Summary
TruTip er en simpel nukleinsyre udvinding teknologi, hvor en porøs, monolitisk bindingsmatrix indsættes i en pipettespids. Følgelig prøveforberedelsen formatet er kompatibelt med de fleste væskehåndteringssystemer instrumenter, og kan anvendes til mange medium til høj-throughput kliniske anvendelser og prøvetyper.
Abstract
TruTip er en simpel nukleinsyre udvinding teknologi, hvor en porøs, monolitisk bindingsmatrix indsættes i en pipettespids. Geometrien af monolit kan tilpasses til specifikke pipettespidser spænder i volumen 1,0-5,0 ml. Den store porøsitet af monolitten muliggør viskøse eller komplekse prøver at passere let igennem det med minimal fluid modtryk. Tovejs flow maksimerer opholdstid mellem monolit og prøve, og muliggør store prøvevolumener skal behandles inden for en enkelt TruTip. De grundlæggende trin, uanset prøvevolumen eller TruTip geometri, omfatter cellelyse, nukleinsyrebinding til de indre porer TruTip monolit, vask væk ubundne prøvekomponenter og lysis buffere, og eluering oprensede og koncentrerede nukleinsyrer i en passende puffer. De attributter og tilpasningsevne TruTip er påvist i tre automatiseret klinisk prøve forarbejdning protokoller ved hjælp af en Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR og STARplus væskehåndteringssystemer robotter, herunder RNA isoleret fra nasopharyngeal aspirat, genomisk DNA isoleret fra fuldblod, og føtal DNA-ekstraktion og berigelse fra store mængder af moderens plasma (henholdsvis).
Introduction
Nukleinsyreoprensning er nødvendig for de fleste molekylær diagnostik, brug udelukkende forskning, og life science applikationer. Forskellige tilgange er dukket siden tidspunktet for phenol / chloroformekstraktioner, hvoraf mange er baseret på det grundlæggende princip om nukleinsyre binding til silica i tilstedeværelse af chaotropiske salte 1.. Udvindingen processen har været strømlines og automatiseres gennem brug af forskellige perle-og membran-baserede formater, med spin-filtre, magnetiske perler og lignende metoder dominerer life science industrien (se eksempler i 2-13). Mens effektive, har partikler og membraner kendte begrænsninger, når de konfronteres med udfordrende kliniske matricer. For eksempel er membraner og perle-baserede kolonner kompatibel, har små pore størrelser (dermed høje modtryk), og kræver en vis form for støtte for at blive behandlet af en centrifuge eller vakuum system. De fysiske egenskaber af membraner og perle kolonner resultere isignifikant strømningsteknisk modstand, hvilket begrænser den type prøver, der effektivt kan behandles uden at tilstoppe den spiselige, og / eller den samlede (input) prøvevolumen, der kan være uni-retningsbestemte behandles gennem strømningsvejen. Omvendt må magnetiske partikler fordeles over hele prøven ved omrøring. Behovet for homogent distribuere magnetiske partikler i en opløsning begrænser det samlede input prøvevolumen, der kan behandles med de fleste magnetiske perle forbrugsvarer. Klinisk prøve attributter (såsom viskositet eller kompleksitet) kan føre til ineffektive magnetisk partikelkoncentration på siden af et rør eller en stang. Desuden kan silica fine partikler brække af perlerne under udpakningen, at miste deres magnetisering og forurener den endelige stikprøve.
Den TruTip teknologi blev udviklet for at overvinde nogle af disse nukleinsyreprøve forarbejdning begrænsninger og begrænsninger 14.. Ved at integrere en porøs monolit i enpipettespids strømningsteknisk modtryk sænkes, hvilket muliggør flowstyring ved vakuum (dvs. pipette aspiration). Denne funktion giver udvindingsprocessen og instrumentering kræves for at oprense nukleinsyrer fra vanskelige prøvetyper der skal forenkles (figur 1). Geometri og porøsitet af skiven er skræddersyet til at minimere tilstopning, mens tykkelsen af monolitten tilvejebringer tilstrækkelig nukleinsyre bindingskapacitet for prøvevolumener spænder fra 1,0 til 5,0 ml. Tovejsstrømning under prøven aspiration og dispensering giver mulighed for længere opholdstider mellem proevekstraktet og bindende monolit til effektiv nukleinsyre nyttiggørelse og eluering og muliggør relativt store prøvevolumener skal behandles som overstiger den mængde kapacitet pipettespidsen selv. Vi har tidligere rapporteret udvikling og anvendelse af en manuel TruTip procedure for rensning influenza RNA fra nasopharynx prøver ved hjælp af en enkelt eller multi-kanal Rainin pipettor 15.. Tilsvarende ekstraktionseffektiviteter blev opnået mellem automatiserede QIAcube og manuel TruTip metoder ved 10 6 genkopier influenza A per ml nasopharyngealt aspirat. Formålet med denne undersøgelse var at påvise mellem-og high-throughput, automatiserede TruTip nukleinsyreoprensning procedurer for nasopharyngealt aspirat (NPA) og andre klinisk relevante prøvetyper, der anvender flydende håndtering robotter almindeligvis findes i reference-kliniske laboratorier.
