Summary
Implante asociada a la infección es una complicación clínica significativa. Este estudio describe un enfoque utilizando plasma rico en plaquetas (PRP) para prevenir infecciones relacionados con el implante, presenta el protocolo para la preparación de PRP con concentración de plaquetas constante, e informa de las propiedades antimicrobianas de los recientemente identificados PRP y protocolos relacionados para examinar tales propiedades antimicrobianas
Abstract
Implante infección asociada se está volviendo más y más difícil para la industria de la salud en todo el mundo debido a la creciente resistencia a los antibióticos, la transmisión de bacterias resistentes a antibióticos entre animales y seres humanos, y el alto costo de tratamiento de las infecciones.
En este estudio, se describen una nueva estrategia que puede ser eficaz en la prevención de las infecciones relacionadas con implante basado en las propiedades antimicrobianas potenciales de plasma rico en plaquetas (PRP). Debido a sus propiedades bien estudiados para promover la curación, PRP (un producto biológico) ha sido cada vez más utilizado para aplicaciones clínicas, incluyendo cirugías ortopédicas, cirugía periodontal y oral, cirugías maxilofaciales, cirugías plásticas, medicina deportiva, etc
PRP podría ser una alternativa avanzada a los tratamientos convencionales con antibióticos para prevenir las infecciones asociadas a implantes. El uso de PRP puede ser ventajoso en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos SINCE PRP es menos probable que induzca resistencia a los antibióticos y PRP antimicrobiana y propiedades curativas que promueven puede tener un efecto sinérgico en la prevención de infecciones. Es bien conocido que los agentes patógenos y las células humanas están compitiendo por superficies de los implantes, y PRP propiedades de curación promoción podría mejorar la unión celular humana reduciendo así las probabilidades de infección. Además, el PRP es inherentemente biocompatible, seguro y libre de riesgo de las enfermedades transmisibles.
Para nuestro estudio, hemos seleccionado varias cepas clínicas de bacterias que se encuentran comúnmente en las infecciones ortopédicas y examinó si PRP tiene propiedades in vitro antimicrobianos contra estas bacterias. Hemos preparado PRP utilizando un enfoque de centrifugación dos veces, que permite la concentración de plaquetas mismo que debe obtenerse para todas las muestras. Hemos logrado resultados consistentes antimicrobianos y se ha encontrado que el PRP tiene fuerte propiedades in vitro antimicrobianos contra bacterias como methicillin sensible a la meticilina y resistentes a Staphylococcus aureus, Streptococcus del Grupo A, y Neisseria gonorrhoeae. Por lo tanto, la utilización de PRP puede tener el potencial para prevenir la infección y reducir la necesidad de un costoso tratamiento post-operatorio de infecciones relacionados con el implante.
Introduction
Implante asociada a la infección es una complicación clínica significativa. Staphylococcus aureus (S. aureus) es uno de los microorganismos más comunes aislados de infecciones relacionados con el implante. Es capaz de producir una biopelícula que recubre las superficies de implantes y puede conducir a 1,2 infección resistente a antibióticos. El tratamiento de las infecciones asociadas a implantes con frecuencia requiere hospitalización a largo plazo para desbridamientos repetidos y prolongados de terapia antibiótica parenteral. En los casos resistentes a antibióticos, la extracción del implante puede ser necesario. La creciente resistencia de las bacterias a los antibióticos también se ha referido a los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) como "uno de los problemas de salud del mundo más urgentes." Con el tiempo, sin el desarrollo de tratamientos antimicrobianos nuevos y eficaces, es posible que los fármacos múltiples patógenos resistentes será intratable con los antibióticos convencionales. Prevención de implante asociadoinfección es por lo tanto importante y nuevos agentes profilácticos o enfoques son necesarios para la prevención de tales infecciones.
Plasma rico en plaquetas (PRP) es una concentración de sangre autóloga que contiene más de 30 factores de crecimiento que pueden ayudar con la curación del hueso y de injerto de hueso 3-5. La aplicación de PRP para la reconstrucción ósea y maduración del tejido blando se ha informa cada vez más en las clínicas debido a su alta concentración de diversos factores de crecimiento liberados por las plaquetas.
