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Bioengineering

आम तरल हैंडलिंग रोबोट पर TruTip प्रौद्योगिकी का उपयोग कर नैदानिक ​​नमूनों से डीएनए और आरएनए के उच्च throughput, स्वचालित निष्कर्षण

Published: June 11, 2013 doi: 10.3791/50356
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 3, 4
1Application Development, Akonni Biosystems, Inc., 2Manufacturing, Akonni Biosystems, Inc., 3Engineering, Akonni Biosystems, Inc., 4Research & Development, Akonni Biosystems, Inc.

Summary

TruTip एक झरझरा, अखंड बंधन मैट्रिक्स एक विंदुक टिप में डाला जाता है जिससे एक सरल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रौद्योगिकी है. नतीजतन, नमूना तैयार प्रारूप सबसे अधिक तरल से निपटने के साधन के साथ संगत है, और उच्च throughput नैदानिक ​​अनुप्रयोगों और नमूना प्रकार के लिए कई माध्यम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

TruTip एक झरझरा, अखंड बंधन मैट्रिक्स एक विंदुक टिप में डाला जाता है जिससे एक सरल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रौद्योगिकी है. केवल पत्थर का खंभा की ज्यामिति 1.0 से 5.0 मिलीग्राम की मात्रा में लेकर विशिष्ट पिपेट सुझाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. केवल पत्थर का खंभा के बड़े सरंध्रता आसानी न्यूनतम fluidic backpressure साथ के माध्यम से इसे पारित करने के लिए चिपचिपा या जटिल नमूने लिए सक्षम बनाता है. द्विशताब्दी दिशात्मक प्रवाह केवल पत्थर का खंभा और नमूना के बीच निवास समय अधिकतम हो पाता है, और एक भी TruTip भीतर संसाधित करने के लिए बड़ा नमूना संस्करणों में सक्षम बनाता है. चाहे नमूना मात्रा या TruTip ज्यामिति के मौलिक कदम,, सेल, TruTip केवल पत्थर का खंभा के भीतर pores के लिए बाध्य न्यूक्लिक एसिड, अबाध नमूना घटकों और सेल बफ़र्स दूर धोने, और एक उचित बफर में शुद्ध और केंद्रित न्यूक्लिक एसिड eluting शामिल हैं. TruTip की विशेषताओं और अनुकूलन क्षमता एक Eppendorf epMotion 5070 का उपयोग कर तीन स्वचालित नैदानिक ​​नमूना प्रसंस्करण प्रोटोकॉल में प्रदर्शन कर रहे हैं, हैमिल्टन स्टार और nasopharyngeal aspirate, पूरे रक्त से जीनोमिक डीएनए अलगाव, और भ्रूण डीएनए निष्कर्षण और मातृ प्लाज्मा की बड़ी मात्रा में (क्रमशः) से संवर्धन से शाही सेना अलगाव सहित STARplus तरल से निपटने रोबोट,.

Introduction

न्यूक्लिक एसिड शुद्धि सबसे आणविक निदान के लिए, अनुसंधान केवल उपयोग आवश्यक है, और जीवन विज्ञान अनुप्रयोगों. विभिन्न दृष्टिकोण क्लोरोफॉर्म / फिनोल एक्सट्रेक्शन के समय के बाद उभरा है, जिनमें से कई chaotropic लवण 1 की उपस्थिति में सिलिका के लिए बाध्य न्यूक्लिक एसिड के मौलिक सिद्धांत पर आधारित हैं. निष्कर्षण प्रक्रिया (2-13 में उदाहरण देखें) स्पिन फिल्टर, चुंबकीय मोतियों और जीवन विज्ञान उद्योग हावी संबंधी दृष्टिकोण के साथ, विभिन्न मनका और झिल्ली आधारित स्वरूप के उपयोग के माध्यम से सुव्यवस्थित और स्वचालित कर दिया गया है. प्रभावी जबकि चुनौतीपूर्ण नैदानिक ​​matrices के साथ सामना किया, कण और झिल्ली सीमाओं को जानते हैं. उदाहरण के लिए, झिल्ली और मनका के आधार स्तंभों शिकायत कर रहे हैं, छोटे आकार ताकना (इस प्रकार, उच्च वापस दबाव) है, और एक अपकेंद्रित्र या वैक्यूम सिस्टम से संसाधित करने के क्रम में समर्थन के कुछ प्रकार की आवश्यकता होती है. झिल्ली की शारीरिक विशेषताओं और मनका कॉलम परिणाम मेंकुशलतापूर्वक उपभोज्य, और / या ऊनि दिशात्मक प्रवाह पथ के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है कि कुल (इनपुट) नमूना मात्रा clogging बिना कार्रवाई की जा सकती है कि नमूने के प्रकार सीमा है, जो महत्वपूर्ण fluidic प्रतिरोध,. इसके विपरीत, चुंबकीय कणों आंदोलन से नमूना भर में वितरित किया जाना चाहिए. homogenously एक समाधान के भीतर चुंबकीय कणों वितरित करने की आवश्यकता सबसे अधिक चुंबकीय मनका उपभोग्य साथ संसाधित किया जा सकता है कि कुल इनपुट नमूना मात्रा को सीमित करता है. क्लीनिकल नमूना विशेषताओं (जैसे चिपचिपाहट या जटिलता के रूप में) एक ट्यूब या छड़ के पक्ष में अक्षम चुंबकीय कण एकाग्रता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, सिलिका ठीक कण उनके आकर्षण संस्कार खोने और अंतिम नमूना contaminating, निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान मोती के बंद को तोड़ सकते हैं.

TruTip प्रौद्योगिकी इन न्यूक्लिक एसिड नमूना प्रसंस्करण बाधाओं और सीमाओं के 14 में से कुछ को दूर करने के लिए विकसित किया गया था. एक के भीतर एक झरझरा केवल पत्थर का खंभा embedding द्वारापिपेट टिप, fluidic backpressure उतारा है, निर्वात (यानी पिपेट आकांक्षा) द्वारा प्रवाह नियंत्रण सक्षम बनाता है. यह सुविधा बहुत (चित्रा 1) सरल किया जा करने के लिए मुश्किल नमूना प्रकार से न्यूक्लिक एसिड को शुद्ध करने के लिए आवश्यक निकालने की प्रक्रिया और उपकरण सक्षम बनाता है. केवल पत्थर का खंभा की ज्यामिति और porosity केवल पत्थर का खंभा की मोटाई 1.0 से 5.0 मिलीग्राम से लेकर नमूना संस्करणों के लिए पर्याप्त न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता प्रदान करता है, जबकि clogging कम करने के लिए सिलवाया है. नमूना आकांक्षा और वितरण के दौरान द्विदिश प्रवाह नमूना निकालने और कुशल न्यूक्लिक एसिड वसूली और क्षालन के लिए बाध्यकारी केवल पत्थर का खंभा के बीच लंबे समय तक निवास बार के लिए अनुमति देता है, और विंदुक टिप खुद की मात्रा क्षमता से अधिक है कि संसाधित करने के लिए अपेक्षाकृत बड़े नमूना संस्करणों में सक्षम बनाता है. हम पहले से एक एकल या बहु चैनल राय का उपयोग कर nasopharyngeal नमूनों से इन्फ्लूएंजा आरएनए सफ़ाई के लिए एक पुस्तिका TruTip प्रक्रिया के विकास और आवेदन की सूचनाnin pipettor का 15. बराबर निकासी क्षमता 10 6 जीन प्रतियों पर स्वचालित QIAcube और मैनुअल TruTip तरीकों के बीच इन्फ्लूएंजा एक प्रति मिलीलीटर nasopharyngeal aspirate प्राप्त किया गया. इस अध्ययन का उद्देश्य सामान्यतः संदर्भ नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में पाया तरल से निपटने रोबोट का उपयोग nasopharyngeal aspirate (एनपीए) और अन्य चिकित्सकीय प्रासंगिक नमूना प्रकार के मध्यम और उच्च throughput, स्वचालित TruTip न्यूक्लिक एसिड शोधन प्रक्रियाओं, प्रदर्शित करने के लिए किया गया था.