Protocol
Tre automatiske TruTip udvinding protokoller er beskrevet og vist her: 1) medium-throughput RNA ekstraktion fra NPA på en Eppendorf epMotion 5070, 2) high-throughput genomisk DNA ekstraktion fra små mængder fuldblod på Hamilton STAR, og 3) selektiv isolering og berigelse af fragmenteret føtal DNA fra store mængder af moderens plasma på Hamilton STARplus. Automatiserede scripts er tilgængelige fra Akonni og kun højt niveau program deskriptorer leveres her. Ekstraktion og eluering reagenser automatisk dispenseres fra bulk reagens trug til plader med 96 brønde ved automatiseret script (r) før de kliniske prøver behandles.
1.. Automatiseret RNA Udtræk fra Nasopharyngeal Aspirer
Den tidligere beskrevne manuelle TruTip metode 15 er nu indrettet til at køre på en Eppendorf epMotion 5070 væskehåndtering robot, ved hjælp af en stor pore TruTip matrix indlejret i 1,0 ml Eppendorf rørtte tips, en 2 ml dybe brønd plade (USA Scientific), Akonni TruTip ekstraktionsreagenser og NPA som prøve type. Den epMotion 5070 væskehåndtering robot kan indeholde op til 8 tips samtidigt, så en baseline automatiseret protokol beskrevet for 8 parallel ekstraktioner. Dog kan op til 24 prøver skal behandles i løbet af et enkelt program i ét dybe brønd 96-godt prøve plade. En separat epMotion program er til rådighed (og påkrævet) for at behandle 16 eller 24 prøver. Protokollen beskrevet nedenfor, er til en 8 prøve automatiseret script.
Opsætning
- Bring nasopharyngale prøver RT før udvindingen.
- Dispenser 100 pi nasopharyngeal aspirat plus 150 ul nuklease-frit vand i kolonne 1 i prøven pladen (figur 2A).
- Anbring prøven pladen i position B1 på epMotion Arbejdsbord (Figur 2B).
- Place pipettespidser, TruTips og 30 ml reagens trug onto deres respektive epMotion Worktable positioner (figur 2B).
- Åbn Eppendorf epBlue softwaren, vælg Kør filen fra Akonni for 8 prøver, og indlæse den metode ved at klikke på RUN-knappen på RUN fanen.
- Under niveausensor Indstillinger, vælg Niveauer og tips, og klik på RUN-knappen.
- Input prøvevolumen i softwaren og klikke på RUN.
- Den epMotion script spørger brugeren om at tilføje udvinding og eluering reagenser til reagensbeholdere placeret ved position B2 på Arbejdsbord. Tilsæt de anbefalede mængder af hvert reagens til den respektive trug. For 8 prøver, er mindstekravene reagens bind:
| Reagens | Volumen (ml) | Trough Position |
| 95% ethanol | 3.5 | 2 |
| Wash Buffer D | 9.0 | 3 |
| Wash Buffer E | 9.0 4 | |
| Elution Buffer A2 | 1.3 | 5 |
| Lysis og Binding Buffer D | 11.0 | 6 |
- Input reagensbeholderne mængder i tabellen forelagt af epMotion software under den prompt fra trin 8 ovenfor. De input værdi skal afspejle den faktiske mængde buffer udleveres af brugeren til de respektive reagens reservoir, og skal være større end eller lig med de minimale mængder nævnt ovenfor. Ukorrekte volumen poster kan resultere i ukorrekte mængder leveres af epMotion hardware til hvert rør eller brønd i 96-brønds plade (r).
Automatiseret program
- Vælg KØR for at starte den automatiske metode. Den automatiserede script vil bevæge sig gennem følgende trin uden brugerens medvirken:
Sample Lysis og Reagens Distribution:- Dispensér 375 ul Lysis Buffer D i kolonne 1 og bland i 10cykler (apirate + dispensere = 1 cyklus). Dette trin starter lysis udrugningen mens de resterende reagenser aliquotted.
- Dispensér 1,6 ml vaskebuffer D i kolonne 2.
- Dispensér 1,6 ml vaskebuffer E i kolonne 3.
- Dispensér 50 pi Elution Buffer A i kolonne 4.
- Pause for 6 min for at fuldføre 10 min Prøveinkubation i Lysis Buffer D.
- Tilføj 375 pi ethanol til hver brønd i kolonne 1, blande hver prøve med ethanol gennem 10 pipetteringstrin cyklusser.
- Load 8 TruTips fra stilling A2 på arbejdsbordet, og begynde udvindingsprocessen skitseret i figur 1..
- Aspirer og dispensere prøve / lysisbuffer / ethanol blanding fra kolonne 1 i prøven plade til syv cykler for at binde nukleinsyre til TruTip monolit. Selvom prøvestrømmen gennem TruTip kan variere (på grund af forskelle i klinisk prøve viskositet), nukleinsyre udbytte disse prøve var ingent påvirket ved flow variation. Muligheder for at forbedre prøvestrømmen er beskrevet i diskussionen.
