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Immunology and Infection

感染を防ぐための新しいアプローチとして、PRP:準備と doi: 10.3791/50351 Published: April 9, 2013

Summary

インプラント関連感染は重要な臨床合併症である。この研究は、インプラント関連感染を防ぐために、多血小板血漿(PRP)を用いたアプローチを説明し、一定の血小板濃度でPRPを調製するためのプロトコルを提示して、PRPの新たに同定された抗菌性や抗菌性を調べるための関連プロトコルを報告

Abstract

インプラント関連感染が増加して抗生物質耐性、動物と人間の間に抗生物質耐性菌の伝送、および感染症の治療コストの高さに起因する世界的なヘルスケア産業にますます困難になってきています。

そこで本研究では、多血小板血漿(PRP)の潜在的な抗菌特性に基づいてインプラント関連感染の予防に有効である可能性がある新たな戦略を開示している。治癒を促進するためのよく研究された特性のために、PRP(生物学的製剤)はますます整形外科手術、歯と口腔の手術、顎顔面手術、整形手術、スポーツ医学などを含む臨床応用に使用されている

PRPはインプラント関連感染の防止に従来の抗生物質治療に高度な代替手段である可能性があります。 PRPを使用することにより、従来の抗生物質治療Siに比べて有利であるかもしれないPRPのNCE抗生物質耐性を誘導する可能性が低いとPRPの抗菌と癒しの促進特性は感染予防上の相乗効果があるかもしれません。それも病原体とヒトの細胞がインプラント表面のためにレースをしていることが知られており、治癒を促進するのPRPのプロパティには、それによって感染の確率を減らす人間の細胞接着を向上させることができます。また、PRPは本質的に、生体適合性、安全かつ伝染性疾患の危険性から自由である。

我々の研究のために、私たちは一般的に整形外科の感染症で発見され、PRPは、in vitroでこれらの細菌に対する抗菌性を持っているかどうかを検討されているいくつかの臨床菌株を選択しました。我々は、同じ血小板濃度がすべてのサンプルを得ることができるようになり二回遠心分離のアプローチを使用してPRPを用意しました。我々は、一貫性のある抗菌性の調査結果を達成し、PRPは、in vitroでメティのような細菌に対する抗菌性を強いていることを発見したウイルスバスター感受性およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、A連鎖球菌 、および淋菌 。したがって、PRPの使用は、感染を防ぐために、インプラント関連感染の高価な術後治療の必要性を低減する可能性を秘めているかもしれません。

Introduction

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インプラント関連感染は重要な臨床合併症である。 黄色ブドウ球菌黄色ブドウ球菌は、インプラント関連感染症から分離された最も一般的な微生物の一つである。これは、インプラントの表面をカバーし、抗生物質耐性感染1,2につながる可能性がバイオフィルムを製造することができる。インプラント関連感染症の治療は、頻繁に繰り返さdebridementsかつ長期の非経口抗生物質治療のために長期入院を必要とします。抗生物質耐性例では、インプラントの除去が必要になることがあります。抗生物質に対する細菌の耐性が上昇するとしても、疾病管理予防センター(CDC)によって参照されている "世界で最も緊急の健康問題の一つ。"時間では、新しい効果的な抗菌治療法の開発がなければ、多剤耐性病原体は、従来の抗生物質による治療不可能となる可能性があります。インプラント関連の防止感染症は、ことが重要であると新規予防剤またはアプローチはこのような感染症を予防するために必要とされる。

多血小板血漿(PRP)は、骨と骨移植の治癒3から5を助けることができる30以上の成長因子が含まれている自己血の濃度である。骨再生や軟組織の成熟を高めるために、PRPの応用はますますため血小板がリリースし、様々な成長因子のその高濃度の診療所で報告されています。