Protocol

तीन स्वचालित TruTip निकासी प्रोटोकॉल का वर्णन किया और यहां प्रदर्शन कर रहे हैं: एक Eppendorf epMotion 5070 पर एनपीए से 1) मध्यम throughput के शाही सेना निकासी, 2) हैमिल्टन स्टार पर पूरे रक्त की कम मात्रा से उच्च throughput जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण, और 3) चयनात्मक अलगाव और हैमिल्टन STARplus पर मातृ प्लाज्मा की बड़ी मात्रा से खंडित भ्रूण डीएनए का संवर्धन. स्वचालित स्क्रिप्ट Akonni से उपलब्ध हैं और केवल उच्च स्तरीय कार्यक्रम वर्णनकर्ता यहाँ उपलब्ध कराई गई हैं. चिकित्सीय नमूनों को संसाधित कर रहे हैं पहले निष्कर्षण और क्षालन अभिकर्मकों स्वतः स्वचालित लिपि (एस) द्वारा थोक अभिकर्मक नली से 96 अच्छी तरह से प्लेटों को तिरस्कृत कर रहे हैं.

1. Nasopharyngeal Aspirate से स्वचालित शाही सेना निष्कर्षण

पहले से वर्णित पुस्तिका TruTip विधि 15 अब 1.0 मिलीलीटर Eppendorf पाइप में एम्बेडेड एक बड़े ताकना TruTip मैट्रिक्स का उपयोग कर, एक Eppendorf epMotion 5070 तरल से निपटने रोबोट पर चलने के लिए अनुकूल हैटीटीई टिप्स, एक 2 मिलीलीटर गहरी अच्छी तरह से थाली (यूएसए वैज्ञानिक), Akonni TruTip निकासी अभिकर्मकों, और एनपीए नमूना प्रकार के रूप में. epMotion 5070 तरल से निपटने रोबोट एक साथ, ताकि एक आधारभूत स्वचालित प्रोटोकॉल 8 समानांतर एक्सट्रेक्शन के लिए वर्णित है 8 युक्तियाँ करने के लिए ऊपर रखती है. हालांकि, ऊपर से 24 नमूने एक गहरे अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से नमूना थाली में एक कार्यक्रम के दौरान कार्रवाई की जा सकती. एक अलग epMotion कार्यक्रम 16 या 24 नमूनों की प्रक्रिया के क्रम में (और) की आवश्यकता उपलब्ध है. नीचे दिये प्रोटोकॉल एक 8 नमूना स्वचालित स्क्रिप्ट के लिए है.

व्यवस्था

  1. निकासी शुरू करने से पहले आरटी के लिए nasopharyngeal नमूने ले आओ.
  2. नमूना प्लेट (2A चित्रा) के स्तंभ 1 में 100 μl nasopharyngeal aspirate प्लस 150 μl nuclease मुफ्त पानी बांटना.
  3. EpMotion worktable (चित्रा 2 बी) पर स्थिति बी 1 में नमूना प्लेट रखें.
  4. जगह विंदुक युक्तियाँ, TruTips और उनके संबंधित epMotion Worktab पर 30 मिलीलीटर अभिकर्मक नलीले पदों (चित्रा 2 बी).
  5. Eppendorf epBlue सॉफ्टवेयर खोलें, 8 नमूने लिए Akonni द्वारा प्रदान भागो फ़ाइल का चयन करें, और भागो टैब पर भागो बटन पर क्लिक करके विधि लोड.
  6. स्तर सेंसर सेटिंग्स के तहत, स्तर और सुझाव का चयन करें, और भागो बटन पर क्लिक करें.
  7. सॉफ्टवेयर में इनपुट नमूना मात्रा और भागो क्लिक करें.
  8. epMotion स्क्रिप्ट उपयोगकर्ता worktable पर स्थिति बी 2 में स्थित अभिकर्मक जलाशयों को निष्कर्षण और क्षालन अभिकर्मकों जोड़ने के लिए संकेत देगा. संबंधित गर्त में प्रत्येक अभिकर्मक की सिफारिश की मात्रा में जोड़ें. 8 नमूने लिए, कम से कम अभिकर्मक मात्रा में कर रहे हैं:
अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) गर्त स्थिति
95% इथेनॉल 3.5 2
बफर डी धो 9.0 3
बफर ई धो 9.0 4
क्षालन बफर ए 2 1.3 5
सेल और बंधन बफर डी 11.0 6
  1. ऊपर चरण 8 से शीघ्र दौरान epMotion सॉफ्टवेयर द्वारा प्रस्तुत तालिका में इनपुट अभिकर्मक संस्करणों. इनपुट मूल्य प्रत्येक संबंधित अभिकर्मक जलाशय में उपयोगकर्ता द्वारा तिरस्कृत बफर की वास्तविक मात्रा को प्रतिबिंबित करना चाहिए, और अधिक से अधिक या ऊपर उल्लेख किया न्यूनतम मात्रा के बराबर होना चाहिए. गलत मात्रा प्रविष्टियां 96 अच्छी तरह से थाली (ओं) में प्रत्येक ट्यूब या अच्छी तरह से करने के लिए epMotion हार्डवेयर द्वारा दिया गलत मात्रा में हो सकता है.

स्वचालित कार्यक्रम

  1. स्वचालित पद्धति शुरू करने के लिए चयन करें. स्वचालित स्क्रिप्ट उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना निम्नलिखित कदम के माध्यम से कदम होगा:
    नमूना lysis और अभिकर्मक वितरण:
    1. स्तंभ 1 में 375 μl lysis बफर डी बांटना और 10 के लिए मिश्रणचक्र (+ = 1 चक्र बांटना apirate). शेष अभिकर्मकों aliquotted कर रहे हैं, जबकि इस कदम सेल ऊष्मायन प्रक्रिया शुरू होता है.
    2. स्तंभ 2 में 1.6 मिलीलीटर धो बफर डी बांटना.
    3. कॉलम 3 में 1.6 मिलीलीटर धो बफर ई बांटना.
    4. एक स्तंभ 4 में 50 μl क्षालन बफर बांटना.
    5. Lysis बफर में 10 मिनट नमूना ऊष्मायन पूरा करने के लिए 6 मिनट के लिए रोकें डी.
    6. 10 pipetting चक्र के माध्यम से इथेनॉल के साथ प्रत्येक नमूना मिश्रण, स्तंभ 1 में प्रत्येक अच्छी तरह से 375 μl इथेनॉल जोड़ें.
    निष्कर्षण:
    1. Worktable पर स्थिति A2 से 8 TruTips लोड, और चित्रा 1 में उल्लिखित निकालने की प्रक्रिया शुरू करते हैं.
    2. महाप्राण और TruTip केवल पत्थर का खंभा के लिए न्यूक्लिक एसिड बाध्य करने के लिए सात चक्र के लिए नमूना थाली के स्तंभ 1 से नमूना / lysis बफर / इथेनॉल मिश्रण बांटना. (नैदानिक ​​नमूना चिपचिपापन में मतभेद के कारण) TruTip के माध्यम से नमूना प्रवाह भिन्न हो सकते हैं, इन नमूना के लिए न्यूक्लिक एसिड उपज नहीं थाटी प्रवाह भिन्नता से प्रभावित. नमूना प्रवाह में सुधार के लिए विकल्प चर्चा में वर्णित हैं.
    3. अवशिष्ट lysis बफर और नमूना मैट्रिक्स दूर करने के लिए नमूना थाली स्तंभ 2, और केवल पत्थर का खंभा अधिक 5x चक्र धो बफर विकास के लिए TruTips ले जाएँ.
    4. नमूना थाली स्तंभ 3, और बाध्य न्यूक्लिक एसिड से प्रोटीन और अन्य को दूर करने के लिए केवल पत्थर का खंभा अधिक 5x चक्र धो बफर ई करने TruTips ले जाएँ.
    5. केवल पत्थर का खंभा सुखाने के लिए खाली अभिकर्मक जलाशय स्थिति 1 (worktable स्थान बी 2 में) और चक्र 80x (एक तेज प्रवाह की दर से) को TruTips ले जाएँ. Eluted न्यूक्लिक एसिड तैयारी में अवशिष्ट सॉल्वैंट्स नकारात्मक ऐसी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और Taq डीएनए पोलीमरेज़ के रूप में एंजाइमों को प्रभावित करेगा, क्योंकि यह पूरी तरह TruTip सुखाने के लिए महत्वपूर्ण है.
    6. निकाले और शुद्ध न्यूक्लिक एसिड नमूना थाली स्तंभ 4 कुओं में क्षालन बफर में अब है क्षालन बफर ए में 5x नमूना थाली स्तंभ 4 और चक्र को TruTips ले जाएँ.
    7. EpMotion कचरे के डिब्बे में डाल TruTips निकालें.