- Flyt TruTips til prøve pladekolonne 2 og cykle Wash Buffer D 5x over monolitten at fjerne resterende lyseringsbuffer og prøve matrix.
- Flyt TruTips til prøve pladekolonne 3 og cykle Wash Buffer E 5x over monolitten at fjerne proteiner og andre forurenende stoffer fra den bundne nukleinsyre.
- Flyt TruTips til den tomme reagens reservoir position 1 (Arbejdsbord placering B2) og cykle 80x (ved et hurtigt flow rate) at tørre monolit. Det er vigtigt at tørre TruTip, som resterende opløsningsmidler i eluerede nukleinsyrepræparater negativt vil påvirke enzymer såsom revers transkriptase og Taq-DNA-polymerase.
- Flyt TruTips til prøveplade kolonne 4 og cykle 5x i Elution Buffer A. udvindes og renset nukleinsyre er nu i elueringsbuffer i prøve pladekolonne 4 brønde.
- Skub TruTips i epMotion affaldsspanden.
Programmet for 16 af total prøver vil gentage trin 10.1 igennem 10.13 hjælp prøveplade kolonner 5-8. For den 24-prøve programmet, 10,1 trin gennem 10.13 gentages 2x bruger prøveplade kolonner 5-8 og 9-12, hhv.
2.. 96-brønds Genomisk DNA Udsugning fra fuldblod
En Hamilton STAR væskehåndtering robot bruges til at bevise automatisk udtrækning af 96 prøver samtidigt fra fuldblod. The Hamilton STAR adskiller sig fra epMotion systemet i at en valgfri varmelegeme / rysteenhed er tilgængelig på dækket, hvilket er vigtigt for enzymatisk fordøjelse af visse klical matricer, såsom fuldblod. Fordi systemet kan udstyres med en 96-kanals pipette hoved, der er en dedikeret 96-brønds plade for hver af de TruTip trin og reagenser.
Opsætning
- Tænd STAR instrument og computer.
- Åbn Hamilton Run Kontrol software.
- Åbn Kør filen fra Akonni til 96 prøver.
- Sted laboratorieudstyr på STAR skjoldet som vist i figur 3..
- Dispense reagenser i deres tilsvarende bølgedale (mængder betegne minimum kræves for at behandle 96 prøver):
| Reagens | Volumen (ml) | Trough Position |
| Lysis og Binding Buffer F | 75 | 5 |
| 95% ethanol | 100 | 6 |
| Wash Buffer J | 175 | 7 |
| VaskeBuffer K | 175 | 8 |
| Elution Buffer A2 | 12 | 9 |
| Proteinase K (20 mg ml -1) | 8 | 15 |
6.. Tillad prøver afbalancere til RT.
7.. Placer prøveglas i Sample Carrier stativer (deck position 4 i figur 3). Placer Prøve 1 i den bageste del af langt venstre holder og bevæge sekventielt ned hver luftfartsselskab med Sample 96 slutter i forreste højre position.
Automatiseret program
- Vælg PLAY knappen i øverste venstre Kør filen vindue og indtaste antallet af prøver, der behandles. Den automatiserede script vil derefter bevæge sig gennem følgende trin uden brugerens medvirken:
Prøve Lysis og Reagens Distribution- Overfør 200 ul fra hvert prøveglas til inkubationsplade ved position 14 på hanater / shaker modul (figur 3).
- Dispensér 80 pi proteinase K i hver prøvebrønd i inkubationsplade.
- Dispensér 600 pi lysisbuffer F i hver brønd af inkubationsplade.
- Bland opløsningen til 10 cyklusser, og derefter inkuberes i 20 min ved 70 ° C og 500 rpm. De 70 ° C sæt temperatur resulterer i en ~ 60 ° C Prøve temperatur inden for dybe brønde, som er inden for området af proteinase K-aktivitet. Mens prøverne inkubere det væskehåndteringssystem fortsætter opererer ved udlevering reagenser i deres tilsvarende plader og brønde:
- 100 pi Elution Buffer A i hver brønd på den dybe brønde på 13-stillingen.
- 800 ul ethanol i hver brønd på den dybe brønde i position 10.
- 1,6 ml vaskebuffer K i hver brønd på den dybe brønde i position 12.
- 1,6 ml vaskebuffer J i hver brønd på den dybe brønde i stilling 11.
- Skub reagens tips hen til affaldsspanden.
Extraction
Denne del af gDNA blod fremgangsmåde er meget lig den epMotion influenza protokol, bortset fra sammensætningen af vaske reagenser og cyklus numre. The Hamilton TruTips tips er sort, så strømmen af væsker gennem TruTip er ikke synlige.
- Load 96 TruTips fra dæk position 3.
- Aspirer og dispensere prøven / lysisbufferen / ethanol blanding i position 10 til 10 cykler for at binde nukleinsyrer til TruTip monolit.
- Flyt TruTips at positionere 11 og cykle Wash Buffer J 5x over monolitten at fjerne resterende lyseringsbuffer og prøve matrix.
