Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

PRP כגישה חדשה למניעת זיהום: הכנה ו Published: April 9, 2013 doi: 10.3791/50351
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Department of Orthopaedics, School of Medicine, West Virginia University, 2Department of Orthopaedics, Stem Cell Research Center, University of Pittsburgh, 3WVNano Initiative, 4Mary Babb Randolph Cancer Center

Summary

זיהום שתל הקשורים הוא סיבוך קליני משמעותי. מחקר זה מתאר גישה באמצעות פלזמה עשירה בטסיות (PRP) כדי למנוע זיהומים הקשורים שתל, מציג את הפרוטוקול להכנת PRP עם ריכוז טסיות דם קבוע, ומדווח על נכסים שזוהו לאחרונה מיקרוביאלית של PRP ופרוטוקולים הקשורים לבחינת מאפיינים מיקרוביאלית כאלה

Abstract

זיהום שתל הקשורים הופך להיות יותר ויותר מאתגר לתעשיית הבריאות עולמי בשל הגדלת עמידות לאנטיביוטיקה, העברה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה בין חיות ובני אדם, ועלות הגבוהה של טיפול בזיהומים.

במחקר זה, אנו חושפים את אסטרטגיה חדשה שעשויה להיות יעילים במניעת שתל הקשורים זיהום על בסיס התכונות מיקרוביאלית הפוטנציאליות של פלזמה עשירה בטסיות (PRP). בשל תכונותיו, למדו היטב לקידום ריפוי, PRP (מוצר ביולוגי) כבר משמש יותר ויותר ליישומים קליניים כוללים ניתוחים אורתופדיים, ניתוחי חניכיים ופה, ניתוחי לסת, ניתוחים פלסטיים, רפואת ספורט, וכו '

PRP יכול להיות חלופה מתקדמת לטיפולים אנטיביוטיים קונבנציונליים במניעת זיהומים הקשורים שתל. השימוש בPRP עשוי להיות יתרון בהשוואה לטיפולים אנטיביוטיים קונבנציונליים siNCE PRP הוא פחות סביר לגרום לעמידות לאנטיביוטיקה וPRP של מיקרוביאלית ותכונות ריפוי מקדם עשויים להיות השפעה סינרגיסטית על מניעת זיהום. זה ידוע היטב כי פתוגנים ותאי אדם הם מירוץ למשטחי שתל, והמאפיינים של PRP ריפוי קידום יכולים לשפר מצורף תא אנושי ובכך להפחית את הסיכויים לזיהום. בנוסף, PRP הוא מטבעו ביולוגי, ובטוח וחופשי מהסיכון למחל העברה.

למחקר שלנו, יש לנו נבחרו מספר זני חיידקים קליניים שמצויים לרוב בזיהומים אורתופדיים ובדקו האם יש בPRP מאפיינים מיקרוביאלית מבחנה נגד חיידקים אלה. הכנו PRP באמצעות גישת צנטריפוגה פעמים אשר מאפשרת את אותו ריכוז טסיות כדי להתקבל לכל המדגמים. השגנו ממצאים מיקרוביאלית עקביים ומצאנו שיש לו חזק בPRP מאפיינים מיקרוביאלית מבחנה נגד חיידקים כמו methiaureus רגיש-cillin והעמיד methicillin סטפילוקוקוס, קבוצת סטרפטוקוקוס, וNeisseria gonorrhoeae. לכן, השימוש בPRP יכול להיות פוטנציאל למניעת הזיהום ולהפחית את הצורך בטיפול יקר שלאחר ניתוח שתל של זיהומים הקשורים.