16 कुल नमूनों के लिए कार्यक्रम नमूना थाली कॉलम 5-8 का उपयोग करते हुए 10.13 के माध्यम से कदम 10.1 दोहराना होगा. 24 नमूना कार्यक्रम के लिए, 10.13 से 10.1 कदम दोहराया जाता 2x नमूना थाली स्तंभ क्रमश: 5-8 और 9-12, का उपयोग कर.

2. पूरे रक्त से 96 अच्छी तरह से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण

एक हैमिल्टन स्टार तरल से निपटने रोबोट पूरी खून से एक साथ 96 नमूनों की स्वचालित निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हैमिल्टन स्टार एक वैकल्पिक हीटर / प्रकार के बरतन इकाई निश्चित clini के enzymatic पाचन के लिए महत्वपूर्ण है जो डेक, पर उपलब्ध है कि में epMotion प्रणाली से अलग हैइस तरह पूरे रक्त के रूप में कैलोरी, matrices. प्रणाली एक 96 चैनल पिपेट सिर के साथ फिट किया जा सकता है, क्योंकि TruTip कदम और अभिकर्मकों से प्रत्येक के लिए एक समर्पित 96 अच्छी तरह से थाली है.

व्यवस्था

  1. स्टार साधन और कंप्यूटर पर मुड़ें.
  2. हैमिल्टन भागो नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें.
  3. 96 नमूने लिए Akonni द्वारा प्रदान भागो फ़ाइल खोलें.
  4. स्टार डेक पर जगह labware 3 चित्र में दिखाया गया है.
  5. उनके इसी नली (संस्करणों के 96 नमूनों की प्रक्रिया के लिए आवश्यक न्यूनतम निरूपित) में अभिकर्मकों बांटना:
अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) गर्त स्थिति
सेल और बंधन बफर एफ 75 5
95% इथेनॉल 100 6
बफर जम्मू धो 175 7
धोनाबफर कश्मीर 175 8
क्षालन बफर ए 2 12 9
Proteinase कश्मीर (20 ​​मिलीग्राम मिलीलीटर -1) 8 15

6. नमूने आरटी को संतुलित करने की अनुमति दें.

7. नमूना कैरियर रैक (चित्रा 3 में डेक स्थिति 4) में नमूना ट्यूबों रखें. दूर छोड़ दिया वाहक के पीछे में जगह नमूना 1 और सामने सही स्थिति में नमूना 96 समाप्त होने के साथ प्रत्येक वाहक नीचे क्रमिक रूप से चलते हैं.

स्वचालित कार्यक्रम

  1. भागो फ़ाइल खिड़की और इनपुट कार्रवाई की जा रही नमूनों की संख्या के ऊपरी बाएँ में प्ले बटन का चयन करें. स्वचालित स्क्रिप्ट तो उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना निम्नलिखित कदम के माध्यम से कदम होगा:
    नमूना lysis और अभिकर्मक वितरण
    1. वह पर प्रत्येक नमूना ट्यूब से स्थिति 14 पर ऊष्मायन प्लेट के लिए 200 μl स्थानांतरणअटर / प्रकार के बरतन मॉड्यूल (चित्रा 3).
    2. ऊष्मायन थाली की अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने में 80 μl proteinase कश्मीर बांटना.
    3. ऊष्मायन थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 600 μl lysis बफर एफ बांटना.
    4. 10 चक्र के लिए समाधान मिश्रण, और फिर डिग्री सेल्सियस और 500 आरपीएम 70 पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. 70 डिग्री सेल्सियस तापमान सेट एक ~ 60 में परिणाम ° proteinase कश्मीर गतिविधि की सीमा के भीतर है, जो गहरी अच्छी तरह से थाली, भीतर सी नमूना तापमान. नमूने incubating रहे हैं, तरल हैंडलिंग प्रणाली उनके इसी प्लेटें और कुओं में अभिकर्मकों वितरण से परिचालन जारी है:
      • स्थिति 13 पर गहरी अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 100 μl क्षालन बफर ए.
      • स्थिति 10 पर गहरी अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 800 μl इथेनॉल.
      • स्थिति 12 पर गहरी अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 1.6 मिलीलीटर धो बफर कश्मीर.
      • स्थिति 11 पर गहरी अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 1.6 मिलीलीटर धो बफर जे.
    5. कचरे के डिब्बे में डाल अभिकर्मक सुझावों निकालें.
      निष्कर्षण
      GDNA रक्त प्रक्रिया के इस हिस्से को धोने अभिकर्मकों और चक्र संख्या की रचना के लिए छोड़कर, epMotion इन्फ्लूएंजा प्रोटोकॉल के समान है. हैमिल्टन TruTips सुझावों काले हैं, तो TruTip के माध्यम से तरल पदार्थ का प्रवाह दिखाई नहीं दे रहा है.
    1. डेक स्थिति 3 से 96 TruTips लोड.
    2. महाप्राण और नमूना / TruTip केवल पत्थर का खंभा के लिए न्यूक्लिक एसिड बाँध से 10 चक्र के लिए स्थिति 10 में lysis बफर / इथेनॉल मिश्रण बांटना.
    3. अवशिष्ट lysis बफर और नमूना मैट्रिक्स दूर करने के लिए केवल पत्थर का खंभा में 11 और 5x चक्र धो बफर जम्मू की स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ.
    4. 12 और बाध्य न्यूक्लिक एसिड से प्रोटीन और अन्य को दूर करने के लिए 5x चक्र धो बफर कश्मीर की स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ. साइकिल उच्च गति पर 40x TruTip शुष्क हवा की.
    5. स्थिति 13 और क्षालन बफर A2 में 5x चक्र को TruTips ले जाएँ. निकाले और शुद्ध न्यूक्लिक एसिड गहरी अच्छी तरह से थाली में क्षालन बफर में अब है.
    6. कचरे के डिब्बे में डाल TruTips निकालें.