- Flyt TruTips til position 12 og cyklus vaskebuffer K 5x at fjerne proteiner og andre forureninger fra den bundne nukleinsyre. Cyklus TruTip 40x ved høj hastighed til at lufttørre.
- Flyt TruTips til position 13 og cyklus 5x i Elution Buffer A2. Den ekstraherede og oprensede nukleinsyre er nu i elueringsbuffer i dybe brønde.
- Skub TruTips hen til affaldsspanden.
Når programmet er færdigt, fjernes Elution Plate fra instrumentet og overføre de ekstraherede prøver til de passende rør til opbevaring eller efterfølgende anvendelser.
3.. DNA Udsugning fra storskalaproduktion Plasmaprøver
The Hamilton STARplus instrument anvendes til at demonstrere en automatiseret protokol til udvinding frit cirkulerer føtal DNA fra 5 ml af maternel plasma. Det STARplus systemet kan understøtte to automatiske pipette kanal arme, den ene med 8 x 5 ml kanaler og en med 8 x 1 ml kanaler. Disse arme kan fungere sideløbende i forskudt forarbejdning i partier af 8 prøver hver. En 5 ml TruTip anvendes til indledende large-volumen udvinding, og en 1 ml TruTip bruges til størrelse separation og yderligere koncentrering af den ekstraherede nukleinsyre.
Set-up
- Tænd STARplus instrument og computer.
- Åbn Hamilton Run Kontrol software.
- Åbn Kør filen fra Akonni til 8 store mængder plasmaprøver.
- Sted laboratorieudstyr på STARplus dæk som vist i fig. 4.
- Dispense reagenser i deres tilsvarende reservoirer:
| Reagens | Volumen (ml) | Trough Position |
| CN-W1 | 17 | 5A |
| CN-W2 | 17 | 5B |
| CN-W4 | 21 | 5C |
| Proteinase K (20 mg ml -1) | 5 | 6A |
| EBB | 17 6B | |
| EBA2 | 5 | 6C |
| CN-W3 | 5 | 6D |
| CN-B2 | 5 | 6E |
| CN-B3 | 5 | 6F |
| CN-L1 | 52 | 7 |
| CN-B1 | 175 | 8 |
- Tillad prøve at afbalancere til RT.
- Placer prøveglas i Sample Carrier stativer (dæk position 3 i figur 4). Sted Prøve 1 i den bageste og flytte sekventielt mod forsiden af dækket.
Automatiseret program
På grund af den store input prøvevolumen, skal lysis og homogenisering trin udføres uden af Hamilton STARplus instrumentet i et vandbad. Trin, som kræver indgriben fra brugeren inden for den automatiserede protokol er angivet med en stjerne (*) på beginning af sætningen, og fed type.
Prøve Lysis og Reagens Distribution: Prøven inkuberes med proteinase K og lysisbuffer at homogenisere prøven og frigive DNA.
- Vælg PLAY knappen i øverste venstre Kør filen vinduet. Input antallet af prøver, der behandles, placeringen af pipettespidser på dækket, og placeringen af TruTips på dækket.
- Den automatiseret script tilføjer 615 pi proteinase K, 5 ml plasma, og 6,2 ml Lysis Buffer CN-L1 til hver 50 ml konisk rør, og vil derefter PAUSE.
- * Fjern de 50 ml koniske rør fra prøven dæk, vortex for 30 sec på høj hastighed, og inkuber off-line i 30 minutter ved 60 ° C i et vandbad eller varmeblok. Efter koniske rør er fjernet fra Hamilton dæk, genoptage automatiseret script til at fortsætte dispensering reagenser i deres respektive plader og brønde (figur 4B og 4C):
- 2 ml CN-W2 hver anden brønd i position 9 kolonne 2.
- 2 ml CN-W4 til hver anden brønd i position 9 kolonne 3.
- 250 pi EBA2 til hver anden i god position 9 kolonner. 4 og 5.
- 495 pi CN-B2 til hver anden brønd i position 10 kolonne 1.
- 1 ml EBB til hver anden brønd i position 10 kolonne 2.
- 500 pi CN-W3 til hver anden brønd i position 10 kolonne 3.
- 500 pi KN-W4 til hver anden brønd i position 10 kolonne 4.
- 50 pi EBA2 til hver anden brønd i position 10 kolonne 5.
Fordi de 5 ml kanalerne er for brede til at bruge tilstødende brønde for hver prøve, de automatiske program dispenserer reagenser ind i hver anden brønd på dybe brønd plade i bunken position 9. Den mekaniske arm anvendes til 1 ml-kanaler kræver også brug af enhver anden brønd i reagensplader for udelukkelse og koncentration steps i protokollen.
Efter dispensering reagenser, vil programmet PAUSE.
- * Efter 30 min, 60 ° C inkubation placere 50 ml koniske rør på is i 5 minutter.
- * Vend tilbage de 50 ml koniske rør til deres oprindelige positioner i prøven bagagebærer på dæk position 4, og genoptage automatiseret script.