Introduction

זיהום שתל הקשורים הוא סיבוך קליני משמעותי. סטפילוקוקוס אוראוס (ס aureus) הוא אחד ממיקרואורגניזמים הנפוצים ביותר שבודדו מזיהומים הקשורים שתל. הוא מסוגל לייצר biofilm המכסה את פני השטח של שתלים ועלולים להוביל לזיהום 1,2 עמיד לאנטיביוטיקה. טיפול בזיהום נלווה שתל-לעתים קרובות דורש אשפוז ארוך טווח לdebridements החוזרים ונשנים וטיפול אנטיביוטי ממושך Parenteral. במקרים עמידים לאנטיביוטיקה, הסרת השתל עשויה להיות נחוצה. ההתנגדות הגוברת של חיידקים לאנטיביוטיקה יש גם מכונה על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), "אחד מבעיות הבריאות הקשות ביותר בעולם." עם זמן, ללא התפתחות של טיפולים חדשים ויעילים מיקרוביאלית, זה אפשרי כי פתוגנים עמידים לשילוב תרופות יהיו חשוכים עם אנטיביוטיקה קונבנציונלית. מניעת שתל הקשוריםזיהום לכן חשוב וסוכנים מניעתי רומן או גישות יש צורך למניעת זיהומים כאלה.

פלזמה טסיות דם עשיר (PRP) היא ריכוז של דם אוטולוגית המכיל מעל 30 גורמי גדילה אשר יכול לסייע בריפוי עצם ושתל עצם 3-5. היישום של PRP כדי לשפר את התחדשות עצם ורקמות רכות התבגרות דווח יותר ויותר במרפאות בגלל הריכוז הגבוה של גורמי גדילה שונים שפורסמו על ידי טסיות.

כמה מאפיינים של PRP PRP עולים כי יכול להיות גם מאפיינים מיקרוביאלית 6-9. PRP מכיל מספר גדול של טסיות דם, ריכוז גבוה של תאי דם לבנים (שעשוי להחזיק פעולות מארח הגנה נגד חיידקים ופטריות), ופפטידים מיקרוביאלית מרובים 7,8,10. במחקר שנערך לאחרונה בעוקבה גדולה של חולים ניתוחיים לב, התגלה כי שימוש intraoperative של PRP ג'ל במהלך סגירת הפצע signifירידת icantly השכיחות של זיהום עצם חזה שטחי ועמוק 11. המסיבות והתצפיות הללו, שערו כי PRP, מלבד תכונותיו, למדו היטב ריפוי המקדם, יש מאפיינים מיקרוביאלית. היתרונות הפוטנציאליים של שימוש PRP כדי למנוע זיהום יכולים לכלול: (i) PRP הוא פחות סביר לגרום להתנגדות בהשוואה לטיפולים אנטיביוטיים קונבנציונליים. (Ii) PRP יש גם תכונות שמקדמות ריפוי אשר עשוי להיות השפעה סינרגיסטית על מניעת זיהום; המאפיינים של PRP ריפוי המקדם יכולים לספק חותם כדי למנוע עיקול חיידקים ובכך להפחית את הסיכויים לזיהום כפתוגנים ותאי אדם הם מירוץ למשטחי שתל 12 , 13. (Iii) PRP הוא מטבעו ביולוגי, ובטוח וחופשי מהסיכון למחל העברה.

המטרה שלנו לטווח הארוך היא להשתמש PRP כגישה חדשה למניעת שתל הקשורים infectiתוספות. מטרת מחקר זה היה להכין PRP באמצעות גישת צנטריפוגה פעמים, כדי לבחון PRP של נכסים במבחנת מיקרוביאלית, וכדי לתאר את הפרוטוקולים להערכת מאפיינים מיקרוביאלית כאלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה והפעלה של PRP

להקיז דם 1.1

  1. הרדם ארנב על ידי שאיפה של isoflurane (2% בO 2 לזירוז ו1% לתחזוקה).
  2. צייר 2 0.129 ציטראט המ"ל M תלת נתרן (פתרון anticoagulent) לתוך מזרק מ"ל 20. פתרון ציטראט תלת נתרן הוא הוכן על ידי המסת 1.897 ציטראט תלת נתרן גרם ב 50 המ"ל המזוקק H 2 O וסינון עם מסנן 0.22 מיקרומטר סטרילי.
  3. לחטא את אוזן הארנב באמצעות אתנול 70%.
  4. להקיז דם (5 מ"ל לדוגמה) מוריד אוזן הארנב באמצעות מחט פרפר (25-G) מחובר למזרק.
  5. מערבב את הדם עם פתרון ציטראט תלת נתרן על ידי תסיסה עדינה. יחס הנפח של תמיסת ציטרט תלת נתרן בדם והוא 09:01.