Varias características de PRP PRP indican que también pueden tener propiedades antimicrobianas 6-9. PRP contiene un gran número de plaquetas, una alta concentración de leucocitos (que puede poseer defensa del huésped-acciones contra bacterias y hongos), y varios péptidos antimicrobianos 7,8,10. En un estudio reciente de una gran cohorte de pacientes quirúrgicos cardíacos, se reveló que el uso intraoperatorio de PRP-gel durante el cierre de la herida significativamente disminuyó la incidencia de infección esternón superficial y profunda 11. Por estas razones y observaciones, la hipótesis de que el PRP, además de sus bien estudiadas promueven la curación de las propiedades, tiene propiedades antimicrobianas. Las ventajas potenciales de la utilización de PRP para prevenir la infección pueden incluir: (i) PRP es menos probable que induzca resistencia en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos. (Ii) PRP también tiene propiedades que favorecen la cicatrización que puede tener un efecto sinérgico en la prevención de infecciones; curación promotoras de PRP de propiedades podrían proporcionar un sello para evitar la adhesión bacteriana reduciendo así las probabilidades de infección por los patógenos y las células humanas están compitiendo para superficies de implante 12 , 13. (Iii) PRP es inherentemente biocompatible, seguro y libre de riesgo de las enfermedades transmisibles.
Nuestro objetivo a largo plazo es el uso de PRP como un nuevo enfoque para prevenir implante asociada infections. El objetivo de este estudio fue la preparación de PRP utilizando un enfoque de centrifugación dos veces, para examinar PRP en propiedades antimicrobianas in vitro, y para describir los protocolos para evaluar tales propiedades antimicrobianas.
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Protocol
1. Preparación y activación de PRP
1.1 Extracción de sangre
- Anestesiar conejo por inhalación de isoflurano (2% en O 2 para la inducción y 1% para el mantenimiento).
- Dibujar 2 ml 0,129 M citrato trisódico (una solución anticoagulante) en una jeringa de 20 ml. La solución de citrato tri-sódico se prepara disolviendo 1,897 g de tri-citrato de sodio en 50 ml de H 2 O destilada y filtrar con un filtro de 0,22 micras estéril.
- Esterilizar la oreja del conejo utilizando 70% de etanol.
- Extraer la sangre (por ejemplo, 5 ml) de la vena de la oreja de conejo a través de una aguja de mariposa (25 G) conectado a la jeringa.
- Mezclar la sangre con la solución de citrato de tri-sodio por agitación suave. La relación de volumen de sangre y tri-sodio solución de citrato es de 9:1.
1,2 PRP preparación (Figura 1)
- Transferir la sangre anticoagulada a un tubo de 50 ml de centrífuga de plástico. Tomar una alícuota de 10 lde sangre para determinar el recuento de plaquetas basal utilizando hemocitometría.
- Se centrifuga la sangre a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT) en una centrífuga con un rotor basculante. Establecer la aceleración y la velocidad de frenado a baja (Figura 1).
- Después de la centrifugación, la sangre se separa en tres capas. La capa inferior es principalmente células de la sangre rojas, la capa media (comúnmente conocido como la "capa leucocitaria") se compone de concentrados de plaquetas y leucocitos, y la capa superior es principalmente plasma, que es el componente líquido de la sangre, y las plaquetas ( Figura 1). Transportar con cuidado el tubo de centrífuga a una campana de cultivo de células; no molestar las capas. Transferir todo el plasma, capa leucocitaria, y 2-3 mm de espesor capa de glóbulos rojos en un tubo de plástico de 15 ml usando una pipeta de 1 ml de plástico.
- Centrifugar la muestra transferida por segunda vez a 3.000 xg durante 15 min a TA. La capa superior (sobrenadante) se considera plasma pobre en plaquetas (PPP) und es transferido a un nuevo tubo.
- Obtener PRP mediante el ajuste de la concentración de plaquetas en la muestra de sangre restante utilizando PPP para obtener 2,0 x 10 6 plaquetas / l (determinado por hemocitometría).
1,3 PRP activación
- Preparar la solución de PRP activación mediante la disolución de 5.000 IU trombina bovina con 5 ml de cloruro de calcio 10% a la concentración de trabajo de 1.000 UI / ml.
- Añadir la solución de activación de PRP y PPP, y mezcle la solución pipetear repetidamente para formar PRP y PPP-geles. La relación en volumen de la solución de activación de PRP o PPP es de 1:4.