PRPのいくつかの特徴では、PRPも抗菌特性6-9を持っているかもしれないことを示します。 PRPは、血小板の数が多い、白血球の高濃度(細菌および真菌に対する宿主防御アクションを持っているかもしれない)、複数の抗菌ペプチド7,8,10が含まれいます。心臓外科患者の大規模コホートの最近の研究では、創傷閉鎖signif時PRPゲルの術中使用することが明らかになったicantly浅と深い胸骨感染11の発生率を減少させた。これらの理由及び観察のために、私たちは、PRPは、そのよく研究された治癒促進特性以外にも、抗菌特性を持っているという仮説を立てた。感染を防ぐためにPRPを使用しての潜在的な利点があり得る:(i)PRPが従来の抗生物質治療に比べて抵抗性を誘発する可能性が低くなります。 (ⅱ)PRPがまた感染予防に相乗効果があるかもしれ治癒を促進する性質をもっています。PRPの治癒促進特性は、病原体とヒトの細胞がインプラント表面12にはレースをしていると感染の確率を減らすことにより、細菌の付着を防止するためにシールを提供することができます、13。 (ⅲ)PRPは本質的に、生体適合性、安全かつ伝染性疾患のリスクがない。

私たちの長期的な目標は、インプラント関連infectiを防ぐための新たなアプローチとして、PRPを使用することですアドオン。本研究の目的は、PRP 、in vitro抗菌特性 PRPのを調べるために、二回遠心分離のアプローチを使用して、そのような抗菌性を評価するためのプロトコルを記述するために準備することでした。

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Protocol

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1。 PRPの作製とその活性化

1.1採血

  1. イソフルランの吸入(誘導のためのO 2中2%、保守のための1%)でウサギを麻酔。
  2. 20mlのシリンジに2ミリリットル0.129 Mのクエン酸三ナトリウムを(anticoagulentソリューション)を描画します。クエン酸三ナトリウム溶液を50 mlの蒸留H 2 O中の1.897グラムクエン酸三ナトリウムを溶解し、0.22μmの滅菌フィルターで濾過することによって調製される。
  3. 70%エタノールを用いてウサギの耳を殺菌。
  4. 翼状針(25g)をシリンジに接続を介して、ウサギの耳静脈から( 例えば 5ミリリットル)の血を引く。
  5. 穏やかな攪拌によってクエン酸三ナトリウム溶液を用いて血液を混ぜる。血液とクエン酸三ナトリウム水溶液の体積比は9:1である。

1.2 PRPの調製( 図1)

  1. 50mlプラスチック遠心管に抗凝固処理血液を転送します。 10μlのアリコートを取る血球計算法を用いてベースライン血小板数を決定するために、血液。
  2. スイングアウトローター付き遠心機で室温(RT)で10分間、300×gで血液を遠心分離します。低い( 図1)への加速とブレーキの速度を設定します。
  3. 遠心後、血液は3層に分かれています。底層は、中間層(一般的に "バフィーコート"と呼ばれる)は、主に赤血球で濃縮血小板や白血球から構成され、最上位層は、主に血液の液体成分である血漿、血小板である( 図1)。細胞培養用フードに遠心管を慎重に輸送;層を乱すことがありません。 1ミリリットルプラスチックピペットを用いて、15​​ mlプラスチックチューブに、血漿、バフィーコート、および2-3 mm厚赤血球層のすべてを転送します。
  4. 室温で15分間3000 xgで転送サンプルをもう一度遠心します。上層(上清)を乏血小板血漿(PPP)と見なされますdは、新しいチューブに移す。
  5. 2.0×10 6血小板/μlを(血球計算法によって決定される)を得るために、PPPを使用して、残りの血液サンプル中の血小板濃度を調整することによって、PRPを得る。

1.3 PRPの活性化

  1. 1,000 IU / mlの濃度になるように取り組んで5ミリリットル10%塩化カルシウムで5,000 IUウシトロンビンを溶解させることによって、PRPの活性化溶液を調製します。
  2. PRPとPPPにライセンス認証ソリューションを追加して、繰り返して、PRP-およびPPP-ゲルを形成するために、ピペッティングにより溶液を混ぜて使用する。 PRPまたはPPPへの活性化溶液の体積比は1:4です。