- Tilføj 12 ml Binding Buffer CN-B1 til hvert prøverør og bland 10x.
Storskalaproduktion Ekstraktion: 5 ml TruTips anvendes til ekstraktion totalt DNA fra lyserede plasmaprøve.
- Saml 5 ml TruTips fra position 2 for stort volumen nukleinsyre ekstraktion.
- Cyklus prøven mixture15 gange i 50 ml konisk rør, der starter ved bunden af røret og bevæger 3 mm højere efter hver pipetteringen cyklus. Dette trin binder den samlede nukleinsyre til TruTip monolit.
- Flyt TruTips til de dybe brønde på position 6 kolonne 1, og cyCle 1x i vaskebuffer CN-W1.
- Flyt TruTips at placere 9 kolonne 2 og cykle 1x i Wash CN-W2.
- Flyt TruTips at placere 9 kolonne 3 og cykle 2x i Wash CN-W4.
- Flyt TruTips at placere 9 kolonne 4 og cykle 40x ved høj hastighed for at tørre bindende matrix.
- Flyt TruTips at positionere 9 kolonne 5 og cyklus 10x at eluere de bundne nukleinsyrer fra de 5 ml TruTips. Dette er stort volumen eluering # 1.
- Flyt TruTips til kolonne 6 og gentag trin med den anden portion af elueringsbuffer. Dette er stort volumen eluering # 2.
- Overfør eluering # 2 i position 9 spalte 5 for at kombinere det med eluering # 1, og kassér TruTips.
Udelukkelse og Koncentration: Den DNA med høj molekylvægt er fjernet fra den ekstraherede prøve, og det resterende DNA isoleres og koncentreres.
- Tilføj kombinerede eluent fra trin 22 til position 10 kolonne 1 og bland grundigt 10x.
- Saml 1 ml TruTips fra position 13 og cyklus 20x til at binde DNA med høj molekylvægt til monolit.
- Flyt TruTips til position 10 kolonne 2 og cyklus 5x at skylle spidsen og fjerne DNA med høj molekylvægt. De TruTips bevares og føres tilbage i spidsen rack position 13..
- Med reagens tips fra position 12, tilsættes 575 ul Binding Buffer CN-B3 til prøven i position 10 kolonne 1 og bland 10x.
- Afhente TruTips fra trin 25, tilbage til position 10 kolonne 1, og cykle 20x til at binde den resterende DNA fra prøven til 1 ml TruTip.
- Flyt TruTips at placere 10 kolonne 4 og cykle 1x i Wash CN-W3 til at fjerne eventuelle resterende hæmmere.
- Flyt TruTips at placere 10 kolonne 5 og cykle 1x i Wash CN-W4 at skylle resterende salte fra CN-W3.
- Hæv TruTips løbet position 10 kolonne 5 og cykle luft gennem tips 35x at tørre monolit.
- Flyt TruTips at placere 10 kolonne 6 og cykle 10x i EBA2 at eluere det rensede, size-udvælgelseTed og koncentreret nukleinsyre.
- Kassér TruTips.
- Overfør det eluerede prøve fra kolonne 6-1,5 ml rør i position 11. Ekstraherede prøver er klar til lagring eller videre forarbejdning.
Representative Results
Real-time PCR data for influenza RNA-ekstraktion fra NPA er vist i figur 5A. Anslået nukleinsyre udsugningseffektivitet ligner resultater opnået med den manuelle version af protokollen 15.. En lineær respons i gennemsnit C t-værdier er observeret mellem 10 4 og 10 6-gen kopier ml -1 ændrede influenza (R 2 = 0,99 og 0,98 for influenza A og B, henholdsvis), med standardafvigelser i gennemsnit C t-værdier mindre end 1 cyklus. Fraværet af krydskontaminering med epMotion systemet demonstreret i figur 5B, hvor 12 positive NPA prøver indeholdende 10 6 gen kopier ml -1 NPA blev afbrudt med 12 buffer blanks. Den gennemsnitlige C t for de positive kontroller var 30,16 ± 0,14 og alle buffer blanks var negative. Den samlede stikprøve behandlingstid er 16, 28 og 40 min til 8, 16 og 24 prøver, hhv.Fordi en typisk klinisk nasopharyngeal aspirat eller svaber vil indeholde 10 7 gen kopier ml -1 (under forudsætning af 1.000 virioner pr TCID50 16 og> 10 4 TCID 50 ml -1 influenza 17), er den automatiserede epMotion protokollen forventes at være effektive på et flertal af kliniske NPA prøver.