1.2 הכנת PRP (איור 1)

  1. העברת דם anticoagulated לצינור פלסטיק צנטריפוגה מ"ל 50. קח aliquot של 10 μlדם כדי לקבוע את ספירת הטסיות הבסיסית באמצעות hemocytometry.
  2. צנטריפוגה הדם ב 300 XG למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר (RT) בצנטריפוגה עם הרוטור נדנדה החוצה. הגדר את התאוצה ומהירות בלם לנמוך (איור 1).
  3. לאחר צנטריפוגה, הדם מתחלק לשלוש שכבות. השכבה התחתונה היא תאי דם אדומים בעיקר, השכבה האמצעית (המכונה גם "מעייל באפים") מורכבת מטסיות דם ותאי דם לבנים מרוכזים, והשכבה העליונה היא בעיקר פלזמה, המהווה את המרכיב הנוזלי של דם, וטסיות דם ( איור 1). בזהירות להעביר את צינור צנטריפוגה למכסת מנוע תרבית תאים; לא להפריע את השכבות. להעביר את כל הפלזמה, מעייל באפים, ושכבת 2-3 מ"מ עובי תאי דם אדומה לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל באמצעות pipettor פלסטיק 1 מ"ל.
  4. צנטריפוגה המדגם הועבר בפעם שנייה ב3000 XG במשך 15 דקות בRT. השכבה העליונה (supernatant) נחשבת עניה פלזמת טסיות דם (PPP)ד מועבר לצינור חדש.
  5. השג PRP ידי התאמת ריכוז טסיות הדם בדגימת הדם שנותרה באמצעות PPP להשיג 10 x 2.0 6 טסיות / μl (נקבע על ידי hemocytometry).

1.3 הפעלת PRP

  1. הכן את פתרון הפעלת PRP ידי המסת תרומבין שור 5000 יחב"ל עם מ"ל 10% כלוריד 5 סידן לריכוז העבודה של 1,000 יחב"ל / מ"ל.
  2. הוסף את הפתרון להפעלה וPRP-PPP, ומערבב את הפתרון על ידי pipetting שוב ושוב כדי ליצור PRP-PPP ו- ג. יחס הנפח של הפתרון להפעלת PRP או PPP הוא 01:04.

2. במבחן Antimicrobial מבחנה של PRP השימוש Assay Curve Kill (איור 2)

  1. באמצעות לולאת inoculating סטרילי, להוסיף כמה מושבות של ס ' סטפילוקוקוס מתרבות צלחת הלילה שלה לתוך 5 מ"ל של מרק מילר הינטון (MHB) בצינור פלסטיק. מערבולת קצרה ואז דגירת המדגם עבור 2 שעות ב 37 ° C. הבא, הצפיפות האופטית של תקשורת החיידקים נקבעה באמצעות ספקטרופוטומטר והותאמה לצפיפות שווה ל ~ 1 אופטית x 10 8 CFU / מ"ל על בסיס העקום הסטנדרטיות שנקבע מראש.
  2. הפוך דילול 100x באמצעות PBS להשיג 1 x 10 6 CFU / מ"ל ולמקם את inoculums על קרח.
  3. להגדיר ולתייג 5 שפופרות סטריליות, חד פעמיות מיליליטר ישבן עגול קלקר, ולהכין את הקבוצות לדוגמא הבאות, שהוזכרו בטבלת המס '1 לנפח סופי של 2 מ"ל בכל מבחנה.
  4. הוסף PRP, PPP, או PBS ראשון שצינורות הקלקר, ואחריו פתרון תרומבין לצורך ההפעלה (היווצרות קריש). בשלב בא, ולאחר מכן להוסיף MHB ס inoculums aureus (1 x 10 6 CFU / מ"ל) להשיג ריכוז הסופי של 1 x 10 5 CFU / מ"ל.
  5. דגירת הצינורות על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסת הקפה ב 150 סל"ד.
  6. בנקודתי זמן שנקבעו מראש (לדוגמה 0, 1, ו2 שעות), לערבב את הפתרונים בכל צינור באמצעות pipetting החוזר (זההצעד חשוב שכן עשויים להיות לכודי חיידקים בתוך הג'ל PRP). קחו 10 μl של מדגם, לדלל סדרתי עם מי מלח 0.9% סטרילית, ופיפטה aliquot 100 μl של כל דילול על אגר סויה Tryptic (TSA, עם 5% דם כבשים) צלחת לספירת CFU.
  7. תרבות את הצלחות אגרו הלילה על 37 מעלות צלזיוס, ואז תספורנה ולהקליט מושבות הצלחת. נתוני עלילה בקנה מידת logarithimic עם זמן (שעות) על ציר ה-X וCFU / מ"ל ​​על ציר y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PRP מוכן reproducibly באמצעות גישת צנטריפוגה פעמים (איור 1). PRP נמצא להציג חזק (ירידה של עד 100-לקפל בCFUs) במאפיינים מיקרוביאלית מבחנה נגד methicillin העמיד ס סטפילוקוקוס (MRSA) (איור 3), הנמצא בדרך כלל בבתי חולים ברחבי עולם 14. כמו כן, PRP יש מאפיינים מיקרוביאלית חזקים נגד methicillin הרגיש ס סטפילוקוקוס (MSSA), הקבוצה סטרפטוקוקוס, וNeisseria gonorrhoeae.