2. Prueba in vitro a los antimicrobianos de PRP usando el ensayo de Kill curva (Figura 2)
- El uso de un asa de inoculación estéril, añadir varias colonias de S. aureus a partir de su cultivo en placa durante la noche en 5 ml de caldo Mueller Hinton (MHB) en un tubo de plástico. Vórtice brevemente y luego incubar la muestra durante 2 horas a 37 ° C. Próximo, La densidad óptica de los medios de comunicación bacteriana se determinó utilizando un espectrofotómetro y se ajustó a una densidad óptica igual a ~ 1 x 10 8 UFC / ml en base a la curva estándar predeterminado.
- Hacer una dilución de 100 veces utilizando PBS para obtener 1 x 10 6 UFC / ml y colocar el inóculo en hielo.
- Configurar y etiquetar estériles, desechables 5 ml de fondo redondo tubos de poliestireno, y preparar los siguientes grupos de la muestra como se indica en la Tabla 1 para un volumen final de 2 ml en cada tubo.
- Añadir PRP, PPP, o PBS primero a los tubos de poliestireno, seguido por la solución de trombina para la activación (formación de gel). A continuación, agregue MHB y luego la S. inóculos aureus (1 x 10 6 UFC / ml) para obtener la concentración final de 1 x 10 5 UFC / ml.
- Incubar los tubos a 37 ° C con agitación orbital a 150 rpm.
- En los puntos de tiempo predeterminados (por ejemplo, 0, 1, y h 2), mezclar las soluciones en cada tubo mediante pipeteo repetido (estepaso es importante ya que las bacterias pueden ser atrapados dentro del gel de PRP). Tomar 10 l de muestra, diluir en serie con una solución salina estéril al 0,9%, y pipetear una parte alícuota de 100 l de cada dilución en placas en un agar de tripticasa de soja (TSA, con sangre de oveja al 5%) para el recuento de CFU placa.
- Cultura las placas de agar durante la noche a 37 º C, y luego contar y registrar las colonias de las placas. Representan los datos en una escala logarithimic con el tiempo (hr) en el eje X y UFC / ml en el eje y.
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Representative Results
PRP se preparó reproducible utilizando un enfoque de centrifugación dos veces (Figura 1). PRP se encuentra a presentar fuerte (hasta 100-veces la reducción de UFC) en las propiedades antimicrobianas in vitro contra S. aureus resistente aureus (MRSA) (Figura 3), que se encuentra comúnmente en los hospitales de todo el mundo 14. Del mismo modo, el PRP tiene fuertes propiedades antimicrobianas en contra de estafilococos sensibles S. aureus (MSSA), Streptococcus del grupo A, y Neisseria gonorrhoeae.
El enfoque de centrifugación dos veces permite la adquisición de PRP con la misma concentración de plaquetas (es decir, 2,0 x 10 6 plaquetas / l) pero concentrado (~ 10 veces por encima de la línea de base en sangre; Figura 4) y permite obtener resultados consistentes antimicrobianos, sin diferencias significativas en los resultados de UFC entre los PPR de diferentes animales (es decir,conejos) se han observado.
| Grupos | PRP / PPP / PBS | MHB | MRSA inóculo |
| Controle | Ninguno | 1.800 l | 200 l |
| Controle | Ninguno | 2.000 l | Ninguno |
| Controle | PBS + trombina (200 l) | 1.600 l | 200 l |
| PPP | PPP + trombina (200 l) | 1.600 l | 200 l |
| PRP | PRP + trombina (200 l) | 1.600 l | 200 l |
Tabla 1. Las muestras experimentales para la evaluación antimicrobiana de PRP.
Figura 1. Preparación de PRP utilizando un procedimiento de centrifugación dos veces. (A) primera centrifugación. Después de la primera centrifugación, tres capas están formadas, y las dos capas superiores (es decir, plasma y las capas de la capa leucocitaria) y 2-3 mm de la capa inferior (es decir, sangre roja capa de células) se transfieren a un tubo de centrífuga estéril segundos. (B) Segunda centrifugación. Después de la segunda centrifugación, la capa superior se transfirió a un nuevo tubo estéril y designado como PPP. El restante se ajustó con PPP hasta una concentración de plaquetas de 2,0 x 10 6 plaquetas / l y designado como PRP.
Figura 2. Montaje experimental para la evaluación de la antimicrobiano properties de PRP usando el ensayo de curva kill. Primero, PRP o PPP se añade a los tubos de ensayo, y activa inmediatamente con solución de trombina. A continuación, se añade MHB seguido de inóculos bacterianos. Las alícuotas de las muestras se toman en diferentes puntos temporales y se sembraron para el recuento de CFU.
