलना में, संक्रमण की रोकथाम के लिए शामिल हैं: (1) तेजी से की सूचना दी एंटीबायोटिक प्रतिरोध 14,18-20 सहित वर्तमान एंटीबायोटिक उपचार की चुनौतियों का सामना कर रहे हैं. पीआरपी एक उन्नत विकल्प हो सकता है क्योंकि (i) के पीआरपी प्लेटलेट microbicidal प्रोटीन neutrophils, monocytes और टी कोशिकाओं जो रोगज़नक़ 21 आक्रमण के खिलाफ की रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका खेलते हैं जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए chemotactic गुण के अधिकारी हो सकता है, सकता है और (ii) पारंपरिक एंटीबायोटिक दवाओं की तुलना में, प्लेटलेट microbicidal प्रोटीन कम मैं प्रवण हैंबैक्टीरियल झिल्ली संरचनाओं 22 बदलने में कठिनाई के कारण बैक्टीरिया प्रतिरोध nducing. (2) पीआरपी न केवल संक्रमण को कम कर देता है, लेकिन यह भी घाव भरने को बढ़ावा देता है, आघात, समय और पैसे की दृष्टि से दोनों में महंगी हैं.

पीआरपी हाल ही में वृद्धि हुई ब्याज आकर्षित किया है. हालांकि, वहाँ प्लेटलेट्स की संख्या शुरू, anticoagulants के उपयोग, leukocytes के शामिल किए जाने, और 23-27 activators के उपयोग सहित पीआरपी तैयारी प्रोटोकॉल के बीच कई जटिल बदलाव कर रहे हैं. पीआरपी तैयारी में भिन्नता दोनों जानवर और नैदानिक ​​28 अध्ययनों में विवादास्पद परिणामों के भाग में योगदान देता है. नतीजतन, पीआरपी के अध्ययन के लिए एक बड़ा मुद्दा भिन्नता को नियंत्रित करने के लिए है. वर्तमान अध्ययन में, एक दो बार centrifugation दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया गया था और पीआरपी के प्लेटलेट एकाग्रता 2 10 x 6 प्लेटलेट्स / μl (~ 10 बार रक्त में आधारभूत से ऊपर) में तय किया गया था पीआरपी तैयारी प्रोटोकॉल मानकीकरण और परिवर्तनशीलता की सीमापीआरपी तैयारी में. दो बार centrifugation दृष्टिकोण प्रस्तुत सरल है, पीआरपी के अन्य जानवरों और मनुष्य के रक्त से अलगाव के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है, और इन विट्रो वर्तमान अध्ययन में खरगोश पीआरपी के रोगाणुरोधी संपत्तियों में लगातार करने के लिए नेतृत्व. हालांकि, विकास कारकों भीतर या प्लेटलेट्स से रिहा व्यक्ति की कोशिकाओं और जानवरों के बीच भिन्न हो सकते हैं और अन्य रसायनों के बाद से मतभेद अभी भी मौजूद हो सकता है, कुछ सेल आबादी (जैसे ल्युकोसैट) नियंत्रित नहीं किया गया है. ध्यान दें कि पीआरपी ल्युकोसैट अमीर तैयार किया गया था और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया है, के बाद से leukocytes प्रत्यक्ष बैक्टीरियल हत्या और प्रतिजन विशेष प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल कर रहे हैं. प्रोटोकॉल आगे ल्युकोसैट केवल 1 centrifugation (1 चित्रा) के बाद शीर्ष स्तर पर (यानी प्लाज्मा और प्लेटलेट भाग) के एक दूसरे centrifugation बाहर ले जाने से गरीब पीआरपी प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

इस अध्ययन में, 50 मिलीलीटर पूरे रक्त के लिए लगभग 5 मिलीलीटर पीआरपी को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यदि रक्त की मात्रा एक चिंता का विषय है, कई जानवरों से जमा रक्त पीआरपी तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि रक्त आकर्षित और / या centrifugation के दौरान थक्के फार्म, सबसे अधिक संभावना कुछ प्लेटलेट्स को सक्रिय कर रहे हैं, जो कम प्लेटलेट उपज में परिणाम देगा. इसलिए, पर्याप्त anticoagulants और कोमल, लेकिन पूरी तरह से मिश्रण सफल पीआरपी अलगाव के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं.

पीआरपी वर्तमान अध्ययन में थ्रोम्बिन का उपयोग कर सक्रिय किया गया था. कैल्शियम क्लोराइड, कैल्शियम क्लोराइड के साथ या बिना exogenous या ऑटोलॉगस थ्रोम्बिन, यांत्रिक तनाव (अतिरिक्त उच्च गति centrifugation), और batroxobin सहित अन्य तरीकों को भी पीआरपी 29-32 सक्रियण के लिए लागू किया जा सकता है. ध्यान दें कि थ्रोम्बिन द्वारा सक्रिय प्लेटलेट्स की संभावना अपने ग्रेन्युल सामग्री बहुत रिहाई हो सकती है अन्य रसायनों से सक्रिय प्लेटलेट्स की तुलना में तेजी से. कारण यह है कि, अपने, वी VIIIa Va, और आतंच के लिए फाइब्रिनोजेन ज़िया, आठवीं ग्यारहवीं कारक में परिवर्तित करने की क्षमता के अलावा, थ्रोम्बिन प्लेटलेट और एक के माध्यम से सक्रियण एकत्रीकरण को बढ़ावा कर सकते हैंप्लेटलेट सेल झिल्ली 33-35 पर protease सक्रिय रिसेप्टर्स की ctivation.