2キルカーブアッセイを使用して、PRP in vitro抗菌試験( 図2) では、

  1. 無菌接種ループを使用して、Sのいくつかのコロニーを追加プラスチックチューブでミューラーヒントンブロス(MHB)5mlにその晩平板培養から黄色ブドウ球菌 。 Vortexは簡潔にしてから、37℃で2時間サンプルをインキュベート次の、細菌のメディアの光学濃度を分光光度計を用いて決定し、予め決められた標準曲線に基づいて〜1×10 8 cfu / mlに等しい光学密度に調整した。
  2. 1×10 6 CFU / mlを取得し、氷の上で接種を配置するPBSを用いて100倍希釈を作る。
  3. セットアップおよび滅菌、使い捨て5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブにラベルなど、各チューブに2 mlの最終容積については、 表1に示されている以下のサンプル·グループを準備。
  4. 活性化のためのトロンビン溶液(ゲル形成)が続いポリスチレンチューブにPRP、PPP、またはPBSを最初に追加します。次に、MHBを追加してから、S.球菌接種(1×10 6 CFU / ml)を1×10 5 CFU / mlの最終濃度を得ることができる。
  5. ℃で150rpmで攪拌​​しながら軌道37でチューブをインキュベートする。
  6. 予め決められた時点( 例えば 0,1、および2時間)で、繰り返しピペッティング(これを経由して各チューブ内の溶液を混合細菌は、PRPゲルの内部に閉じ込められるかもしれないので、ステップ)が重要である。 、サンプルの10μlを取り滅菌0.9%生理食塩水で順次希釈し、トリプシン大豆寒天(TSA、5%羊血液付き)CFUカウントのためのプレート上に各希釈液の100μlアリコートをピペット。
  7. 37℃で一晩培養寒天プレート°Cは、その後プレートのコロニーをカウントし、記録します。 y軸上のx軸およびCFU / mlの上の時間(hr)とlogarithimicスケールでデータをプロットします。

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Representative Results

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PRPは、再現性回遠心分離法( 図1)を用いて調製される。 PRPは、メチシリン耐性S.に対する in vitro抗菌特性 (CFUsで最大100倍の減少)は、強力な存在が判明した一般的に世界中の病院14に見られる黄色ブドウ球菌 (MRSA)( 図3)。同様に、PRPはメチシリン感受性球菌に対して強い抗菌性を持って黄色ブドウ球菌 (MSSA)、A群連鎖球菌 、および淋菌

二回の遠心分離の方法は、同じ血小板濃度( すなわち、2.0×10 6血小板/μL)が、濃縮された(〜10倍の血液中のベースラインより上の、 図4)PRPの取得を許可せず、私たちは一貫して抗菌性の知見を得ることを可能にする、有意差異なる個々の動物( すなわちからのPRP間のCFUの所見ウサギ)が観察されている。

グループ PRP / PPP / PBS MHB MRSA接種
コントロールなし 1800μlの 200μlの
コントロールなし 2,000μL なし
コントロール PBS +トロンビン(200μL) 1600μlの 200μlの
PPP PPP +トロンビン(200μL) 1600μlの 200μlの
PRP PRP +トロンビン(200μL) 1600μlの 200μlの

表1。 PRPの抗菌性評価のための実験サンプル。


図1。二回遠心操作を使用して、PRPの準備。()最初の遠心分離。最初の遠心分離の後、3つの層が形成され、上部の2つの層( すなわち 、血漿およびバフィーコート層)と底層( すなわち赤血球層)の2-3 mmの第二滅菌遠心管に移しています。 (B)第2遠心分離。第二遠心分離後、上層を新しい滅菌チューブに移したもので、PPPに指定されています。残りは、2.0×10 6血小板/μlの血小板濃度にPPPで調整およびPRPとして指定されています。

