Summary
Implant associée à l'infection est une complication clinique importante. Cette étude décrit une approche basée sur plasma riche en plaquettes (PRP) pour prévenir les infections associées aux implants, présente le protocole pour la préparation de PRP avec la concentration de plaquettes constante, et rend compte des propriétés nouvellement identifiés antimicrobiennes de PRP et les protocoles connexes pour examiner de telles propriétés antimicrobiennes
Abstract
Implant associée à l'infection devient de plus en plus difficile pour l'industrie des soins de santé dans le monde entier en raison de la résistance croissante aux antibiotiques, la transmission de bactéries résistantes aux antibiotiques entre les animaux et les humains, et le coût élevé du traitement des infections.
Dans cette étude, nous décrivons une nouvelle stratégie qui pourrait être efficace dans la prévention des infections associées aux implants basée sur les propriétés antimicrobiennes potentielles de plasma riche en plaquettes (PRP). En raison de ses propriétés bien étudiées pour favoriser la cicatrisation, PRP (un produit biologique) a été de plus en plus utilisées pour des applications cliniques, y compris les chirurgies orthopédiques, chirurgies parodontales et orale maxillo-faciale, la chirurgie, la chirurgie plastique, médecine du sport, etc
PRP pourrait être une alternative de pointe pour traitements antibiotiques conventionnels en matière de prévention des infections associées implant. L'utilisation de PRP peut être avantageux par rapport aux traitements antibiotiques conventionnels scnce PRP est moins susceptible d'induire une résistance aux antibiotiques et PRP antimicrobienne et la guérison des propriétés favorisant peut avoir un effet synergique sur la prévention des infections. Il est bien connu que les agents pathogènes et les cellules humaines sont en compétition pour les surfaces de l'implant, et les propriétés de PRP de guérison de promotion pourrait améliorer la fixation des cellules humaines réduisant ainsi les chances d'infection. En outre, le PRP est intrinsèquement biocompatible et sécuritaire et exempt de risque de maladies transmissibles.
Pour notre étude, nous avons sélectionné plusieurs souches bactériennes cliniques qui sont généralement trouvés dans les infections orthopédiques et a examiné si PRP a les propriétés in vitro antimicrobiens contre ces bactéries. Nous avons préparé PRP en utilisant une approche qui permet centrifugation deux fois la même concentration plaquettaire à obtenir pour tous les échantillons. Nous avons obtenu des résultats cohérents antimicrobiens et a constaté que PRP a une forte propriétés in vitro antimicrobiens contre les bactéries comme methicillin sensible et résistant à la méthicilline Staphylococcus aureus, streptocoques du groupe A, et Neisseria gonorrhoeae. Par conséquent, l'utilisation de PRP peut avoir le potentiel pour prévenir l'infection et à réduire le besoin de coûteux traitement post-opératoire de l'implant infections nosocomiales.
Introduction
Implant associée à l'infection est une complication clinique importante. Staphylococcus aureus (S. aureus) est l'un des microorganismes les plus fréquemment isolés à partir implant infections nosocomiales. Il est capable de produire un biofilm qui recouvre les surfaces des implants et peut conduire à l'infection de 1,2 résistante aux antibiotiques. Traitement des infections associées aux implants nécessite souvent une hospitalisation à long terme pour débridements répétés et prolongés thérapie parentérale d'antibiotiques. En cas de résistance aux antibiotiques, le retrait de l'implant peut être nécessaire. La résistance croissante des bactéries aux antibiotiques a également été évoquée par les Centers for Disease Control and Prevention (CDC) comme «l'un des problèmes de la santé les plus pressants." Avec le temps, sans le développement de nouveaux traitements antimicrobiens et efficace, il est possible que plusieurs médicaments pathogènes résistants sera intraitable avec les antibiotiques classiques. Prévention de l'implant associél'infection est donc important et de nouveaux agents prophylactiques ou approches sont nécessaires pour prévenir ces infections.
Plasma riche en plaquettes (PRP) est une concentration de sang autologue qui contient plus de 30 facteurs de croissance qui peuvent contribuer à l'os et la cicatrisation de greffe osseuse 3-5. L'application de PRP pour favoriser la régénération osseuse et de la maturation des tissus mous a été rapporté dans les cliniques de plus en plus en raison de sa forte concentration de divers facteurs de croissance libérés par les plaquettes.