कार्यक्रम समाप्त हो गया है, साधन से क्षालन प्लेट हटाने और भंडारण या बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त ट्यूब पर निकाली नमूने हस्तांतरण.

3. बड़ी मात्रा में प्लाज्मा नमूनों से डीएनए निष्कर्षण

हैमिल्टन STARplus साधन मातृ प्लाज्मा के 5 मिलीलीटर से भ्रूण डीएनए घूम स्वतंत्र रूप से निकालने के लिए एक स्वचालित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. STARplus प्रणाली दो स्वचालित पिपेट चैनल हथियार, 8 एक्स 5 मिलीलीटर चैनल के साथ एक और 8 एक्स 1 मिलीलीटर चैनल के साथ एक का समर्थन कर सकते हैं. इन हथियारों के 8 नमूने प्रत्येक के बैच में कंपित प्रसंस्करण के लिए समानांतर में काम कर सकते हैं. एक 5 मिलीलीटर TruTip प्रारंभिक एल के लिए प्रयोग किया जाता है: नुस्खा मात्रा निकासी, और एक 1 मिलीलीटर TruTip आकार जुदाई और निकाले न्यूक्लिक एसिड की आगे की एकाग्रता के लिए प्रयोग किया जाता है.

सेट अप

  1. STARplus साधन और कंप्यूटर पर मुड़ें.
  2. हैमिल्टन भागो नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें.
  3. 8 बड़ी मात्रा में प्लाज्मा के नमूने लिए Akonni द्वारा प्रदान भागो फ़ाइल खोलें.
  4. चित्रा 4 में दिखाया गया है STARplus डेक पर जगह labware.
  5. उनके इसी जलाशयों में अभिकर्मकों बांटना:
अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) गर्त स्थिति
सीएन-W1 17 5A
सीएन-डब्ल्यू 2 17 5 ब
सीएन-W4 21 5C
Proteinase कश्मीर (20 ​​मिलीग्राम मिलीलीटर -1) 5 6A
ईबीबी 17 6B
EBA2 5 6C
सीएन-W3 5 6D
सीएन-बी 2 5 6E
सीएन-बी 3 5 6F
सीएन-एल 1 52 7
सीएन-बी 1 175 8
  1. नमूना आरटी को संतुलित करने की अनुमति दें.
  2. नमूना कैरियर रैक (चित्रा 4 में डेक स्थिति 3) में नमूना ट्यूबों रखें. रियर में जगह नमूना 1 और डेक के सामने की ओर क्रमिक रूप से चलते हैं.

स्वचालित कार्यक्रम

क्योंकि बड़े इनपुट नमूना मात्रा का, सेल और homogenization के कदम एक पानी के स्नान में हैमिल्टन STARplus साधन का बंद किया जाना चाहिए. स्वचालित प्रोटोकॉल के भीतर उपयोगकर्ता हस्तक्षेप की आवश्यकता कदम beginnin में एक तारांकित (*) से संकेत कर रहे हैंवाक्य, और बोल्ड प्रकार के छ.

नमूना lysis और अभिकर्मक वितरण: नमूना नमूना homogenize और डीएनए को रिहा करने proteinase कश्मीर और lysis बफर साथ incubated है.

  1. भागो फ़ाइल विंडो के ऊपरी बाएँ में प्ले बटन का चयन करें. नमूने के इनपुट संख्या, डेक पर विंदुक युक्तियाँ के स्थान पर, और डेक पर TruTips का स्थान संसाधित किया जा रहा है.
  2. स्वचालित स्क्रिप्ट 615 μl proteinase कश्मीर, 5 मिलीग्राम प्लाज्मा, और प्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 6.2 मिलीलीटर lysis बफर सीएन-एल 1 कहते हैं, और करेंगे तो रोकें.
  3. * उच्च गति पर 30 सेकंड के लिए नमूना डेक, भंवर से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों निकालें, और 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या गर्मी ब्लॉक में से कम 30 मिनट के लिए बंद लाइन सेते हैं. शंक्वाकार ट्यूबों हैमिल्टन डेक से हटा रहे हैं, उनके संबंधित प्लेटें और कुओं (4B चित्रा और 4C) में अभिकर्मकों वितरण जारी रखने के लिए स्वचालित स्क्रिप्ट फिर से शुरू: 2 स्थिति 9 स्तंभ 1 में हर दूसरे को अच्छी तरह से करने के लिए मिलीलीटर सीएन-W1.
  4. 2 मिलीलीटर सीएन-डब्ल्यू 2 स्थिति 9 स्तंभ 2 में हर दूसरे को अच्छी तरह से करने के लिए.
  5. 2 मिलीलीटर सीएन-W4 स्थिति 9 कॉलम 3 में हर दूसरे को अच्छी तरह से करने के लिए.
  6. स्थिति में हर दूसरे को अच्छी तरह से 250 μl EBA2 9 कॉलम 4 और 5.
  7. स्थिति 10 स्तंभ 1 में हर दूसरे को अच्छी तरह से करने के लिए 495 μl सीएन-बी 2.
  8. स्थिति 10 स्तंभ 2 में हर दूसरे को अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर ईबीबी.
  9. स्थिति 10 कॉलम 3 में हर दूसरे को अच्छी तरह से 500 μl सीएन-W3.
  10. 500 μl सीएन-W4 स्थिति में हर दूसरे को अच्छी तरह से 10 स्तंभ 4 से.
  11. स्थिति 10 कॉलम 5 में हर दूसरे को अच्छी तरह से 50 μl EBA2.

5 मिलीलीटर चैनलों डेक स्थिति 9 में गहरी अच्छी तरह से थाली के हर दूसरे कुएं में प्रत्येक नमूने के लिए आसन्न कुओं, स्वचालित प्रोग्राम dispenses अभिकर्मकों उपयोग करने के लिए भी विस्तृत कर रहे हैं. 1 मिलीलीटर चैनलों के लिए इस्तेमाल किया यांत्रिक भुजा भी बहिष्कार और एकाग्रता सेंट के लिए अभिकर्मक प्लेटों में हर दूसरे को अच्छी तरह से उपयोग की आवश्यकता हैप्रोटोकॉल के ईपीएस.

वितरण अभिकर्मकों के बाद, कार्यक्रम रोकें होगा.

  1. * 30 मिनट के बाद, 60 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन, 5 मिनट के लिए बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों की जगह.
  2. * डेक स्थिति 4 में नमूना वाहक रैक के भीतर उनके मूल पदों के लिए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब लौटें, और स्वचालित स्क्रिप्ट फिर से शुरू.
  3. प्रत्येक नमूना ट्यूब से 12 मिलीलीटर बंधन बफर सीएन-बी 1 जोड़ें और 10x मिश्रण.

बड़ी मात्रा में निष्कर्षण: 5 मिलीलीटर TruTips lysed प्लाज्मा नमूना से कुल डीएनए निकालने के लिए उपयोग किया जाता है.