Figura 3. PRP, PPP, o PBS se colocan en un tubo de poliestireno estéril de 5 ml junto con la trombina, el caldo de MHB, y el inóculo MRSA y se incubaron a continuación a 37 ° C con agitación orbital a 150 rpm. En los puntos de tiempo predeterminados (es decir, 1 y 2 hr), alícuotas de las muestras se toman y se colocaron para el recuento de UFC. (A) Los datos de UFC y (B) Imágenes representativas de placas a 10 dilución -2. Reducción significativa (~ 100 veces a las 2 h) del crecimiento MRSA se obtiene using PRP en comparación con los controles PPP y PBS. Esto es cierto para las bacterias como MSSA, estreptococo del grupo A, y Neisseria gonorrhoeae también.
Figura 4. Frotis de sangre de sangre completa (izquierda) y PRP (a la derecha) de PRP. Preparados a partir de la centrifugación dos veces enfoque tiene ~ 10 veces el número de plaquetas en comparación con la sangre entera.
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Discussion
Plasma rico en plaquetas se ha usado cada vez más para aplicaciones clínicas debido a sus propiedades de promoción de la cicatrización 15-17. En el presente estudio, el PRP se presenta como un nuevo enfoque para la prevención de infecciones. PRP se encontró que tienen fuertes propiedades antimicrobianas contra MRSA, MSSA, estreptococo del grupo A, y Neisseria gonorrhoeae. Las principales ventajas de PRP, en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos para la prevención de la infección incluyen: (1) Las actuales terapias antibióticas se enfrentan a retos cada vez más informado, incluyendo la resistencia antibiótica 14,18-20. PRP podría ser una alternativa avanzada porque plaquetas proteínas microbicidas (i) PRP puede poseer propiedades quimiotácticas para células inmunitarias tales como neutrófilos, monocitos y células T que juegan un papel importante en la defensa contra la invasión de patógenos 21, y (ii) en comparación con los antibióticos convencionales, plaquetas proteínas microbicidas son menos propensos a inducing resistencia bacteriana debido a la dificultad de cambiar las estructuras bacterianas de membrana 22. (2) PRP no sólo reduce las infecciones, pero también promueve la cicatrización de heridas; tanto son costosos en términos de traumatismo, el tiempo y dinero.
PRP recientemente ha atraído mayor interés. Sin embargo, hay numerosas variaciones complejas entre los protocolos de preparación de PRP incluyendo el número de partida de las plaquetas, el uso de anticoagulantes, la inclusión de los leucocitos, y el uso de activadores 23-27. La variación en la preparación de PRP contribuye en parte a los resultados controvertidos tanto en animales y estudios clínicos 28. Como resultado de ello, un gran problema para los estudios de PRP es el control de la variación. En el estudio actual, un enfoque centrifugación se realizó dos veces, y la concentración de plaquetas del PRP fue fijado en 2 x 10 6 plaquetas / l (~ 10 veces por encima de la línea de base en la sangre) para estandarizar el protocolo de preparación de PRP y para limitar la variabilidaden la preparación de PRP. El enfoque de centrifugación dos veces presentado es simple, puede ser aplicado fácilmente para el aislamiento de PRP de la sangre de otros animales y seres humanos, y ha conducido a propiedades consistentes en antimicrobiana in vitro de conejo PRP en el presente estudio. Sin embargo, las diferencias todavía puede existir ya que los factores de crecimiento y otros productos químicos dentro o liberado de las plaquetas puede variar entre las células individuales y los animales; algunas poblaciones de células (por ejemplo, leucocitos) no fueron controlados. Tenga en cuenta que rico en leucocitos PRP fue preparado y utilizado en este estudio, ya que los leucocitos están implicados en muerte directa de bacterias y antígenos específicos de la respuesta inmune. Los protocolos pueden modificarse aún más para obtener leucocitos pobre PRP mediante la realización de una segunda centrifugación de sólo la capa superior (es decir, plasma y plaquetas porción) después de la primera centrifugación (Figura 1).
En este estudio, 50 ml de sangre entera se usó para obtener aproximadamente 5 ml de PRP. Si el volumen de sangre es una preocupación, sangre combinada de múltiples animales pueden ser utilizados para preparar PRP. Si se forman coágulos durante la extracción de sangre y / o centrifugación, más probable es que algunas se activan las plaquetas que se traducirá en un rendimiento bajo de plaquetas. Por lo tanto, los anticoagulantes suficientes y una buena mezcla suave pero son pasos importantes para el aislamiento PRP éxito.