को मारने वक्र परख के लिए इन विट्रो पीआरपी के रोगाणुरोधी गतिविधि में आकलन पेश किया गया. अगर डिस्क प्रसार परख के विपरीत, मार वक्र परख समय पर जीवाणुनाशक गतिविधि की दर के मात्रात्मक आकलन की अनुमति देता है. एक महत्वपूर्ण कदम ठीक से बैक्टीरिया फैलाने जब CFUs गिनती पूरी संस्कृति नमूना से पहले अच्छी तरह से जोरदार pipetting द्वारा मिश्रण तैयार है और vortexed धारावाहिक dilutions के लिए पीआरपी जेल मई उलझाना के रूप में एक करने के लिए ठीक से बैक्टीरिया फैलाने करने की क्षमता है.

कुल मिलाकर, प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा एस के रूप में मजबूत रोगाणुरोधी बैक्टीरिया के खिलाफ गुण है aureus, एक streptococcus समूह, और नेइसेरिया gonorrhoeae. इसकी अच्छी तरह से अध्ययन चिकित्सा को बढ़ावा देने के गुणों के अलावा, पीआरपी प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमण को रोकने के लिए एक नया दृष्टिकोण के रूप में सेवा कर सकता है. पीआरपी रोगाणुरोधी संपत्तियों की व्यवस्था हैतक अज्ञात है और इस क्षेत्र में आगे की जांच की जरूरत है.