図2
図2。抗菌propertieを評価するための実験のセットアップキル曲線アッセイを用いてPRPのだ。まず、PRPまたはPPPは試験管に添加し、直ちにトロンビン溶液を用いて活性化。次に、MHBは、細菌接種に続いて追加されます。サンプルのアリコートを異なる時点で採取およびCFUカウントでメッキされています。

図3
図3。 PRP、PPP、またはPBSトロンビン、MHBブロス、およびMRSA接種と一緒に滅菌5mlのポリスチレンチューブに入れた後、37℃でインキュベートする150rpmで軌道攪拌したC。予め決定された時点でのポイント( すなわち 1と2 hr)は、サンプルのアリコートは、CFUカウントのために採取して播種する。 (A)はCFUのデータと(B)の代表的なプレート画像10 -2希釈で。 MRSAの増殖の有意な減少が(2時間で約100倍)が得られるusinグラムPRPは、PPPおよびPBS対照と比較した。これは、同様MSSA、A群連鎖球菌 、および淋菌などの細菌にも当てはまります。

図4
図4。二回遠心アプローチから調製した全血の血液塗抹標本(左)とPRP(右)。PRPは全血に比べて血小板の約10倍の数を持っています。

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Discussion

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多血小板血漿は、ますますその治癒促進特性15から17に起因する臨床応用に使用されている。本研究では、PRPは、感染予防のための新しいアプローチとして提示された。 PRPは、MRSA、MSSA、A群連鎖球菌 、および淋菌に対しても強い抗菌性を有することが見出された。感染予防のための従来の抗生物質治療と比較して、PRPの主な利点は、以下を含む:(1)現在の抗生物質療法はますます報告抗生物質耐性14,18-20含む課題に直面しています。 PRPは、血小板(i)は 、PRPの血小板殺菌タンパク質は、好中球、単球、および病原体の侵入21からの防御に重要な役割を果たすT細胞などの免疫細胞に対する走化性特性を有する可能性があるため、高度な代替すること、及び(ii)従来の抗生物質に比べて可能性があり殺菌タンパク質は私の可能性も低くなります細菌の膜構造22を変更する際の難しさに起因する細菌の耐性をnducing。 (2)PRPが感染症を減少させるだけでなく、創傷治癒を促進するのみならず、どちらも外傷、時間とお金の面でコストがかかります。

PRPは、最近増加し関心を集めている。しかし、血小板の開始番号、抗凝固剤の使用、白血球の封入、およびアクチベーター23から27の使用を含むPRPの準備プロトコル間での多数の複雑なバリエーションがあります。 PRPの準備の変動が動物および臨床研究28の両方で物議を醸す結果に部分的に貢献しています。結果として、PRPの研究のための大きな問題は、変動を制御することです。現在の研究では、二回の遠心分離のアプローチを実施し、PRPの血小板濃度は、PRP調製プロトコルを標準化し、変動を制限するために2×10 6血小板/μL(〜10倍の血液中のベースラインの上)に固定されていましたPRPの準備インチ提示回遠心分離のアプローチは簡単ですが、簡単に他の動物や人間の血液からPRPの単離のために適用することができ、本研究ではウサギ、PRP in vitro抗菌特性一貫性につながっている。しかし、違いはまだ個々の細胞と動物の間で異なる場合があります内または血小板から放出される成長因子や他の化学物質以来存在する可能性がありますいくつかの細胞集団( 例えば白血球)が制御されていません。白血球が直接殺菌と抗原特異的免疫応答に関与しているので、白血球が豊富なPRPが、本研究で調製して用いたことに注意してください。プロトコルは、さらに最初の遠心分離( 図1)の後だけトップ層( すなわち 、血漿および血小板部分)の第二の遠心分離を行うことにより白血球貧しいPRPを取得するように変更される可能性があります。

本研究では、50ミリリットルの全血を約5ml PRPを取得するために使用した。血液量が懸念される場合は、複数の動物からプールされた血液は、PRPを調製するために用いることができる。血栓の採血時の形式および/または遠心分離した場合、最も可能性の高いいくつかの血小板は、血小板収量になりますが活性化されています。したがって、十分な抗凝固剤と優しく、完全な混合が成功したPRP分離のための重要なステップである。

PRPは、本研究ではトロンビンを用いて活性化した。塩化カルシウム、塩化カルシウムの有無にかかわらず、外因性または自己トロンビン、機械的ストレス(追加の高速遠心分離)、およびバトロキソビンを含む他のアプローチもまた、PRPの活性化のために29から32に適用することができる。トロンビンによって活性化した血小板は、おそらくはるかに速く、他の化学物質によって活性化した血小板よりも自分の顆粒の内容を解放することができることに注意してください。原因は第VIIIa、VaにV、およびフィブリノーゲンをフィブリンに夏、第VIII XI因子に変換する能力に加えて、トロンビンを経由し、血小板の活性化および凝集を促進することができる、ということです血小板細胞膜を33から35にプロテアーゼ活性化受容体のctivation。

キル曲線アッセイは、PRPのin vitroでの抗菌活性を評価するために提示された。寒天ディスク拡散アッセイとは異なり、キル曲線アッセイは、時間をかけて殺菌活性の割合を定量的に評価することができます。 CFUsを数えるときに適切に細菌を分散する一つの重要なステップは、PRPゲルが正しく細菌を分散させるために自分の能力を混乱させる可能性があるサンプルは、連続希釈のために描かれたとされる前に、ボルテックス精力的なピペッティングでよく全体の文化をミックスすることです。

全体的には、多血小板血漿は、Sのような菌に対して強い抗菌性を持って黄色ブドウ球菌 、A群連鎖球菌 、および淋菌 。そのよく研究された治癒促進特性のほかに、PRPはインプラント関連感染を防ぐための新たなアプローチとして働くことができる。 PRPの抗菌性のメカニズムはsですこのエリアの未知の、さらなる調査が必要とされているまで。

この研究の限界は、PRPは完全に我々の実験条件下で細菌を除去(1×10 5 CFU / ml)をしなかったことが挙げられる。これは、使用されていた我々の臨床菌株の高い病原性が原因である可能性があり、Sの1×10 2 CFU(0.1ミリリットル) 黄色ブドウ球菌は、in vivoで 36から38 重篤な感染症を誘発した。代わりに、PRPの量は良い細菌の除去を達成するために増加することができますし、PRPは、感染予防のために、従来の抗生物質の全身または局所投与と一緒に使用することができる; PRPのデュアル効果( すなわち抗菌と治癒促進特性)有利で ​​あるかもしれない感染を防ぎながら、治癒を促進するインチもう一つの制限は、PRPが既に( 例えば敗血症患者)全身感染している患者のために使われるべきではないということです。血液中の細菌が通過されるかもしれないからですedは適切な滅菌法が適用されていない限り、PRPから適用部位にログオンします。我々は、その使用前に、PRPの可能性細菌の汚染を慎重に検討することをお勧めします。

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Disclosures

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine thrombin King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 Thrombin (bovine origin)
Calcium chloride King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 10% calcium chloride
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Isoflurane Baxter 1001936060
Mueller Hinton broth Becton, Dickinson and Company 275710
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8662
Tri-sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Tryptic soy agar Fisher Scientific R01202
Centrifuge Kendro Laboratory Products 750043077
Syringe filter Millipore SLGP033RS

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感染を防ぐための新しいアプローチとして、PRP:準備と<em&gt;インビトロ</emPRPの&gt;抗菌特性
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Li, H., Li, B. PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP. J. Vis. Exp. (74), e50351, doi:10.3791/50351 (2013).More

Li, H., Li, B. PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP. J. Vis. Exp. (74), e50351, doi:10.3791/50351 (2013).

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