  1. बड़ी मात्रा न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए स्थिति 2 से 5 मिलीलीटर TruTips उठाओ.
  2. साइकिल नमूना 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में mixture15 बार, ट्यूब के नीचे शुरू करने और प्रत्येक pipetting चक्र के बाद उच्च 3 मिमी घूम रहा है. यह कदम TruTip केवल पत्थर का खंभा के लिए कुल न्यूक्लिक एसिड बांधता है.
  3. स्थिति पर गहरी अच्छी तरह से प्लेटों को 6 स्तंभ 1, और cy TruTips ले जाएँधो बफर सीएन-W1 में cle 1x.
  4. धो सीएन-डब्ल्यू 2 में 9 स्तंभ 2 और चक्र 1x स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ.
  5. 9 कॉलम 3 और धो सीएन-W4 में चक्र 2x स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ.
  6. बंधन मैट्रिक्स सुखाने के लिए उच्च गति पर 40x 9 स्तंभ 4 और चक्र की स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ.
  7. 5 मिलीलीटर TruTips से बाध्य न्यूक्लिक एसिड elute को 10x 9 स्तंभ 5 और चक्र की स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ. यह बड़ी मात्रा क्षालन # 1 है.
  8. कॉलम 6 से TruTips ले जाएँ और क्षालन बफर के दूसरे विभाज्य साथ कदम दोहराएँ. यह बड़ी मात्रा क्षालन # 2 है.
  9. क्षालन # 1 के साथ गठबंधन है, और TruTips त्यागने की स्थिति 9 कॉलम 5 में क्षालन # 2 स्थानांतरण.

बहिष्करण और एकाग्रता: उच्च आणविक वजन डीएनए निकाला नमूना से निकाल दिया जाता है, और शेष डीएनए अलग है और ध्यान केंद्रित किया.

  1. 10 स्तंभ 1 की स्थिति और अच्छी तरह से 10x मिश्रण करने के लिए कदम 22 से संयुक्त eluant जोड़ें.
  2. 1 मिलीलीटर TruTi उठाओकेवल पत्थर का खंभा के लिए उच्च आणविक वजन डीएनए बाध्य करने की स्थिति 13 और चक्र 20x से पी एस.
  3. टिप कुल्ला और उच्च आणविक वजन डीएनए निकालने के लिए 5x 10 स्तंभ 2 और चक्र की स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ. TruTips बनाए रखा और स्थिति 13 पर टिप रैक में वापस रख दिया जाता है.
  4. स्थिति 12 से अभिकर्मक सुझावों के साथ, स्थिति 10x 10 स्तंभ 1 और मिश्रण में नमूने के बंधन बफर सीएन-बी 3 के 575 μl जोड़ें.
  5. कदम 25 से TruTips उठाओ, 1 मिलीलीटर TruTip के लिए नमूना से शेष डीएनए बाँध से 10 स्तंभ 1, और चक्र 20x स्थिति के लिए वापसी.
  6. किसी भी शेष अवरोधकों को हटाने के लिए धो सीएन-W3 में 10 स्तंभ 4 और चक्र 1x स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ.
  7. सीएन-W3 से अवशिष्ट लवण कुल्ला धो सीएन-W4 में 10 स्तंभ 5 और चक्र 1x स्थिति के लिए TruTips ले जाएँ.
  8. स्थिति पर केवल पत्थर का खंभा सुखाने के लिए 35x सुझावों के माध्यम से 10 कॉलम 5 और चक्र हवा TruTips उठाएँ.
  9. शुद्ध, आकार selec elute करने EBA2 में 10x 10 कॉलम 6 और चक्र की स्थिति के लिए TruTips ले जाएँटेड और केंद्रित न्यूक्लिक एसिड.
  10. TruTips त्यागें.
  11. स्थिति 11 में स्तंभ 6-1.5 मिलीलीटर ट्यूब से eluted नमूना स्थानांतरण. निकाले गए नमूनों का भंडारण या बहाव के प्रसंस्करण के लिए तैयार हैं.

Representative Results

एनपीए से इन्फ्लूएंजा शाही सेना निकासी के लिए वास्तविक समय पीसीआर डेटा चित्रा 5A में दिखाए जाते हैं. अनुमानित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण दक्षता प्रोटोकॉल 15 के मैनुअल संस्करण के साथ प्राप्त परिणामों के समान है. औसत सी टी मूल्यों में एक रेखीय प्रतिक्रिया औसत सी टी में मानक विचलन कम से कम 1 मूल्यों के साथ 6 4 10 और 10 के बीच जीन प्रतियां मिलीलीटर -1, (ए और बी इन्फ्लूएंजा के लिए = 0.99 और 0.98, क्रमशः आर 2) इन्फ्लूएंजा संशोधन मनाया जाता है चक्र. epMotion प्रणाली के साथ पार संदूषण के अभाव 10 6 जीन प्रतियां मिलीलीटर -1 एनपीए युक्त 12 सकारात्मक एनपीए नमूने 12 बफर कारतूस के साथ interspersed थे जहां चित्रा 5 ब, में प्रदर्शन किया है. सकारात्मक नियंत्रण के लिए औसत सी टी ± 0.14 30.16 था, और सभी बफर कारतूस नकारात्मक थे. कुल नमूना प्रसंस्करण समय क्रमश: 8, 16 और 24 के नमूने के लिए 16, 28 और 40 मिनट है.एक ठेठ नैदानिक ​​nasopharyngeal aspirate या झाड़ू 10 7 जीन प्रतियां मिलीलीटर -1 में शामिल होंगे क्योंकि (1,000 TCID प्रति virions 50 16 और यह सोचते> 10 4 TCID 50 मिलीलीटर -1 इन्फ्लूएंजा 17), स्वचालित epMotion प्रोटोकॉल बहुमत पर प्रभावी होने की उम्मीद है नैदानिक ​​एनपीए नमूनों की.

मानव जीनोमिक डीएनए पर प्रदर्शन आणविक परीक्षण की सीमा को देखते हुए पूरे रक्त से न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के प्राथमिक उद्देश्य संदूषक मुक्त, उच्च आणविक वजन जीनोमिक डीएनए का उत्पादन होता है. 96 नमूने लिए स्वचालित प्रोटोकॉल (जैसे Promega MagneSil = 90 मिनट और Qiagen QIAamp डीएनए रक्त BioRobot MDX प्रणाली = 2.5 घंटे). चित्रा 6A तुलना / यूवी absorbance प्रोफाइल के लिए पता चलता है अन्य स्वचालित प्रणाली पर एक सुधार है जो 1 घंटा, भीतर पूरा हो गया है एक औसत के साथ, हैमिल्टन स्टार प्रोटोकॉल पर 45 अभिकर्मक कारतूस के साथ एक साथ संसाधित 45 सकारात्मक रक्त के नमूने 260/230 अनुपात. 1.7-2.0 और> 1.7 आम तौर पर अवशिष्ट लवण, प्रोटीन या विलायकों से मुक्त, बहुत शुद्ध डीएनए का संकेत है, और सबसे नीचे की ओर आणविक अनुप्रयोगों के लिए स्वीकार्य हैं एक 260/230 अनुपात के बीच एक ए 260/280 अनुपात. चित्रा 6B में 1% agarose जेल परिणामस्वरूप gDNA न्यूनतम कर्तन साथ उच्च आणविक भार (> 24 केबी), की है कि पता चलता है. 45 सकारात्मक नमूनों का पूरा सेट से औसत न्यूक्लिक एसिड उपज 5.26 ± जीवन टेक्नोलॉजीज Quantifiler मानव डीएनए मात्रा किट के आधार पर 200 μl पूरे रक्त प्रति 0.46 ग्राम मानव डीएनए,. चित्रा 5B में दिखाया गया है उन लोगों के लिए समान पार संदूषण पढ़ाई सकारात्मक नमूने के साथ interspersed और समानांतर में निकाले नकारात्मक नियंत्रण बफर कारतूस के साथ प्रदर्शन किया गया, सभी खाली () नहीं दिखाया पीसीआर द्वारा फिर से नकारात्मक थे. शुद्ध gDNA () नहीं दिखाया भी कई अन्य पीसीआर आधारित विश्लेषण के लिए उपयुक्त है.