I betragtning af antallet af molekylære tests udført på human genomisk DNA, er det primære mål for nukleinsyre ekstraktion fra fuldblod til at producere uforurenede, høj molekylvægt genomisk DNA. Den automatiserede protokol for 96 prøver er afsluttet inden for 1 time, hvilket er en forbedring i forhold til andre automatiserede systemer (fx Promega MagneSil = 90 min og Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx systemet = 2,5 timer). Figur 6A viser UV / Vis-absorbans profiler for 45 positive blodprøver behandles samtidigt med 45 reagensblindprøver på Hamilton STAR-protokollen, med en gennemsnitlig A
Real-time resultater fra otte gentagne prøver af en poolet moderens plasma prøve behandles med stor volumen TruTip procedure er vist i figur 7. Den komplette protokol (herunder off-line proteinase K inkubering) er færdig i cirka 2,5 time, svarende til Qiagen manuel Cirkulerende Nucleic Acids Kit (ingen sammenlignelige automatiserede udvinding kits er endnu tilgængelig). De gennemsnitlige C T værdier over alle replikater er 34,58 ± 0,66 og 29,76 ± 0,50 for føtal han (CHY) og total (CH1) DNA henholdsvis som viser fremragende repeterbarhed automatiserede ekstraktion metode. Koncentrationen af føtalt DNA i det totale DNA pool (i genom-ækvivalenter), er beregnet på baggrund fit punkt analyse sammenligning med standarder med resulterende gennemsnit% føtalt DNA tværs af alle prøver af 2,8%. Den faktiske% føtalt DNA for denne prøve er ukendt, fordi prøverne blev samlet før udførelse af ekstraktionen. Føtal DNA sammensætningi ikke-samlet plasma prøver ekstraheret ved hjælp af TruTip metode er typisk 1,5 gange højere sammenlignet med resultater med en Qiagen Cirkulerende Nucleic Acids Kit (ikke vist).
Figur 1. Den TruTip udpakningen og arbejde flow, uanset den væskehåndteringssystem. Andre prøveforberedelse eller væskehåndteringssystemer trin kan indarbejdes i automatiserede rutiner afhængigt af funktionerne i den specifikke væskehåndtering instrument og software.
Figur 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 prøveplade layout. (B) Arrangement af reagenser / Consumatabeller om arbejdsbordet. Prøven plade kan konfigureres op til 24 prøver (kolonne 1, 5 og 9, henholdsvis), skønt epMotion kun vil behandle et maksimum af 8 prøver samtidigt. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Hamilton STAR dæk layout til rensning genomisk DNA fra fuldblod (ikke målfast) Deck Position 1 = Hamilton 1 ml filtreret tips,. 2 = Hamilton 1 ml ikke-filtreret tips, 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; 4 = input blodprøver luftfartsselskaber (blodopsamlingsrør eller mikrocentrifugerør), 5-9 = 290 ml reagens trug til Lysis Buffer F, Ethanol, Wash Buffer J, Wash Buffer K og Elution Buffer A2, henholdsvis 10 = 96 dEEP godt Bindende plade; 11 = 96 dyb brønd Wash J 12 = 96 dyb brønd Wash K, 13 = 96 dyb brønd Elution plade; 14 = Hamilton HHS2 varmelegeme / shaker med Nunc 96 dyb brønd Incubation plade; 15 = 50 ml reagens trough indeholdende proteinase K. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Hamilton STARplus dæk layout til oprense dna fra store volumen plasmaprøver (ikke målfast). Systemet er udstyret med 8 x 5 ml kanaler og 8 x 1 ml kanaler (ikke vist i bunken layout). Deck Position 1 = Hamilton 4 ml filtreret tips, 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips, 3 = kilde plasmaprøver, 4 = 50 ml koniske rør; 5 = 120 ml reagens trug indeholdende CN-W1, CN-W2 og CN-W4 ReageNTS, 6 = lav volumen reagens trug indeholdende proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, ebbe og CN-W3 reagenser 7 = 290 ml reagens kar med CN-L1 reagens, 8 = 290 ml reagens kar med CN -B1 reagens, 9 = 96 dybbrøndsplader for Trin 1, 10 = 96 dybbrøndsplader til Trin 2, 11 = prøvens bærestoffer for renset, færdige produkt 12 = Hamilton 1 ml ufiltrerede tips, 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. Klik her for at se større figur .
Figur 5. (A). Real-time PCR resultater fra automatiseret TruTip udvinding af influenzavirus tilføjet i nasopharyngealt aspirat (NPA). Input NPA volume = 100 ul, elueringsvolumen = 50 ul. Resultaterne er gennemsnittet af 3 gentagne extractions fra 5 forskellige NPA baggrunde (n = 15) pr fortynding niveau, og influenza målet. qPCR blev udført på LightCycler 480-system med assay, der er beskrevet tidligere 15. (B) Ingen krydskontaminering opdages, når 12 positive NPA prøver er spækket med nogen skabelon kontrol og er omfattet af den automatiske ekstraktionsmetode. Klik her for at se større figur .
Figur 6.. Resultater af humant genomisk DNA-ekstraktion fra fuldblod. A) UV-synlige spor fra en NanoDrop 1000 (ThermoFisher) fra 10 tilfældigt udvalgte replikater. B) 1% agarose gel af TruTip renset gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Stige. Banerne 1 - 4 = ~ 100 ng renset gDNA fra fire tilfældigt udvalgte replikater. Klik her for at se større figur .
Figur 7. Real-time PCR resultaterne fra otte replikat TruTip ekstraktioner af frit cirkulerende DNA fra plasma. Prøver betegnet med en stjerne (* eller **) blev ekstraheret på separate dage. CHY kvantificerer mandlige foster DNA og CH1 kvantificerer totale DNA til stede (føtal og maternel). qPCR blev udført på en LightCycler 480-system (Roche) med tidligere publicerede assays rettet CHY og CH1 18..
Discussion
Enkeltheden af TruTip koncept og workflow (figur 1) gør det let tilpasses, automatiseret og effektiv for en række kliniske prøvematricer, input prøvevolumener og flydende håndteringssystemer. Det bør imidlertid erkendes, at hver klinisk prøve er unik, og vil variere ene til den næste i viskositet, partikler, slim, overfladeforurening, mikrobielle og / eller humane genetiske baggrunde. Da forventede variationer i klinisk prøve sammensætning og planlagt anvendelse af en automatiseret TruTip prøveforberedelse protokol, kan det derfor være nødvendigt at ændre visse trin i en TruTip procedure for at opnå de ønskede resultater for en bestemt prøvetype. Uanset prøvetypen imidlertid TruTip parametre, der typisk har størst betydning for nukleinsyre renhed og / eller nyttiggørelse omfatter:
- Prøve blanding og homogenisering med lysisbuffer (og alkohol). Mens TruTips har en relatively stor porestørrelse, prøve homogenisering og fortætning er meget vigtigt for en effektiv cellelysis, og senere bindende trin til TruTip monolit. Med en homogen og godt flydende lysat, kan prøverne bevæge sig gennem TruTip med højere strømningshastigheder, hvilket reducerer den samlede prøve behandlingstid. Den store volumen plasma-protokollen viser potentialet for brugere til grundigt homogenisere og liquefy svære prøver (on-line eller off-line), på trods af den store indgang prøvevolumen.
- Strømningshastigheder. Langsommere flowhastigheder løbet nukleinsyre bindende eller eluering typisk resultere i højere nukleinsyre udbytter, omend på bekostning af den samlede behandlingstid. Langsommere strømningshastigheder kan også reducere omfanget af DNA klipning.
- Cycle numre. Det optimale antal af aspiration og dispensere cyklusser afhænger prøvetype totalt prøvevolumen og strømningshastigheder. Trin 1 i Figur 1 er typisk det sted, hvor cyklus numbers (og strømningshastigheder) kan kræve nogle empirisk optimering, med prøver, såsom nasopharyngeal aspirat (figur 5), der repræsenterer en af de mere udfordrende lysater at optimere grund intervallet NPA viskositeter fra forskellige patienter.
- Tørring. Komplet tørring af TruTip monolit er bydende nødvendigt at forhindre resterende organiske opløsningsmidler fra medeluering med den rensede nukleinsyreprøve og hæmmende downstream-processer eller tests. Fordi TruTip ikke tørres via centrifugering eller vakuumfiltrering, er det vigtigt at maksimere både strømningshastigheden og cyklus numre under tørringstrinnet. Nogle gange er der en resterende dråbe af vaske løsning på endepunktet for TruTip efter tørrecyklusser er afsluttet. Hamilton robotten har evnen til at udføre en "tip berøring" på siden af brønden for at frigive dråben, hvilket sikrer en opløsningsmiddel-fri eluering. Den epMotion system ikke har denne funktion, men en pre-skylning af TruTip endestation i elution buffer kan programmeres til at opnå samme virkning.
Fordi geometri, pipettespidsen materiale og fastgørelse metode til robot kanal arme er unikke for hvert instrument fabrikanten, en anden TruTip konstruktion kræves for hver væskehåndteringssystem. De TruTip monolit dimensioner (diameter, tykkelse og porestørrelse) ikke korrelerer med nukleinsyre bindende kapacitet (og eluering effektivitet), er som forventet for en fast-fase ekstraktion teknik. Mens tyk (> 4 mm) matricer kan være indlejret i en 1 ml TruTip at øge nukleinsyrebinding kapacitet til store mængder prøver og / eller udligne bindingskapaciteten tværs specifikke TruTip formater, der er en afvejning mellem TruTip tykkelse og strømningshastigheder under den indledende bindende trin (i nærvær af rå lysater). Således er det nogle gange en fordel at integrere større diameter bautasten i større volumen pipettespidser til de indledende trin i en automatiseret protokol (f.eks </ Em> de 5 ml Hamilton / Akonni TruTips for stor volumen ekstraktioner). I betragtning af de specifikke TruTip konfigurationer dikteret af producenterne af væskehåndteringssystemer robotter, men vi ikke nødvendigvis forvente TruTip nukleinsyre udbytter til at være ens på tværs væskehåndteringssystemer platforme fra forskellige producenter eller på tværs af forskellige TruTip størrelser.
Kliniske prøver (pr. definition) vil indeholde betydelige mængder af humant genomisk DNA, medmindre de er erhvervet fra normalt sterile steder (f.eks cerebral spinalvæske). Undertiden humant genomisk DNA ønskes (som i figur 6), mens det i andre applikationer menneskelige DNA repræsenterer en uønsket genomisk baggrund (som for figur 5). Tilstedeværelsen af baggrunds-DNA er normalt ikke problematisk, så længe den totale mængde af nukleinsyre i prøven ikke overstiger bindingskapacitet monolit, og baggrunden DNA kan tjene som en bærer, hvis den ønskede målnucleinsyrensyre er til stede i spormængder. Formålet med den højvolumen plasma udvinding protokol (fig. 7) er at isolere (fragmenteret) føtalt DNA i nærvær af en 10-20 fold overskud af moderens DNA, som svarer til prøveforberedelse målet af smitsomme sygdomme tests, bortset fra at sekvenserne er stærkt kongruent og kan kun skelnes ved meget specifik molekylær test og / eller størrelse diskrimination. I dette tilfælde er den samlede cirkulerende DNA isoleret ved hjælp af en 5 ml TruTip, og efterfølgende høj-molekylære og lavmolekylære føtal DNA separeres gennem efterfølgende binding og eluering til en 1 ml TruTip ved at ændre de bindingsbuffer betingelser. Selektiv størrelse adskillelse og berigelse af målnukleinsyrer baseret på deres binding og eluering egenskaber på en silica-monolit er et væsentligt anderledes virkningsmekanisme end opnået ved membraner eller gelpermeations spinsøjler. Størrelse adskillelse og berigelse af mikrobielt DNA fra humant genomisk DNA kan være enccomplished i fremtidige programmer via tilpasning TruTip bindende og elueringsbuffere.
Den automatiserede protokoller viste her understrege nytten af TruTip monolit selv til behandling forskellige kliniske prøver, og hvordan det kan tilpasses til store mængder og specifikke væskehåndteringssystemer robotter. De strømlinede metoder typisk resultere i hurtigere udvinding protokoller i forhold til andre automatiserede systemer. Enkeltheden i TruTip teknologi, men giver også nogle omkostningsfordele for dem interesseret i at købe en ny, automatiseret nukleinsyre rensning system, fordi den primære hardware, der kræves for at automatisere TruTip procedurer pipetten kanal arm snarere end magnetiske stænger, vakuum systemer eller om bord centrifuger. Udnytte fyldte reagensplader kan også reducere plads og krævede forbrugsvarer, og fordoble gennemløb per løb. Minimering dæksplads med TruTip protokoller gør det også muligt avancerede brugere til at integrere tidligere eller downstream automatiserede processer med TruTip. For eksempel Hamiltons easyBlood løsning på fraktionering fuldblod kan indarbejdes med det automatiserede TruTip ekstraktion metode, som medfører en væsentlig strømlining bio-banking-processer. Post-udvinding processer såsom nukleinsyre kvantificering, normalisering, PCR set-up, eller DNA-sekventering er også let integreres med TruTip de større væskehåndteringssystemer platforme.
Disclosures
Forfatterne er ansat i Akonni Biosystems, Inc., der producerer materialer i denne artikel.
Gratis adgang og produktionen af denne artikel er sponsoreret af Akonni Biosystems, Inc.
Acknowledgments
Dele af dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) under tilskud R 44 AI072784. Vi takker Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson og Amy Dean af Laboratoriet for virussygdomme Wadsworth center, New York State Dept. of Health for kvantificerede influenza virioner og adgang til klinisk valideret influenza realtid PCR-assays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) |  Akonni Biosystems, Inc. |
300-11120 | |
| 95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
| 99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
| DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
| Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
| Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
| epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
| Equipment | |||
| epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
| Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
| Reservoir rack | 960002148 | ||
| Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
| Reagent/Material | |||
| TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. |
300-20341 | |
| 95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
| Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
| 1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
| 1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
| 50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
| Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
| Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
| Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
| Equipment | |||
| Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
| 1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
| 1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
| Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
| Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
| Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
| Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
| HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
| Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
| Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
| Reagent/Material | |||
| TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. |
Call to inquire | |
| 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
| Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
| Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
| Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
| Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
| 96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
| 50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
| 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
| 120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
| Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
| Equipment | |||
| STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
| 1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
| 5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
| Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
| Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
| Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
| 120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
| Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
| 50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
| 24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
| 32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
| Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. | |||
References
- Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Baker, M. P., Mitchell, A., et al. Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology. BioTechniques. 31, 142-145 (2001).
- Sinclair, B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. The Scientist. 12, 17-24 (1998).
- Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl. Acids Res. 30, e32 (2002).
- Levison, P. R., Badger, S. E., et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification. J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).
- Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment. Vox Sang. 89, 71-76 (2005).
- Perelle, S., Cavellini, L., et al. Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water. J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).
- Riemann, K., Adamzik, M., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).
- Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids. J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).
- Kessler, H., Mühlbauer, G. Fully automated nucleic acid extraction. MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).
- Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing. Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).
- Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).
- Kruhøffer, M., Voss, T., et al. Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications. J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).
- Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. Belgrader, P. , US7759112 (2010).
- Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples. J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).
- Chan, K. H., Lai, S. T., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).
- Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A. subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).
- Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).