גישת צנטריפוגה פעמים מאפשרת רכישת PRP עם אותו ריכוז טסיות הדם (כלומר 2.0 x 10 6 טסיות / μl) אבל מרוכז (~ 10 פעמים מעל קו הבסיס בדם; איור 4) ומאפשרת לנו להשיג ממצאים מיקרוביאלית עקביים; אין הבדלים משמעותיים בממצאי CFU בין PRPs מבעלי חיים בודדים שונים (כלומר ארנבים) נצפו.

קבוצות PRP / PPP / PBS MHB MRSA בידוד
לשלוט אף לא אחד 1800 μl 200 μl
לשלוט אף לא אחד 2000 μl אף לא אחד
לשלוט PBS + תרומבין (200 μl) 1600 μl 200 μl
PPP PPP + תרומבין (200 μl) 1600 μl 200 μl
PRP PRP + תרומבין (200 μl) 1600 μl 200 μl

טבלת 1. דגימות ניסוי להערכה מיקרוביאלית של PRP.

ילדה = "jove_content" fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 1
איור 1. הכנת PRP באמצעות הליך צנטריפוגה פעמים. () צנטריפוגה הראשונה. לאחר צנטריפוגה הראשונה, שלוש שכבות נוצרות, ואת שתי שכבות העליונות (כלומר פלזמה ושכבות מעייל באפים) ו2-3 המ"מ של השכבה התחתונה (שכבת תאי דם האדום כלומר) מועברות לצינור צנטריפוגות סטרילי שני. (ב) צנטריפוגה השנייה. לאחר צנטריפוגה השנייה, שהשכבה העליונה הועברה למבחנה סטרילית חדשה ומיועדת כPPP. נותר מותאם עם PPP לריכוז הטסיות של 2.0 x 10 6 טסיות / μl ויועד כPRP.

איור 2
איור 2. ניסיון התקנה, להערכת propertie מיקרוביאליתהים של PRP באמצעות assay העקומה להרוג. ראשית, PRP או PPP מתווסף למבחנות, ויופעל באופן מיידי עם פתרון תרומבין. בשלב בא, MHB מתווסף אחרי inoculums חיידקיים. Aliquots של דגימות נלקחים בנקודתי זמן שונות ומצופה לספירת CFU.