बड़ी मात्रा TruTip प्रक्रिया के साथ कार्रवाई की एक जमा मातृ प्लाज्मा नमूना के आठ दोहराने के नमूनों से वास्तविक समय परिणाम 7 चित्र में दिखाया गया. पूर्ण प्रोटोकॉल (बंद लाइन proteinase कश्मीर ऊष्मायन सहित) न्यूक्लिक एसिड किट (कोई तुलनीय स्वचालित निष्कर्षण किट अभी तक उपलब्ध हैं) घूम क्विएज़न का मार्गदर्शन करने के लिए इसी तरह के लगभग 2.5 घंटे में समाप्त हो गया है. सभी replicates से अधिक की औसत सी टी मूल्यों 34.58 ± 0.66 और 29.76 ± भ्रूण पुरुष (Chy) और कुल (CH1) डीएनए के लिए 0.50, क्रमशः, स्वचालित निष्कर्षण विधि का उत्कृष्ट repeatability है जो दर्शाता है. कुल डीएनए पूल (जीनोम समकक्ष में) के भीतर भ्रूण डीएनए की एकाग्रता, 2.8% के सभी नमूनों में जिसके परिणामस्वरूप औसत% भ्रूण डीएनए के साथ, मानकों को फिट बिंदु विश्लेषण तुलना के आधार पर गणना की है. नमूनों के निष्कर्षण प्रदर्शन से पहले जमा थे क्योंकि इस नमूने के लिए वास्तविक% भ्रूण डीएनए अज्ञात है. भ्रूण डीएनए संरचनामें गैर जमा प्लाज्मा नमूनों TruTip विधि का उपयोग कर निकाला एक Qiagen घूम न्यूक्लिक एसिड किट (नहीं दिखाया गया है) के साथ परिणाम की तुलना में आम तौर पर 1.5 गुना अधिक है.

चित्रा 1
चित्रा 1. TruTip निकालने की प्रक्रिया और तरल हैंडलिंग प्रणाली की परवाह किए बिना काम के प्रवाह,. अन्य नमूना तैयार करने या तरल से निपटने कदम विशिष्ट तरल हैंडलिंग उपकरण और सॉफ्टवेयर की क्षमताओं के आधार पर स्वचालित दिनचर्या में शामिल किया जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. (ए) Eppendorf epMotion 5070 नमूना थाली लेआउट. अभिकर्मकों / consuma का (बी) व्यवस्थाepMotion केवल एक साथ 8 नमूने की एक अधिकतम कार्रवाई करेंगे हालांकि worktable पर bles. नमूना थाली, 24 नमूने (स्तंभ 1, 5 और क्रमशः 9) तक के लिए विन्यस्त किया जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. पूरे रक्त से जीनोमिक डीएनए शुद्ध के लिए हैमिल्टन स्टार डेक लेआउट (नहीं पैमाने पर करने के लिए) डेक 1 स्थिति = हैमिल्टन 1 मिलीलीटर फ़िल्टर्ड सुझाव;. 2 = हैमिल्टन 1 मिलीलीटर गैर फ़िल्टर युक्तियाँ, 3 = Akonni / हैमिल्टन 1 मिलीलीटर एलपीटी 2 मिमी TruTips, 4 = इनपुट रक्त नमूना वाहक (रक्त संग्रह ट्यूब या microcentrifuge ट्यूबों); lysis बफर एफ, इथेनॉल के लिए 5-9 = 290 मिलीलीटर अभिकर्मक नली, क्रमशः बफर जम्मू, धो बफर कश्मीर और क्षालन बफर ए 2, धो, 10 = 96 घकार्बनिक अच्छी तरह बंधन थाली, 11 अच्छी तरह से जम्मू धो = 96 गहरी, 13 = 96 गहरे कुएं क्षालन थाली, 14 Nunc 96 गहरे कुएं ऊष्मायन थाली के साथ = हैमिल्टन HHS2 हीटर / प्रकार के बरतन, 15 = 50 मिलीलीटर अभिकर्मक गर्त 12 = 96 गहरे कुएं कश्मीर धो proteinase लालकृष्ण युक्त बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
4 चित्रा. बड़ी मात्रा में प्लाज्मा नमूने (नहीं पैमाने पर करने के लिए) से डीएनए शुद्ध के लिए हैमिल्टन STARplus डेक लेआउट. प्रणाली 8 एक्स 5 मिलीलीटर चैनलों और 8 एक्स 1 मिलीलीटर चैनल (डेक लेआउट में नहीं दिखाया गया है) के साथ सुसज्जित है. डेक 1 स्थिति = हैमिल्टन 4 मिलीलीटर फ़िल्टर्ड सुझावों, 2 = Akonni / हैमिल्टन 5 मिलीलीटर TruTips, 3 = स्रोत प्लाज्मा नमूने, 4 = 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, सीएन-W1, सीएन-W2 और सीएन-W4 युक्त 5 = 120 मिलीलीटर अभिकर्मक नली Reageएनटीएस, 6 proteinase कश्मीर, चीन, बी 2, सी एन, बी 3, EBA2, ईबीबी और सीएन-W3 अभिकर्मकों युक्त = कम मात्रा अभिकर्मक नली, 7 = सीएन-एल 1 अभिकर्मक युक्त 290 मिलीलीटर अभिकर्मक गर्त, 8 = 290 मिलीलीटर अभिकर्मक गर्त युक्त सीएन -बी 1 अभिकर्मक, 9 चरण 1 के लिए = 96 गहरे अच्छी तरह प्लेटें, 10 चरण 2 के लिए = 96 गहरे अच्छी तरह प्लेटें, शुद्ध, अंतिम उत्पाद के लिए 11 = नमूना वाहक, 12 = हैमिल्टन 1 मिलीलीटर अनफ़िल्टर्ड सुझाव; 13 = Akonni / हैमिल्टन 1 मिलीलीटर एलपीटी 4 मिमी TruTips. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. (ए). इन्फ्लूएंजा वायरस के स्वचालित TruTip निकासी से वास्तविक समय पीसीआर परिणाम nasopharyngeal aspirate (एनपीए) में जोड़ा. इनपुट एनपीए मात्रा = 100 μl, क्षालन मात्रा = 50 μl. परिणाम 3 को दोहराने ई की औसत रहे हैंकमजोर पड़ने के स्तर और इन्फ्लूएंजा लक्ष्य प्रति 5 अलग एनपीए पृष्ठभूमि (एन = 15) से xtractions. qPCR के पहले 15 में वर्णित परख शर्तों के साथ LightCycler 480 प्रणाली पर प्रदर्शन किया गया था. 12 सकारात्मक एनपीए नमूने कोई टेम्पलेट नियंत्रण और स्वचालित निष्कर्षण प्रक्रिया के अधीन के साथ interspersed हैं जब (बी) नहीं पार संक्रमण का पता चला है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
6 चित्रा. बेतरतीब ढंग से चुनी 10 से एक NanoDrop 1000 (ThermoFisher) से पूरे रक्त से मानव जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के परिणाम. ए) यूवी दृष्टिगोचर निशान replicates. बी) 1% TruTip शुद्ध gDNA के agarose जेल. एम = फिशर 24 केबी अधिकतम डीएनए सीढ़ी. लेन 1 - 4 = ~ 100 एनजी शुद्ध gDNA चार से बेतरतीब ढंग से चयनित replicates. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

7 चित्रा
चित्रा 7. आज़ादी प्लाज्मा से डीएनए घूम के आठ दोहराने TruTip एक्सट्रेक्शन से वास्तविक समय पीसीआर परिणाम. तारक (* या **) से चिह्नित नमूने अलग दिनों पर निकाले गए थे. Chy पुरुष भ्रूण डीएनए quantifies और CH1 कुल डीएनए वर्तमान (भ्रूण और मातृ) quantifies. qPCR Chy और CH1 18 को लक्षित पहले प्रकाशित assays के साथ एक LightCycler 480 प्रणाली (रॉश) पर प्रदर्शन किया गया था.