Plusieurs caractéristiques de PRP PRP indiquent que peuvent aussi avoir des propriétés antimicrobiennes 6-9. PRP contient un grand nombre de plaquettes, une forte concentration de leucocytes (qui peut posséder hôte de défense contre les actions des bactéries et des champignons), et plusieurs peptides anti-microbiens 7,8,10. Dans une étude récente sur une large cohorte de patients de chirurgie cardiaque, il a été révélé que l'utilisation peropératoire de PRP-gel au cours de la plaie fermeture Significantly diminué l'incidence de l'infection par le sternum superficielle et profonde 11. Pour ces raisons et d'observations, nous avons émis l'hypothèse que le PRP, en plus de ses bien étudiées guérison des propriétés favorisant, possède des propriétés antimicrobiennes. Les avantages potentiels de l'utilisation de PRP pour prévenir l'infection peuvent inclure: (i) PRP est moins susceptible d'induire une résistance par rapport à des traitements antibiotiques conventionnels. (Ii) PRP a aussi des propriétés qui favorisent la guérison qui peut avoir un effet synergique sur la prévention des infections; PRP de la guérison, la promotion de propriétés pourrait fournir un joint pour empêcher la fixation des bactéries réduisant ainsi les chances d'infection par les pathogènes et les cellules humaines sont en compétition pour les surfaces de l'implant 12 , 13. (Iii) PRP est intrinsèquement biocompatible et sécuritaire et exempt de risque de maladies transmissibles.
Notre objectif à long terme est d'utiliser PRP comme une nouvelle approche pour prévenir implant associé infections. Le but de cette étude était de préparer PRP en utilisant une approche centrifugation à deux reprises, d'examiner PRP dans des propriétés antimicrobiennes in vitro, et de décrire les protocoles pour l'évaluation de ces propriétés antimicrobiennes.
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Protocol
1. Préparation et activation du PRP
1,1 prélever du sang
- Anesthésier le lapin par inhalation d'isoflurane (2% de O 2 pour l'induction et 1% pour la maintenance).
- Dessinez 2 ml 0,129 M citrate trisodique (une solution anticoagulant) dans une seringue de 20 ml. La solution de citrate trisodique est préparée par dissolution de 1,897 g de tri-sodium citrate dans 50 ml H 2 O distillée et filtrer avec un filtre stérile de 0,22 um.
- Stériliser l'oreille de lapin à l'aide d'éthanol à 70%.
- Prélever du sang (par exemple 5 ml) à partir de la veine de l'oreille de lapin par l'intermédiaire d'une aiguille à ailettes (25 G) connectée à la seringue.
- Mélanger le sang avec la solution de citrate trisodique par agitation douce. Le rapport de volume de sang et de solution de citrate trisodique est de 9:1.
1.2 Préparation PRP (Figure 1)
- Transférer le sang coagulé dans un tube à centrifugation de 50 ml en plastique. Prélever une partie aliquote de 10 ulsang pour déterminer la numération plaquettaire de base en utilisant hemocytometry.
- Centrifuger le sang à 300 xg pendant 10 min à température ambiante (TA) dans une centrifugeuse avec un rotor swing-out. Réglez l'accélération et la vitesse de freinage à faible (Figure 1).
- Après centrifugation, le sang est séparé en trois couches. La couche inférieure est de globules rouges principalement, la couche médiane (communément appelé le "buffy coat") est composé de plaquettes concentrées et des leucocytes, et la couche supérieure est essentiellement du plasma, qui est le composant liquide du sang et des plaquettes ( Figure 1). Attentivement le transport du tube à centrifuger à une hotte de culture cellulaire; ne pas déranger les couches. Transférer la totalité du plasma, buffy coat, et 2-3 mm d'épaisseur couche de globules rouges dans un tube de 15 ml en plastique à l'aide d'une pipette 1 ml en plastique.
- Centrifuger l'échantillon transféré une seconde fois à 3000 xg pendant 15 min à température ambiante. La couche supérieure (surnageant) est considéré plasma pauvre en plaquettes (PPP) d'd est transférée dans un nouveau tube.
- Obtenir PRP en ajustant la concentration de plaquettes dans l'échantillon de sang restant en utilisant PPP pour obtenir 2,0 x 10 6 plaquettes / ul (déterminée par hemocytometry).
1.3 Activation du PRP
- Préparer la solution d'activation PRP en dissolvant 5.000 thrombine bovine UI avec 5 ml de chlorure de calcium à 10% à la concentration de travail de 1000 UI / ml.
- Ajouter la solution d'activation de PRP et PPP, et mélanger la solution par pipetage à plusieurs reprises pour former PRP et PPP-gels. Le rapport en volume de la solution d'activation de PRP ou PPP est de 1:4.