איור 3
איור 3. PRP, PPP, או PBS ממוקמים בצינור קלקר 5 מ"ל סטרילי יחד עם תרומבין, MHB מרק, וMRSA בידוד ולאחר מכן הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסת הקפה ב 150 סל"ד. בנקודתי זמן שנקבעו מראש (1 כלומר ו 2 שעה), aliquots של דגימות נלקחים ומצופה לספירת CFU. () נתוני CFU ו( B) תמונות צלחת יציגה בדילול -2 10. ירידה משמעותית (~ 100-קפל ב2 שעות) של צמיחת MRSA מתקבלת usinגרם PRP השוואה לקבוצת ביקורת PPP ו-PBS. זה נכון לגבי חיידקים כמו MSSA, הקבוצה סטרפטוקוקוס, וNeisseria gonorrhoeae גם כן.

איור 4
איור 4. כתמי דם של דם מלא (משמאל) וPRP (מימין). PRP הוכנו מגישת צנטריפוגה פעמים יש ~ 10 פעמים את מספר טסיות הדם בהשוואה לכל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פלזמה טסיות דם עשיר כבר בשימוש יותר ויותר ליישומים קליניים בשל מאפייניה ריפוי המקדם 15-17. במחקר הנוכחי, PRP הוצג כגישה חדשה למניעת זיהום. PRP נמצא יש מאפיינים מיקרוביאלית חזקים נגד MRSA, MSSA, הקבוצה סטרפטוקוקוס, וNeisseria gonorrhoeae. היתרונות העיקריים של PRP, בהשוואה לטיפולים אנטיביוטיים קונבנציונליים, למניעת זיהום כוללים: (1) טיפולים אנטיביוטיים נוכחיים עומדים בפני אתגרים, כולל התנגדות דיווחה יותר ויותר אנטיביוטיקה 14,18-20. PRP יכול להיות חלופה מתקדמת בגלל חלבוני microbicidal טסיות (i) של PRP עשויים להחזיק נכסי chemotactic לתאים חיסוניים כגון נויטרופילים, מונוציטים ותאי T אשר ממלאים תפקידים חשובים בהגנה מפני פלישת פתוגן 21, וכן (ii) בהשוואה לאנטיביוטיקה קונבנציונלית, טסיות דם חלבוני microbicidal חשופים פחות לאניnducing עמידות חיידקים בשל קושי בשינוי מבני קרום חיידק 22. (2) PRP לא רק מפחית זיהומים אלא גם מקדם את ריפוי פצע, שניהם יקרים במונחים של טראומה, זמן וכסף.

PRP משך התעניינות מוגברת לאחרונה. עם זאת, ישנן וריאציות מורכבות רבות בקרב פרוטוקולי הכנה PRP כולל מספר ההתחלה של טסיות דם, שימוש בתרופות נגד קרישת דם, הכללתו של לויקוציטים, והשימוש של מפעילים 23-27. הווריאציה בהכנת PRP תורמת בחלקו לתוצאות השנויות במחלוקת בבעלי חיים והן מחקרים קליניים 28. כתוצאה מכך, בעיה גדולה עבור מחקרי PRP היא לשלוט הווריאציה. במחקר הנוכחי, גישת צנטריפוגה פעמים בוצעה, וריכוז הטסיות של PRP היה קבוע בשעת 2 x 10 6 טסיות / μl (~ 10 פעמים מעל קו הבסיס בדם) כדי לתקן את פרוטוקול הכנת PRP ולהגביל את ההשתנותבהכנת PRP. גישת צנטריפוגה הפעמים הציגו היא פשוטה, יכול להיות מיושמים בקלות לבידודה של PRP מן הדם של בעלי חיים אחרים ובני אדם, וביאה לעקבית במאפיינים מיקרוביאלית מבחנה של הארנב PRP במחקר הנוכחי. עם זאת, הבדלים עשויים עדיין קיימים מאז גורמי הצמיחה וכימיקלים אחרים בתוך או שוחררו מטסיות דם עשוי להשתנות בין תאים וחיות בודדים; כמה אוכלוסיות תאים (יקוציט למשל) לא היו בשליטה. שים לב שPRP יקוציט העשיר היה מוכן ושמש במחקר זה, שכן בתאי דם לבנים מעורבים בהרג חיידקים ישירים ואנטיגן ספציפי לתגובה חיסונית. הפרוטוקולים יכולים להיות שונים יותר להשיג PRP יקוציט עני על ידי ביצוע צנטריפוגה השנייה של רק השכבה העליונה (כלומר פלזמה וחלק טסיות דם) לאחר צנטריפוגה 1 (איור 1).