El PRP se activa mediante la trombina en el presente estudio. Otros enfoques, incluyendo cloruro de calcio, la trombina exógena o autólogas con o sin cloruro de calcio, el estrés mecánico (centrifugación adicional de alta velocidad), y batroxobina se puede aplicar también para la activación del PRP 29-32. Tenga en cuenta que las plaquetas activadas por trombina probablemente puede liberar sus contenidos granulares mucho más rápido que las plaquetas activadas por otros productos químicos. La causa es que, además de su capacidad para convertir el factor XI a XIa, VIII a VIIIa, V en Va, y el fibrinógeno en fibrina, la trombina puede promover la activación y agregación plaquetaria a través de unctivation de los receptores activados por proteasa en las membranas celulares de plaquetas 33-35.
El ensayo de curva de interrupción se presentó para evaluar la actividad antimicrobiana in vitro de PRP. A diferencia del ensayo de difusión en agar disco, el ensayo de curva de interrupción permite la evaluación cuantitativa de la tasa de la actividad bactericida en el tiempo. Un paso crítico para dispersar adecuadamente bacterias al contar las UFC es mezclar todo el cultivo a fondo por pipeteo vigoroso antes de que la muestra se extrae y se agitaron para diluciones en serie, como PRP gel que puede interferir en la capacidad para dispersar adecuadamente bacterias.
En general, plasma rico en plaquetas tiene fuertes propiedades antimicrobianas contra bacterias tales como S. aureus, Streptococcus Grupo A, y Neisseria gonorrhoeae. Además de sus bien estudiadas propiedades que promueven la curación, el PRP puede servir como un nuevo enfoque para prevenir infecciones relacionados con el implante. El mecanismo de las propiedades antimicrobianas de PRP es shasta que las investigaciones desconocidas y aún más en este campo son necesarios.
Las limitaciones de este estudio incluyen que el PRP no acababa de eliminar la bacteria en las condiciones experimentales (1 x 10 5 UFC / ml). Esto puede ser debido a la alta virulencia de nuestras cepas bacterianas clínicas que se utilizan; 1 x 10 2 UFC (0,1 ml) de S. aureus inducida infecciones graves in vivo 36-38. Alternativamente, la cantidad de PRP se puede aumentar para conseguir una mejor eliminación bacteriana, o PRP se puede utilizar junto con la administración sistémica o local de antibióticos convencionales para la prevención de infecciones; el doble efecto (es decir, antimicrobiana y propiedades curativas promotoras) de PRP puede ser ventajoso en la promoción de la curación mientras que la prevención de la infección. Otra limitación es que el PRP no debe utilizarse en pacientes que ya han sido infectadas sistémicamente (por ejemplo, pacientes con sepsis). Esto se debe a bacterias en la sangre pueden ser de pasoed de PRP en el lugar de aplicación a menos que las técnicas adecuadas de esterilización son aplicadas. Se recomienda un cuidadoso examen de las posibles contaminaciones bacterianas de PRP antes de su uso.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Therwa Hamza, John E. Tidwell, Clovis Nina, y Suzanne Smith para la asistencia experimental y Suzanne Smith para corrección de pruebas. Los autores también agradecen a John Thomas, PhD para la prestación de los aislados bacterianos clínicos y John B. Barnett, PhD, por su apoyo y el uso del laboratorio de seguridad biológica en el Departamento de Microbiología, Inmunología y Biología Celular en la Universidad de Virginia Occidental. Los autores agradecen el apoyo financiero de la Osteosíntesis y Trauma Care Foundation y la National Science Foundation (# 1003907). Microscopio experimentos y análisis de imagen se realizaron también en el West Virginia University Fondo Imaging, que es apoyado en parte por el Mary Babb Randolph Cancer Center y el NIH subvención P20 RR016440.
El uso de animales para la extracción de sangre fueron aprobados por el Cuidado de Animales Universidad West Virginia institucional y el empleo. Todos los experimentos fueron ejecutadas en conformidad con todas las guidelin relevanteEs, regulaciones y agencias reguladoras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine thrombin | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | Thrombin (bovine origin) |
| Calcium chloride | King Pharmaceuticals, Inc | 60793-215-05 | 10% calcium chloride |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Mueller Hinton broth | Becton, Dickinson and Company | 275710 | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | R01202 | |
| Centrifuge | Kendro Laboratory Products | 750043077 | |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RS |
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