इस अध्ययन की सीमाओं में शामिल पीआरपी कि पूरी तरह से हमारे प्रयोगात्मक शर्तों के तहत बैक्टीरिया को समाप्त नहीं किया है (1 x 10 5 / CFU मिलीलीटर). यह हमारे नैदानिक ​​जीवाणु उपभेदों कि इस्तेमाल किया गया की उच्च डाह के कारण हो सकता है, एक 10 एक्स 2 एस CFU (0.1 मिलीलीटर) aureus 36-38 vivo में गंभीर संक्रमण प्रेरित किया. वैकल्पिक रूप से, पीआरपी की राशि बेहतर बैक्टीरियल उन्मूलन, या पीआरपी संक्रमण की रोकथाम के लिए पारंपरिक एंटीबायोटिक दवाओं के प्रणालीगत या स्थानीय प्रशासन के साथ एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है को प्राप्त करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, पीआरपी के दोहरे प्रभाव (यानी रोगाणुरोधी और चिकित्सा को बढ़ावा देने के गुण) फायदेमंद हो सकता है चिकित्सा को बढ़ावा देने, जबकि संक्रमण को रोकने में. एक और सीमा है है कि पीआरपी रोगियों को जो पहले से ही प्रणालीबद्ध संक्रमित किया गया है (जैसे पूति रोगियों) के लिए नहीं किया जाना चाहिए. यह इसलिए है क्योंकि रक्त में बैक्टीरिया को पारित करने के लिए किया जा सकता हैपीआरपी से आवेदन साइट के लिए एड पर जब तक उचित बंध्याकरण तकनीकों को लागू कर रहे हैं. हम अपने उपयोग से पहले संभव बैक्टीरियल पीआरपी के contaminations से सावधान परीक्षा की सलाह देते हैं.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine thrombin King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 Thrombin (bovine origin)
Calcium chloride King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 10% calcium chloride
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Isoflurane Baxter 1001936060
Mueller Hinton broth Becton, Dickinson and Company 275710
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8662
Tri-sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Tryptic soy agar Fisher Scientific R01202
Centrifuge Kendro Laboratory Products 750043077
Syringe filter Millipore SLGP033RS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gristina, A. G. Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration. Science. 237, 1588-1595 (1987).
  2. Gristina, A. G., Costerton, J. W. Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis. J. Bone Joint Surg. Am. 67, 264-273 (1985).
  3. Everts, P. A., et al. Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery. Eur. Surg. Res. 39, 199-207 (2007).
  4. Marx, R. E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP. Implant. Dent. 10, 225-228 (2001).
  5. Toscano, N., Holtzclaw, D. Surgical considerations in the use of platelet-rich plasma. Compend. Contin. Educ. Dent. 29, 182-185 (2008).
  6. Cieslik-Bielecka, A., Gazdzik, T. S., Bielecki, T. M., Cieslik, T. Why the platelet-rich gel has antimicrobial activity? Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 103, 303-306 (2007).
  7. Yeaman, M. R. The role of platelets in antimicrobial host defense. Clin. Infect. Dis. 25, 951-970 (1997).
  8. Tang, Y. Q., Yeaman, M. R., Selsted, M. E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infect Immun. 70, 6524-6533 (2002).
  9. El-Sharkawy, H., et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties. J. Periodontol. 78, 661-669 (2007).
  10. Krijgsveld, J., et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines. J. Biol. Chem. 275, 20374-20381 (2000).
  11. Trowbridge, C. C., et al. Use of platelet gel and its effects on infection in cardiac surgery. J. Extra Corpor. Technol. 37, 381-386 (2005).
  12. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface. Med. Prog. Technol. 14, 205-224 (1988).
  13. Subbiahdoss, G., Kuijer, R., Grijpma, D. W., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Microbial biofilm growth vs. tissue integration: "the race for the surface" experimentally studied. Acta Biomater. 5, 1399-1404 (2009).
  14. Klevens, R. M., et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 298, 1763-1771 (2007).
  15. Foster, T. E., Puskas, B. L., Mandelbaum, B. R., Gerhardt, M. B., Rodeo, S. A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am. J. Sports Med. 37, 2259-2272 (2009).
  16. Carlson, N. E., Roach, R. B. Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry. J. Am. Dent. Assoc. 133, 1383-1386 (2002).
  17. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237 (2001).
  18. Fridkin, S. K., et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin. Infect. Dis. 36, 429-439 (1997).
  19. Jackson, C. R., Fedorka-Cray, P. J., Davis, J. A., Barrett, J. B., Frye, J. G. Prevalence, species distribution and antimicrobial resistance of enterococci isolated from dogs and cats in the United States. J. Appl. Microbiol. 107, 1269-1278 (2009).
  20. Murray, C. K., et al. Recovery of multidrug-resistant bacteria from combat personnel evacuated from Iraq and Afghanistan at a single military treatment facility. Mil. Med. 174, 598-604 (2009).
  21. Durr, M., Peschel, A. Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense. Infect Immun. 70, 6515-6517 (2002).
  22. Hancock, R. E. Peptide antibiotics. Lancet. 349, 418-422 (1997).
  23. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27, 158-167 (2009).
  24. Kalen, A., Wahlstrom, O., Linder, C. H., Magnusson, P. The content of bone morphogenetic proteins in platelets varies greatly between different platelet donors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375, 261-264 (2008).
  25. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J. Craniomaxillofac. Surg. 30, 97-102 (2002).
  26. Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 97, 110-118 (2009).
  27. Lei, H., Gui, L., Xiao, R. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin. Biochem. 42, 1452-1460 (2009).
  28. Redler, L. H., Thompson, S. A., Hsu, S. H., Ahmad, C. S., Levine, W. N. Platelet-rich plasma therapy: a systematic literature review and evidence for clinical use. Phys. Sportsmed. 39, 42-51 (2011).
  29. Whitman, D. H., Berry, R. L., Green, D. M. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. J. Oral Maxillofac. Surg. 55, 1294-1299 (1997).
  30. Anitua, E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int. J. Oral Maxillofac. Implants. 14, 529-535 (1999).
  31. Whitman, D. H., Berry, R. L. A technique for improving the handling of particulate cancellous bone and marrow grafts using platelet gel. J. Oral. Maxillofac. Surg. 56, 1217-1218 (1998).
  32. Currie, L. J., Sharpe, J. R., Martin, R. The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review. Plast. Reconstr. Surg. 108, 1713-1726 (2001).
  33. Nikulin, A. A. Effect of calcium, thrombin and nucleotides (ADP, cAMP, cGMP) on blood platelet glycolysis and energy metabolism. Farmakol. Toksikol. 43, 585-590 (1980).
  34. Hantgan, R. R., Taylor, R. G., Lewis, J. C. Platelets interact with fibrin only after activation. Blood. 65, 1299-1311 (1985).
  35. Hantgan, R., Fowler, W., Erickson, H., Hermans, J. Fibrin assembly: a comparison of electron microscopic and light scattering results. Thromb. Haemost. 44, 119-124 (1980).
  36. Li, B., Jiang, B., Boyce, B. M., Lindsey, B. A. Multilayer polypeptide nanoscale coatings incorporating IL-12 for the prevention of biomedical device-associated infections. Biomaterials. 30, 2552-2558 (2009).
  37. Li, B., Jiang, B., Dietz, M. J., Smith, E. S., Clovis, N. B., Rao, K. M. K. Evaluation of local MCP-1 and IL-12 nanocoatings for infection prevention in open fractures. J. Orthop. Res. 28, 48-54 (2010).
  38. Boyce, B. M., Lindsey, B. A., Clovis, N. B., Smith, E. S., Hobbs, G. R., Hubbard, D. F., Emery, S. E., Barnett, J. B., Li, B. Additive effects of exogenous IL-12 supplementation and antibiotic treatment in infection prophylaxis. J. Orthop. Res. 30, (2), 196-202 (2012).
संक्रमण को रोकने के लिए एक नई दृष्टिकोण के रूप में पीआरपी: तैयारी और<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; रोगाणुरोधी संपत्तियों पीआरपी
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Li, H., Li, B. PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP. J. Vis. Exp. (74), e50351, doi:10.3791/50351 (2013).More

Li, H., Li, B. PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP. J. Vis. Exp. (74), e50351, doi:10.3791/50351 (2013).

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