במחקר זה, דם כל 50 מ"ל נעשה שימוש כדי להשיג כ 5 המ"ל PRP. אם נפח דם הוא דאגה, דם נקווה מחיות מרובות ניתן להשתמש כדי להכין PRP. אם טופס קרישי דם במהלך תיקו ו / או צנטריפוגה, סביר להניח כמה טסיות מופעלים אשר יביא תשואת טסיות נמוכה. לכן, תרופות נגד קרישת דם מספקות ועדינים אך יסודי ערבוב הם צעדים חשובים לבידוד PRP מוצלח.

PRP הופעל באמצעות תרומבין במחקר הנוכחי. גישות אחרות, כולל סידן כלוריד, תרומבין אקסוגני או עצמי עם או בלי סידן כלוריד, לחץ מכאני (צנטריפוגה מהירות גבוהה נוספת), וbatroxobin יכולות להיות מיושמות גם עבור הפעלת PRP 29-32. שים לב שטסיות דם מופעלות על ידי תרומבין צפוי עשויות לשחרר את תוכן גרגרן הרבה יותר מהר מאשר טסיות מופעלות על ידי כימיקלים אחרים. הסיבה היא, שמלבד יכולתה להמיר גורם XI לשיה, שמיני לVIIIa, V לVa, ופיברינוגן לפיברין, תרומבין יכול לקדם הפעלה וטסיות דם דרךctivation של קולטני פרוטאז הופעל-על קרומי תאי הטסיות 33-35.

Assay העקומה להרוג הוצג להעריך בפעילות מיקרוביאלית במבחנה של PRP. בניגוד לבדיקת דיפוזיה הדיסק אגר, assay העקומה להרוג מאפשר הערכה כמותית של קצב פעילות bactericidal לאורך זמן. צעד קריטי אחד לפיזור חיידקים כראוי כאשר ספירת CFUs היא לערבב את כל התרבות ביסודיות על ידי pipetting הנמרץ לפני המדגם וvortexed לדילולים סידוריים, כPRP ג'ל מאי לבלבל את יכולתו של אדם לפיזור חיידקים כראוי.

פלזמה בסך הכל, טסיות דם עשירה יש מאפיינים מיקרוביאלית חזקים נגד חיידקים כגון ס aureus, קבוצת סטרפטוקוקוס, וNeisseria gonorrhoeae. חוץ מהמאפיינים שלה, למדו היטב ריפוי המקדם, PRP עשוי לשמש כגישה חדשה למניעת זיהומים הקשורים שתל. המנגנון של המאפיינים מיקרוביאלית של PRP הוא שלעד לא ידועות וחקירות נוספות בתחום זה יש צורך.

מגבלות המחקר כוללות שPRP לא לחסל את החיידקים באופן מלא בתנאי הניסוי שלנו (1 x 10 5 CFU / מ"ל). זה יכול להיות בגלל הרעילות הגבוהה של זני החיידקים הקליניים שלנו ששמשו; 1 x 10 2 CFU (0.1 מ"ל) של ס ' סטפילוקוקוס גרם זיהומים קשים בחי 36-38. לחלופין, הסכום של PRP ניתן להעלות להשגת חיסול חיידקים טובים יותר, או יכול לשמש יחד PRP עם מנהל מערכתי או מקומי באנטיביוטיקה למניעת זיהום קונבנציונלית; ההשפעות הכפולות (כלומר מיקרוביאלית ותכונות ריפוי מקדם) של PRP יכול להיות יתרון בקידום ריפוי תוך מניעת זיהום. מגבלה נוספת היא שPRP לא אמור לשמש לחולים שכבר היו מערכתי נגוע (חולי אלח דם לדוגמה). הסיבה לכך היא חיידקים בדם עשויים להיות עובריםאד על מPRP לאתר אלא אם כן יישום טכניקות עיקור מתאימות מוחלות. אנו ממליצים בחינה מדוקדקת של זיהומים חיידקיים אפשריים של PRP לפני השימוש בו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים Therwa חמזה, John E. Tidwell, נינה קלוביס, וסוזן סמית לסיוע ניסיוני וסוזן סמית להגהה. המחברים גם להודות לג'ון תומאס, PhD למתן הקליני מבודדי החיידקים וג'ון ב 'ברנט, דוקטורט על תמיכתו ואת השימוש במעבדת הבטיחות הביולוגית במחלקה למיקרוביולוגיה, אימונולוגיה וביולוגיה של תא באוניברסיטת מערב וירג'יניה. החוקרים מכירים בתמיכה כספית מOsteosynthesis וטראומת טיפול הקרן והקרן לאומית למדע (# 1003907). ניסויי מיקרוסקופ וניתוח תמונה בוצעו גם במתקן אוניברסיטת מערב וירג'יניה ההדמיה, אשר נתמך בחלקו על ידי מרי אב רנדולף מרכז הסרטן והמענק NIH P20 RR016440.