Discussion

TruTip अवधारणा और कार्यप्रवाह की सादगी (चित्रा 1) यह आसानी से, स्वचालित कुशल और नैदानिक ​​नमूना, matrices इनपुट नमूना संस्करणों, और तरल हैंडलिंग सिस्टम के एक नंबर के लिए प्रभावी, रूपांतरित करना. यह हर नैदानिक ​​नमूना है कि अद्वितीय है, तथापि, मान्यता प्राप्त होना चाहिए, और चिपचिपाहट में अगले करने के लिए एक, विविक्त, बलगम, सतह contaminants, माइक्रोबियल, और / या मानव आनुवंशिक पृष्ठभूमि अलग अलग होंगे. नैदानिक ​​नमूना संरचना और एक स्वचालित TruTip नमूना तैयार प्रोटोकॉल के उद्देश्य से उपयोगों में उम्मीद की विविधताओं को देखते हुए यह इसलिए एक विशिष्ट नमूना प्रकार के लिए वांछित परिणाम प्राप्त करने के क्रम में एक TruTip प्रक्रिया में कुछ कदम को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. बावजूद नमूना प्रकार की, लेकिन, आम तौर पर न्यूक्लिक एसिड पवित्रता और / या वसूली पर सबसे महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि TruTip पैरामीटर शामिल हैं:

  1. Lysis बफर (और शराब) के साथ नमूना मिश्रण और homogenization. TruTips फिर से एक है जबकिlatively बड़े छेद के आकार, नमूना homogenization और द्रवीकरण कुशल सेल के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, और TruTip केवल पत्थर का खंभा के लिए बाद में बाध्यकारी कदम. एक समरूप और अच्छी तरह से तरलीकृत lysate के साथ, नमूने समग्र नमूना प्रसंस्करण समय कम कर देता है जो उच्च प्रवाह दरों, साथ TruTip के माध्यम से स्थानांतरित कर सकते हैं. बड़ी मात्रा में प्लाज्मा प्रोटोकॉल बड़े इनपुट नमूना मात्रा के बावजूद, पूरी तरह homogenize और मुश्किल नमूने (ऑन लाइन या बंद लाइन) दव्र बनाना करने के लिए उपयोगकर्ताओं के लिए क्षमता को दर्शाता है.
  2. प्रवाह दरों. धीमी प्रवाह दरों न्यूक्लिक एसिड बंधन या क्षालन के दौरान आम तौर पर कुल प्रसंस्करण समय की कीमत पर यद्यपि, उच्च न्यूक्लिक एसिड की पैदावार में परिणाम. धीमी प्रवाह दरों में भी डीएनए कर्तन की हद तक कम कर सकते हैं.
  3. साइकिल संख्या. इष्टतम आकांक्षा की संख्या और चक्र बांटना नमूना प्रकार, कुल नमूना मात्रा, और प्रवाह की दर पर निर्भर है. चित्रा 1 में चरण 1 आम तौर पर बिंदु है जो चक्र कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा पररुपये (और प्रवाह की दर) इस तरह के विभिन्न रोगियों से कारण एनपीए विस्कोसिटी की श्रृंखला के लिए अनुकूलित करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण lysates में से एक का प्रतिनिधित्व nasopharyngeal aspirate (चित्रा 5) के रूप में नमूनों के साथ, कुछ अनुभवजन्य अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
  4. सुखाने. TruTip केवल पत्थर का खंभा की पूरी सुखाने शुद्ध न्यूक्लिक एसिड नमूना और बाधा बहाव प्रक्रियाओं या परीक्षण के साथ सह eluting से अवशिष्ट कार्बनिक विलायकों को रोकने के लिए जरूरी है. TruTip अपकेन्द्रण या निर्वात निस्पंदन के माध्यम से सूख नहीं जाता है, यह सुखाने चरण के दौरान प्रवाह दर और चक्र संख्या दोनों को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है. कभी कभी सूखने चक्र पूरा कर रहे हैं के बाद TruTip की टर्मिनस पर धोने के समाधान का एक अवशिष्ट छोटी बूंद नहीं है. हैमिल्टन रोबोट जिससे एक विलायक मुक्त क्षालन सुनिश्चित करना है, छोटी बूंद रिलीज करने के लिए अच्छी तरह से पक्ष पर एक "टिप स्पर्श" प्रदर्शन करने की क्षमता है. epMotion प्रणाली यह सुविधा है, लेकिन एक एल में TruTip टर्मिनस के पूर्व कुल्ला नहीं हैution बफर ही प्रभाव को प्राप्त करने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है.

रोबोट चैनल हथियारों को ज्यामिति, पिपेट टिप सामग्री, और लगाव विधि प्रत्येक साधन निर्माता के लिए अद्वितीय हैं क्योंकि, एक अलग TruTip निर्माण प्रत्येक तरल हैंडलिंग प्रणाली के लिए आवश्यक है. TruTip केवल पत्थर का खंभा आयाम (व्यास, मोटाई, और ध्यान में लीन होना आकार) न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता (और क्षालन क्षमता) के साथ सहसंबंधी है, के रूप में किसी भी ठोस चरण निष्कर्षण तकनीक के लिए उम्मीद है. मोटी (> 4 मिमी) matrices के बड़ी मात्रा के नमूने और / के लिए न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता बढ़ाने के लिए या विशिष्ट TruTip प्रारूपों में बाध्यकारी क्षमता बराबर करने के लिए एक 1 मिलीलीटर TruTip में एम्बेड किया जा सकता है, TruTip मोटाई और प्रवाह की दर के बीच एक tradeoff के दौरान वहाँ है प्रारंभिक बाध्यकारी कदम (कच्चे lysates की उपस्थिति में). इस प्रकार, यह एक स्वचालित प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरणों के लिए बड़ी मात्रा विंदुक युक्तियाँ में बड़े व्यास monoliths एम्बेड करने के लिए कभी कभी फायदेमंद है, (उदाहरण के लिए </ उन्हें> बड़ी मात्रा एक्सट्रेक्शन के लिए 5 मिलीलीटर हैमिल्टन / Akonni TruTips). तरल से निपटने रोबोट के निर्माताओं से निर्धारित विशिष्ट TruTip विन्यास को देखते हुए, हालांकि, हम जरूरी TruTip न्यूक्लिक एसिड पैदावार विभिन्न निर्माताओं से, या अलग TruTip आकार भर में तरल से निपटने प्लेटफार्मों भर में समान होने की उम्मीद नहीं है.