2. D'essai in vitro aux antibiotiques des PRP Utilisation Assay Curve Kill (figure 2)
- En utilisant une boucle stérile inoculation, ajouter plusieurs colonies de S. aureus à partir de sa plaque de culture du jour au lendemain dans 5 ml de bouillon Mueller Hinton (MHB) dans un tube en plastique. Vortex brièvement, puis incuber l'échantillon pendant 2 heures à 37 ° C. Suivant, La densité optique du support bactériennes a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre et ajustées à une densité optique égale à environ 1 x 10 8 CFU / ml sur la base de la courbe étalon prédéterminée.
- Faire une dilution 100x en utilisant du PBS pour obtenir 1 x 10 6 UFC / ml et placer les inoculums sur la glace.
- Mettre en place et étiqueter stériles et jetables tubes de 5 ml en polystyrène à fond rond, et de préparer les groupes d'échantillons suivants, comme indiqué dans le tableau 1 pour un volume final de 2 ml dans chaque tube.
- Ajouter PRP, PPP, ou PBS premier des tubes de polystyrène, suivie de la solution de thrombine pour l'activation (la formation du gel). Ensuite, ajoutez MHB puis le S. inoculums aureus (1 x 10 6 UFC / ml) pour obtenir la concentration finale de 1 x 10 5 UFC / ml.
- Incuber les tubes à 37 ° C sous agitation orbitale à 150 rpm.
- À des moments prédéterminés (par exemple 0, 1, et 2 h), mélanger les solutions dans chaque tube par pipetage répété (cetteétape est importante car les bactéries peuvent être piégés à l'intérieur du gel PRP). Prenez 10 ul d'échantillon, diluer en série avec une solution saline stérile à 0,9%, et introduire à la pipette une partie aliquote de 100 ul de chaque dilution sur une gélose trypticase soja (TSA, avec du sang de mouton à 5%) pour le comptage plaque UFC.
- Culture des plaques de gélose pendant la nuit à 37 ° C, puis de compter et d'enregistrer les colonies de la plaque. Tracer des données sur une échelle de temps logarithimic (h) sur l'axe des x et UFC / ml sur l'axe des ordonnées.
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Representative Results
Le PRP est reproductible préparés en utilisant une approche centrifugation deux fois (Figure 1). PRP est considérée comme présentant une forte (jusqu'à 100 fois la réduction de UFC) dans les propriétés antimicrobiennes in vitro contre les staphylocoques résistants à la S. méthicilline (SARM) (figure 3), qui se trouve couramment dans les hôpitaux à travers le monde 14. De même, le PRP a de fortes propriétés antimicrobiennes contre la méticilline sensible S. aureus méthicilline (SASM), streptocoque du groupe A, et Neisseria gonorrhoeae.
L'approche centrifugation deux fois permet l'acquisition de PRP avec la même concentration de plaquettes (soit 2,0 x 10 6 plaquettes / pl), mais concentré (~ 10 fois au-dessus de la ligne de base dans le sang; Figure 4) et permet d'obtenir des résultats cohérents antimicrobiens; pas de différences significatives dans les conclusions UFC parmi PRP de différents animaux individuels (c.-à-lapins) ont été observés.
| Groupes | PRP / PPP / PBS | MHB | SARM inoculum |
| Contrôler | Aucun | 1800 pi | 200 pi |
| Contrôler | Aucun | 2000 pi | Aucun |
| Contrôler | PBS + thrombine (200 pi) | 1600 pi | 200 pi |
| PPP | PPP + thrombine (200 pi) | 1600 pi | 200 pi |
| PRP | PRP + thrombine (200 pi) | 1600 pi | 200 pi |
Tableau 1. Échantillons expérimentaux pour l'évaluation antimicrobienne de PRP.
Figure 1. Préparation du PRP en utilisant une procédure centrifugation deux fois. (A) Première centrifugation. Après la première centrifugation, trois couches sont formées, et les deux couches supérieures (c.-à plasma et des couches de couche leucocytaire) et 2-3 mm de la couche inférieure (rouge couche de cellules sanguines) sont transférés dans un tube à centrifuger stérile secondes. (B) Deuxième centrifugation. Après la deuxième centrifugation, la couche supérieure est transférée dans un nouveau tube stérile et désigné comme PPP. Le restant est ajusté avec PPP pour une concentration en plaquettes de 2,0 x 10 6 plaquettes / pl et désigné RLP.
Figure 2. Montage expérimental pour l'évaluation de l'agent antimicrobien propritess de PRP courbe en utilisant le dosage d'abattage. Premièrement, PRP ou PPP est ajouté aux tubes à essai, et immédiatement activé avec une solution de thrombine. Ensuite, MHB est ajouté, suivi par inoculums bactériens. Des aliquotes d'échantillons sont prélevés à différents moments et plaqué pour la UFC.