שימוש בבעלי חיים לדם מושך אושרו על ידי הטיפול באוניברסיטת מערב וירג'יניה המוסדי ובעלי חי ועדת שימוש. כל הניסויים בוצעו בעמידה בכל guidelin הרלוונטיes, תקנות, וגופים רגולטוריים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine thrombin King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 Thrombin (bovine origin)
Calcium chloride King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 10% calcium chloride
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Isoflurane Baxter 1001936060
Mueller Hinton broth Becton, Dickinson and Company 275710
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8662
Tri-sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Tryptic soy agar Fisher Scientific R01202
Centrifuge Kendro Laboratory Products 750043077
Syringe filter Millipore SLGP033RS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gristina, A. G. Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration. Science. 237, 1588-1595 (1987).
  2. Gristina, A. G., Costerton, J. W. Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis. J. Bone Joint Surg. Am. 67, 264-273 (1985).
  3. Everts, P. A., et al. Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery. Eur. Surg. Res. 39, 199-207 (2007).
  4. Marx, R. E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP. Implant. Dent. 10, 225-228 (2001).
  5. Toscano, N., Holtzclaw, D. Surgical considerations in the use of platelet-rich plasma. Compend. Contin. Educ. Dent. 29, 182-185 (2008).
  6. Cieslik-Bielecka, A., Gazdzik, T. S., Bielecki, T. M., Cieslik, T. Why the platelet-rich gel has antimicrobial activity? Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 103, 303-306 (2007).
  7. Yeaman, M. R. The role of platelets in antimicrobial host defense. Clin. Infect. Dis. 25, 951-970 (1997).
  8. Tang, Y. Q., Yeaman, M. R., Selsted, M. E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infect Immun. 70, 6524-6533 (2002).
  9. El-Sharkawy, H., et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties. J. Periodontol. 78, 661-669 (2007).
  10. Krijgsveld, J., et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines. J. Biol. Chem. 275, 20374-20381 (2000).
  11. Trowbridge, C. C., et al. Use of platelet gel and its effects on infection in cardiac surgery. J. Extra Corpor. Technol. 37, 381-386 (2005).
  12. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface. Med. Prog. Technol. 14, 205-224 (1988).
  13. Subbiahdoss, G., Kuijer, R., Grijpma, D. W., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Microbial biofilm growth vs. tissue integration: "the race for the surface" experimentally studied. Acta Biomater. 5, 1399-1404 (2009).
  14. Klevens, R. M., et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 298, 1763-1771 (2007).
  15. Foster, T. E., Puskas, B. L., Mandelbaum, B. R., Gerhardt, M. B., Rodeo, S. A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am. J. Sports Med. 37, 2259-2272 (2009).
  16. Carlson, N. E., Roach, R. B. Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry. J. Am. Dent. Assoc. 133, 1383-1386 (2002).
  17. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237 (2001).
  18. Fridkin, S. K., et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin. Infect. Dis. 36, 429-439 (1997).
  19. Jackson, C. R., Fedorka-Cray, P. J., Davis, J. A., Barrett, J. B., Frye, J. G. Prevalence, species distribution and antimicrobial resistance of enterococci isolated from dogs and cats in the United States. J. Appl. Microbiol. 107, 1269-1278 (2009).