वे सामान्य रूप से बाँझ साइटों (जैसे मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ) से प्राप्त कर रहे हैं जब तक क्लीनिकल नमूने (परिभाषा से) मानव जीनोमिक डीएनए के महत्वपूर्ण मात्रा में शामिल होंगे. अन्य अनुप्रयोगों में मानव डीएनए एक अवांछित जीनोमिक पृष्ठभूमि (चित्रा 5 के रूप में) का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि कभी कभी मानव जीनोमिक डीएनए, (चित्रा 6 में) के रूप में वांछित है. पृष्ठभूमि डीएनए की उपस्थिति आमतौर पर केवल पत्थर का खंभा के बंधन क्षमता अधिक नहीं है नमूने में न्यूक्लिक एसिड की कुल राशि के रूप में लंबे समय के रूप में समस्याग्रस्त नहीं है, और पृष्ठभूमि डीएनए एक वाहक के रूप में काम कर सकते हैं वांछित लक्ष्य न्यूक्लिक अगरएसिड ट्रेस मात्रा में मौजूद है. उच्च मात्रा प्लाज्मा निकासी प्रोटोकॉल (चित्रा 7) के उद्देश्य के लिए सिवाय इसके कि संक्रामक रोग परीक्षण की तैयारी नमूना उद्देश्य के समान है जो मातृ डीएनए के 10-20 गुना अधिक, की उपस्थिति में (खंडित) भ्रूण के डीएनए को अलग करने के लिए है दृश्यों अत्यधिक अनुकूल हैं और केवल अति विशिष्ट आणविक परीक्षण और / या आकार भेदभाव से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इस मामले में कुल घूम डीएनए एक 5 मिलीलीटर TruTip, और बाद में उच्च आणविक और कम आणविक वजन भ्रूण डीएनए के माध्यम से अलग हो रहे हैं का उपयोग कर अलग है बाध्यकारी बफर की स्थिति बदलकर एक 1 मिलीलीटर TruTip करने के बाद बाध्यकारी और क्षालन. एक सिलिका पत्थर का खंभा के लिए अपने बाध्यकारी और क्षालन गुणों के आधार पर लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड के चुनिंदा आकार जुदाई और संवर्धन झिल्ली या आकार बहिष्कार स्पिन स्तंभों के द्वारा प्राप्त की तुलना में कार्रवाई की एक काफी अलग विधा है. मानव जीनोमिक डीएनए से सूक्ष्म जीवाणु के डीएनए का आकार जुदाई और संवर्धन एक हो सकता हैTruTip बाध्यकारी और क्षालन बफ़र्स अनुरूपण के माध्यम से भविष्य में आवेदन ccomplished.

स्वचालित प्रोटोकॉल यहाँ विभिन्न चिकित्सीय नमूनों के प्रसंस्करण के लिए TruTip केवल पत्थर का खंभा खुद की उपयोगिता, और कैसे यह बड़ी मात्रा में और विशिष्ट तरल से निपटने रोबोट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है पर जोर दिखा. सुव्यवस्थित तरीके आमतौर पर अन्य स्वचालित प्रणाली की तुलना में तेजी से निकासी प्रोटोकॉल में परिणाम. TruTip प्रक्रियाओं को स्वचालित करने के लिए आवश्यक प्राथमिक हार्डवेयर पिपेट चैनल के हाथ खुद के बजाय चुंबकीय छड़, वैक्यूम सिस्टम है क्योंकि TruTip प्रौद्योगिकी की सादगी, तथापि, यह भी एक नया, स्वचालित न्यूक्लिक एसिड शोधन प्रणाली खरीदने में रुचि रखने वालों के लिए कुछ लागत लाभ देता है , या पर बोर्ड सेंट्रीफ्यूज. पहले से भरे अभिकर्मक प्लेटों का उपयोग भी अंतरिक्ष और आवश्यक उपभोग्य कम करने, और रन प्रति throughput को दोहरा सकते हैं. TruTip प्रोटोकॉल के साथ डेक अंतरिक्ष न्यूनतम भी एकीकृत करने के लिए उन्नत उपयोगकर्ताओं को सक्षम नदी के ऊपर या घTruTip साथ ownstream स्वचालित प्रक्रिया. उदाहरण के लिए fractionate पूरे रक्त के लिए हैमिल्टन easyBlood समाधान काफी जैव बैंकिंग प्रक्रियाओं को सरल होगा जो स्वचालित TruTip निष्कर्षण विधि के साथ शामिल किया जा सकता है. ऐसे न्यूक्लिक एसिड quantitation, सामान्य, पीसीआर सेट अप, या डीएनए अनुक्रमण के रूप में बाद के निष्कर्षण प्रक्रियाओं को भी आसानी से बड़ा तरल से निपटने प्लेटफार्मों पर TruTip के साथ एकीकृत कर रहे हैं.

Disclosures

लेखक इस लेख में प्रयुक्त सामग्री का उत्पादन जो Akonni Biosystems, Inc के कर्मचारी हैं.

इस लेख के नि: शुल्क प्रवेश और उत्पादन Akonni Biosystems, इंक द्वारा प्रायोजित है

Acknowledgments

इस काम के भाग अनुदान आर 44 AI072784 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित थे. हम डॉ. कर्स्टन सेंट जॉर्ज, सारा बी GRIESEMER, डेरिल Lamson और वायरल रोगों, वड्सवर्थ केंद्र, मात्रा निर्धारित इन्फ्लूएंजा virions और नैदानिक ​​पुष्टि इन्फ्लूएंजा वास्तविक समय के लिए उपयोग करने के लिए नई स्वास्थ्य के न्यूयॉर्क राज्य विभाग की प्रयोगशाला के एमी डीन धन्यवाद पीसीआर assays.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) Akonni Biosystems, Inc. 300-11120
95% Ethanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC615110040
99% Acetone Sigma-Aldrich 270725-4L
DEPC-treated water Life Technologies AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml Eppendorf 960050100
Deep well plate 96/2,000 μl USA Scientific 30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl Eppendorf 960050100
Equipment
epMotion 5070 System Eppendorf 5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8 960001061
Reservoir rack 960002148
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) Akonni Biosystems, Inc. 300-20341
95% ethanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC615110040
Proteinase K AMRESCO LLC E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack Hamilton Robotics, Inc. 235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack Hamilton Robotics, Inc. 235904
50 ml Reagent Trough Hamilton Robotics, Inc. 187297
Deep Well 2 ml plate USA Scientific 1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml Thermofisher 27874
Reagent Trough Fisher 14-222-412
Equipment
Hamilton STAR System Hamilton Robotics, Inc. 173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm Hamilton Robotics, Inc. 173081/173050
1 ml 96-channel head Hamilton Robotics, Inc. 199090
Tip Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182085
Sample Carriers/Inserts Hamilton Robotics, Inc. 173400/182238
Plate Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182090
Multiflex Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188039
HHS2 Heater Shaker Unit Hamilton Robotics, Inc. 199033
Rack Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188047
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) Akonni Biosystems, Inc. Call to inquire
100% ethanol Sigma-Aldrich 459828-1L
Isopropanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC327270010
Proteinase K AMRESCO LLC E195
Filtered 4 ml Tips Hamilton Robotics, Inc. 184022
Unfiltered 1 ml Tips Hamilton Robotics, Inc. 235939
96-Deep Well Plates USA Scientific 1896-2800
50 ml Conical Tubes Corning/ThermoFisher Scientific 05-526B
50 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 187297
120 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs ThermoFisher Scientific 14-222-412
Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module Hamilton Robotics, Inc. 173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm Hamilton Robotics, Inc. 173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm Hamilton Robotics, Inc. 184090/173050
Plate Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182090
Multiflex Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 188047
120 ml Reagent trough carrier Hamilton Robotics, Inc. 185290
Tip Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182085
50 ml Tube Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182245
24 Position Sample Carriers Hamilton Robotics, Inc. 173400
32 Position Sample Carrier Hamilton Robotics, Inc. 173410
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.

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References

  1. Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
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आम तरल हैंडलिंग रोबोट पर TruTip प्रौद्योगिकी का उपयोग कर नैदानिक ​​नमूनों से डीएनए और आरएनए के उच्च throughput, स्वचालित निष्कर्षण
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Holmberg, R. C., Gindlesperger, A.,… More

Holmberg, R. C., Gindlesperger, A., Stokes, T., Brady, D., Thakore, N., Belgrader, P., Cooney, C. G., Chandler, D. P. High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots. J. Vis. Exp. (76), e50356, doi:10.3791/50356 (2013).

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