Figure 3. PRP, PPP ou du PBS sont placés dans un tube en polystyrène stérile de 5 ml avec la thrombine, MHB bouillon, et le SARM inoculum et ensuite incubées à 37 ° C sous agitation orbitale à 150 rpm. Aux points de temps prédéterminés (soit 1 et 2 h), des aliquotes d'échantillons sont prélevés et étalés pour UFC. (A) des données UFC et (B) des images représentatives plaque de dilution à 10 -2. Réduction significative (~ 100 fois à 2 h) de la croissance de SARM est obtenue using PRP par rapport aux témoins PPP et PBS. Cela est vrai pour les bactéries comme SASM, streptocoque du groupe A, Neisseria gonorrhoeae et aussi bien.
Figure 4. Les frottis sanguins de sang total (à gauche) et PRP (à droite). PRP préparés à partir de l'approche centrifugation deux fois a environ 10 fois le nombre de plaquettes par rapport au sang total.
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Discussion
Plasma riche en plaquettes a été de plus en plus utilisées pour des applications cliniques en raison de ses propriétés favorisant la guérison 15-17. Dans la présente étude, le PRP a été présentée comme une nouvelle approche pour la prévention des infections. Le PRP a été constaté que de fortes propriétés antimicrobiennes contre le SARM, SASM, streptocoque du groupe A, et Neisseria gonorrhoeae. Les principaux avantages de la PRP, par rapport à des traitements antibiotiques conventionnels, pour la prévention de l'infection comprennent: (1) Les thérapies actuelles antibiotiques sont confrontés à des défis, notamment la résistance aux antibiotiques de plus en plus rapporté 14,18-20. PRP pourrait être une alternative de pointe parce que (i) PRP de plaquettes protéines microbicides peuvent posséder des propriétés chimiotactiques pour les cellules immunitaires comme les neutrophiles, les monocytes et les lymphocytes T qui jouent un rôle important dans la défense contre l'invasion pathogène 21, et (ii) par rapport aux antibiotiques classiques, des plaquettes protéines microbicides sont moins enclins à inducing résistance bactérienne due à la difficulté de changer les structures membranaires bactériennes 22. (2) PRP non seulement de réduire les infections, mais favorise également la cicatrisation des plaies, les deux sont coûteux en termes de traumatisme, du temps et de l'argent.
PRP a récemment suscité un intérêt accru. Toutefois, il existe de nombreuses variations complexes entre les protocoles de préparation du PRP, y compris le numéro de départ de plaquettes, l'utilisation d'anticoagulants, l'inclusion des leucocytes, et l'utilisation d'activateurs 23-27. La variation de la préparation du PRP contribue en partie aux résultats controversés à la fois dans les études animales et cliniques 28. En conséquence, un gros problème pour les études PRP est de contrôler la variation. Dans la présente étude, une approche centrifugation a été effectuée deux fois, et la concentration plaquettaire de PRP a été fixée à 2 x 10 6 plaquettes / ul (~ 10 fois au-dessus de la ligne de base dans le sang) afin de normaliser le protocole de préparation du PRP et de limiter la variabilitédans la préparation du PRP. L'approche centrifugation deux fois présenté est simple, peut être facilement appliquée pour l'isolement des PRP du sang d'autres animaux et les êtres humains, et a conduit à constante propriétés in vitro antimicrobiens de lapin PRP dans la présente étude. Cependant, les différences peuvent subsister car les facteurs de croissance et d'autres produits chimiques à l'intérieur ou libéré par les plaquettes peuvent varier selon les cellules et les animaux individuels, des populations de cellules (par exemple des leucocytes) n'ont pas été contrôlées. Notez que riche en leucocytes du PRP a été préparé et utilisé dans cette étude, étant donné que les leucocytes sont impliqués dans le meurtre bactérienne directe et spécifique à l'antigène réponse immunitaire. Les protocoles peuvent être en outre modifiées pour obtenir des leucocytes pauvre PRP en effectuant une centrifugation de seconde seulement la couche supérieure (c.-à plasma et des plaquettes partie) après la première centrifugation (figure 1).
Dans cette étude, 50 ml de sang total a été utilisé pour obtenir environ 5 ml de PRP. Si le volume de sang est un sujet de préoccupation, le sang regroupées à partir de plusieurs animaux peuvent être utilisés pour préparer des PRP. Si la formation de caillots de sang lors du match nul et / ou centrifugation, probablement quelques plaquettes sont activées qui se traduira par un rendement plaquettaire basse. Par conséquent, les anticoagulants suffisantes et douces, mais un mélange intime sont des étapes importantes pour l'isolement du PRP succès.
Le PRP a été activé à l'aide de la thrombine dans la présente étude. D'autres approches, y compris le chlorure de calcium, la thrombine exogène ou autologue avec ou sans chlorure de calcium, le stress mécanique (supplémentaire centrifugation à grande vitesse), et batroxobine peut également être appliquée pour l'activation du PRP 29-32. Notez que les plaquettes activées par la thrombine peut probablement libérer leur contenu granules beaucoup plus vite que les plaquettes activées par d'autres produits chimiques. La cause en est que, en plus de sa capacité à transformer le facteur XI à XI bis, VIII VIII, V à V bis, et le fibrinogène en fibrine, la thrombine peut favoriser l'activation et l'agrégation plaquettaires par unectivation de protease-activated récepteurs sur les membranes cellulaires des plaquettes 33-35.
Le dosage de la courbe kill a été présenté pour évaluer l'activité antimicrobienne in vitro de PRP. Contrairement à la méthode de diffusion sur gélose disque, le dosage de la courbe kill permet une évaluation quantitative du taux d'activité bactéricide au fil du temps. Une étape essentielle pour bien disperser les bactéries lors du comptage des CFU est de mélanger toute la culture à fond par pipetage vigoureux avant que l'échantillon est prélevé et vortex pour des dilutions en série, comme PRP gel peut confondre sa capacité à bien disperser les bactéries.
Dans l'ensemble, le plasma riche en plaquettes a de fortes propriétés antimicrobienne contre les bactéries telles que S. aureus, streptocoques du groupe A, et Neisseria gonorrhoeae. Outre ses bien étudiées guérison des propriétés favorisant, le PRP peut servir comme une nouvelle approche pour prévenir les infections associées aux implants. Le mécanisme des propriétés antimicrobiennes PRP est sjusqu'à ce que les enquêtes inconnus et encore dans ce domaine sont nécessaires.
Les limites de cette étude sont que la RLP n'a pas totalement éliminer les bactéries dans nos conditions expérimentales (1 x 10 5 UFC / ml). Cela peut être dû à la forte virulence de nos cliniques souches bactériennes qui ont été utilisés; 1 x 10 2 CFU (0,1 ml) de S. aureus infections sévères induites in vivo 36-38. Alternativement, la quantité de PRP peut être augmentée pour atteindre l'élimination mieux bactérienne, ou PRP peut être utilisé en association avec l'administration systémique ou locale d'antibiotiques conventionnels pour la prévention des infections; le double effet (c.-à-antimicrobienne et la guérison promotion de propriétés) de PRP peut être avantageux pour favoriser la cicatrisation tout en empêchant l'infection. Une autre limitation est que la RLP ne doit pas être utilisé chez les patients qui ont déjà été infectées par voie systémique (patients atteints de sepsis, par exemple). C'est parce que les bactéries dans le sang peut être passered à partir PRP au site d'application à moins que les techniques de stérilisation appropriées sont appliquées. Nous recommandons un examen attentif de possibles contaminations bactériennes de PRP avant son utilisation.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis, et Suzanne Smith pour son aide expérimentale et Suzanne Smith pour la relecture. Les auteurs remercient également Jean Thomas, Ph.D. de fournir les isolats bactériens cliniques et John B. Barnett, PhD, pour son soutien et à l'utilisation du laboratoire de sécurité biologique au Département de microbiologie, d'immunologie et de biologie cellulaire à l'Université West Virginia. Les auteurs tiennent à remercier le soutien financier de l'ostéosynthèse et Trauma Care Foundation et la National Science Foundation (# 1003907). Expériences de microscopie et analyse d'images ont également été réalisés dans l'installation de la West Virginia University Imaging, qui est soutenu en partie par le Mary Babb Randolph Cancer Center et NIH P20 RR016440.
L'utilisation d'animaux pour les prises de sang ont été approuvés par les soins de la West Virginia University animaux institutionnel et Use Committee. Toutes les expériences ont été exécutées en conformité avec toutes les guidelin pertinentees, les règlements et les organismes de réglementation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine thrombin | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | Thrombin (bovine origin) |
| Calcium chloride | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | 10% calcium chloride |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Mueller Hinton broth | Becton, Dickinson and Company | 275710 | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | R01202 | |
| Centrifuge | Kendro Laboratory Products | 750043077 | |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RS |
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