  20. Murray, C. K., et al. Recovery of multidrug-resistant bacteria from combat personnel evacuated from Iraq and Afghanistan at a single military treatment facility. Mil. Med. 174, 598-604 (2009).
  21. Durr, M., Peschel, A. Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense. Infect Immun. 70, 6515-6517 (2002).
  22. Hancock, R. E. Peptide antibiotics. Lancet. 349, 418-422 (1997).
  23. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27, 158-167 (2009).
  24. Kalen, A., Wahlstrom, O., Linder, C. H., Magnusson, P. The content of bone morphogenetic proteins in platelets varies greatly between different platelet donors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375, 261-264 (2008).
  25. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J. Craniomaxillofac. Surg. 30, 97-102 (2002).
  26. Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 97, 110-118 (2009).
  27. Lei, H., Gui, L., Xiao, R. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin. Biochem. 42, 1452-1460 (2009).
  28. Redler, L. H., Thompson, S. A., Hsu, S. H., Ahmad, C. S., Levine, W. N. Platelet-rich plasma therapy: a systematic literature review and evidence for clinical use. Phys. Sportsmed. 39, 42-51 (2011).
  29. Whitman, D. H., Berry, R. L., Green, D. M. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. J. Oral Maxillofac. Surg. 55, 1294-1299 (1997).
  30. Anitua, E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int. J. Oral Maxillofac. Implants. 14, 529-535 (1999).
  31. Whitman, D. H., Berry, R. L. A technique for improving the handling of particulate cancellous bone and marrow grafts using platelet gel. J. Oral. Maxillofac. Surg. 56, 1217-1218 (1998).
  32. Currie, L. J., Sharpe, J. R., Martin, R. The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review. Plast. Reconstr. Surg. 108, 1713-1726 (2001).
  33. Nikulin, A. A. Effect of calcium, thrombin and nucleotides (ADP, cAMP, cGMP) on blood platelet glycolysis and energy metabolism. Farmakol. Toksikol. 43, 585-590 (1980).
  34. Hantgan, R. R., Taylor, R. G., Lewis, J. C. Platelets interact with fibrin only after activation. Blood. 65, 1299-1311 (1985).
  35. Hantgan, R., Fowler, W., Erickson, H., Hermans, J. Fibrin assembly: a comparison of electron microscopic and light scattering results. Thromb. Haemost. 44, 119-124 (1980).
  36. Li, B., Jiang, B., Boyce, B. M., Lindsey, B. A. Multilayer polypeptide nanoscale coatings incorporating IL-12 for the prevention of biomedical device-associated infections. Biomaterials. 30, 2552-2558 (2009).
  37. Li, B., Jiang, B., Dietz, M. J., Smith, E. S., Clovis, N. B., Rao, K. M. K. Evaluation of local MCP-1 and IL-12 nanocoatings for infection prevention in open fractures. J. Orthop. Res. 28, 48-54 (2010).
  38. Boyce, B. M., Lindsey, B. A., Clovis, N. B., Smith, E. S., Hobbs, G. R., Hubbard, D. F., Emery, S. E., Barnett, J. B., Li, B. Additive effects of exogenous IL-12 supplementation and antibiotic treatment in infection prophylaxis. J. Orthop. Res. 30 (2), 196-202 (2012).

Tags

זיהום גיליון 74 מחלות זיהומיות אימונולוגיה מיקרוביולוגיה רפואה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית זיהומים חיידקיים וMycoses מחלות שרירים ושלד גורמים ביולוגיים פלזמה טסיות דם עשיר זיהום חיידקים מיקרוביאלית להרוג assay העקום, דם תאים טכניקות לבודד קליניות קליניות
PRP כגישה חדשה למניעת זיהום: הכנה ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מאפיינים מיקרוביאלית של PRP
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Li, B. PRP as a New Approach … More

Li, H., Li, B. PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP. J. Vis. Exp. (74), e50351, doi:10.3791/50351 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter