Summary
עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים ריאגנטים,
Abstract
נמטודות התולעת ג elegans הוא אורגניזם מודל אידיאלי להדמיה פשוטה יחסית, בעלות נמוכה עצבית בגוף חי. גופו הקטן השקוף ופשוט, מערכת עצבים היטב מאופיינת מאפשר זיהוי והדמית קרינה של כל נוירון בתוך החיים השלמים. טכניקות קיבוע פשוטות עם השפעה מינימאלית על הפיסיולוגיה של בעלי החיים מאפשרות שיקוף מורחב זמן לשגות. הפיתוח של fluorophores הרגיש סיד הגנטי מקודד כגון 1 Cameleon וGCaMP 2 לאפשר בתחום הדמית vivo של סיד עצבי הנוגע גם פיזיולוגיה של תא ופעילות עצבית. זנים מהונדסים רבים מבטאים fluorophores אלה בתאי עצב ספציפיים הם זמינים או ניתן לבנות תוך שימוש בטכניקות מבוססות היטב. כאן, אנו מתארים הליכים מפורטים למדידת דינמיקת הסידן בתוך תא עצב יחיד בגוף החי הוא באמצעות GCaMP וCameleon. אנו דנים ביתרונות וdisadvantגילים גם כן שיטות שונות של הכנת מדגם (קיבוע בעלי חיים) וניתוח תמונה. לבסוף, אנו מציגים תוצאות משני ניסויים: 1) שימוש GCaMP למדוד את התגובה החושית של נוירון ספציפי לשדה חשמלי חיצוני ו2) שימוש בCameleon כדי למדוד את התגובה הפיזיולוגית של סיד נוירון לניזק ליזר טראומטי. שיטות הדמית סידן כגון אלה נמצאים בשימוש נרחב בג elegans והורחב למדידות בבעלי חיים שנעו בחופשיות, נוירונים מרובים בו זמנית והשוואה על פני רקע גנטי. ג elegans מציג מערכת חזקה וגמישה להדמיה עצבית vivo עם יתרונות על פני מערכות מודל אחרות בפשטות ועלות טכניות.
Introduction
כאן אנו מציגים שיטות מעשיות לתחום הדמית vivo סיד בג הנוירונים elegans. הפיתוח של fluorophores סיד רגיש המקודד גנטי עם יחס גבוה בין אות לרעש גורם ג elegans מערכת יעילה יחסית פשוטה ועלות למדידת נוירופיזיולוגיה ופעילות. ההדמיה שלנו נעשתה באמצעות מיקרוסקופ מתחם סטנדרטי באמצעות דימות פלואורסצנטי שדה הרחב של fluorophores הזמין בדרך כלל. אנו מציגים כמה טכניקות המעסיקות fluorophores שונה ותכשירים שונים לדוגמה, דנים בנקודתי החוזק והחולשה של כל אחד. נתונים שהוצגו אז משני ניסויים לדוגמה. משאב נוסף מצוין בטכניקות המתוארות כאן ניתן למצוא בWormBook, "הדמיה את הפעילות של תאי עצב ושרירים" על ידי ר 'קר, (http://www.wormbook.org 3).
שני סוגים עיקריים של genetiכתבי סיד ניאון מקודדים קאלי משמשים בדרך כלל בג elegans: GCaMP ערוץ אחד וCameleon סריג מבוסס. אנו מתארים שיטות ולהראות דוגמאות לנתונים שנוצרו על ידי כל אחד.
GCaMP מבוסס על חלבון שונה גרין פלורסנט (GFP), כי הוא רגיש לריכוז הסיד שמסביב. המטרה זו מושגת על ידי שילוב של GFP וcalmodulin חלבון זיקת סידן הגבוה, באופן שמחייב של סידן על ידי calmodulin מביא מולקולת GFP לאישור ניאון יעיל 2. את הפיתוחים האחרונים בfluorophores אלה יוצרים גודל אות יוצא דופן עם גידול של עד 500% בעוצמת קרינה על פני טווח פיסיולוגי של רמות הסידן וקינטיקה במהירות סבירה של זמן ~ 95 אלפיות עלייה ודעיכה ~ 650 אלפית 4. על פני תקופות זמן קצרות יחסית (דקות), האותות הגדולים האלה יכולים לאפשר להדמיה ברזולוציה נמוכה יותר (גדלה נמוכה יותר), וניתנו מחונך initמדידת קו הבסיס IAL, שוללת את הצורך הבסיסי רציפות או מדידות השוואתיות.
Cameleon יש את היתרון של להיות fluorophore סריג מבוסס שמייצר מדידת ratiometric השוואה שני ערוצים או אורכי גל 1 עצמאיים. זה מורכב משני fluorophores הנפרד (חלבוני ניאון וצהוב ציאן פולט, וYFP CFP) מקושר על ידי חלבון calmodulin. המתחם מואר באור כחול (440 ננומטר) שמרגש CFP. עקידת הסיד מביאה את fluorophores ביחד קרוב, הגדלת העברת אנרגית תהודת פלואורסצנטי (סריג) מCFP (תורם) לYFP (acceptor) וגורם לפליטת CFP (480 ננומטר) כדי להקטין וYFP הפליטה (535 ננומטר) כדי להגדיל . רמות סידן יחסיות נמדדות כיחס בין עוצמת YFP / CFP. קינטיקה Cameleon היא איטיות יותר מזה של GCaMP, נמדד בגוף חי יש זמן עלייה של ~ 1 שניות וזמן דעיכה של ~ 3 שניות 5. עם זאת,היחס של אותות הפוכים נעים מגדיל את גודל האות ומפצה על מספר החפצים אפשריים עקב שינויים בריכוז fluorophore, תנועה או להיסחף פוקוס וההלבנה.
כתבי ניאון מקודד גנטי לשלול הרבה של הכנת המדגם הנדרש עם בדיקות מנוהלות exogenously וג גוף שקוף קטן elegans מאפשר הדמיה תוך שימוש בבעלי החיים בשלמות פלואורסצנטי שדה הרחב פשוט. האתגר הטכני העיקרי בהכנת מדגם לכן, כדי לשתק את החיות בשלום. ישנן מספר טכניקות שונות נפוצים כל אחד עם יתרונות וחסרונות. שימוש תרופתי לשתק את בעלי החיים הוא קל לביצוע ומאפשר הרכבה של חיות מרובות בהכנה אחד (Levamisole, אגוניסט כולינרגית שגורם לרקמת שריר לתפוס הוא בדרך כלל בשימוש 6). ג elegans גם יכול להיות משותק מבחינה פיזית על ידי הרכבתםעל נוקשה 10% agarose 7, 8. השפעה זו מצמצמת בפיזיולוגית בעלי חיים, מאפשרת הדמיה לטווח ארוך (שעות) והתאוששות של בעלי חיים רבים, אבל הוא יותר קשה מבחינה טכנית. שתי הטכניקות האלה להגביל את הגישה פיזית לבעלי החיים (שהם תחת תלוש כיסוי) ולכן יכולים לשמש רק עם גירויים ניסיוניים מסוימים (כמו אור, טמפרטורת שדה, חשמלי או ניזק ליזר). לגירויים שבו גישה פיזית נדרשת, כגון מגע או ממשל של כימיקלים, מחקרים רבים דבוקים בהצלחה ג elegans במקום (באמצעות דבק כיתת וטרינרית) 9. זה יותר מאתגר מבחינה טכנית, הוא תכשיר בהמה אחת ולא מאפשר התאוששות של בעלי חיים. לבסוף, מכשירי microfluidic רבים להיות מועסקים כי פיזי לרסן ג elegans, שימור פיזיולוגית בעלי חיים, המאפשר חשיפה למרבית סוגי גירויים (תלוי בעיצוב המכשיר) ויכול לאפשר חליפין והתאוששות מהירים של בעלי החיים השיטות שהוצגו כאן יכולות לשמש למדידת פעילות עצבית ופיזיולוגיה של תא בג elegans. אנחנו נותנים דוגמה לכל אחד: שימוש GCaMP למדוד את התגובה החושית של ASJ נוירון לשדה חשמלי חיצוני, ובאמצעות Cameleon כדי למדוד את התגובה הפיזיולוגית לסיד ניזק ליזר של תא עצב. דוגמאות אלו מראות את היתרונות וחסרונות של שני סוגים של fluorophores ולהמחיש מה אפשרי עם המערכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנה אופטית
- השתמש במיקרוסקופ מתחם רגיל עם יכולות הדמיה epifluorescence. אנו משתמשים במיקרוסקופ ניקון אקליפס TI-U הפוך עם פנס HG Intensilight.
- לתמונה הטובה ביותר ואיכות אות להשתמש הגדלה גבוהה, אובייקטיבי צמצם מספרי גבוהה. אנחנו בדרך כלל משתמשים בניקון אובייקטיבי X60 1.4 NA שמן טבילה. במקרים מסוימים ניתן להשתמש בהגדלה נמוכה (X40, X20) בהתאם לרמת ביטוי של fluorophore ועוצמת אות.
- השתמש ברגישות גבוהה המקוררת CCD מצלמה, כגון מצלמה יידור קלרה כדי למקסם את רגישות תמונה ולמזער את רעשי רקע.
- לfluorophores צבע אחד להשתמש במסנן פלואורסצנטי מיקרוסקופ הרגיל להגדיר מיועד לאורך גל המסוים של fluorophore. לGCaMP להשתמש סטנדרטי GFP מסנן מוגדר מותאם לעירור ב488 ננומטר ופליטה ב 525 ננומטר. אין שינויים אופטיים נוספים נדרשים.
- מסנן מיקרוסקופ להגדיר עם 440 ± 20 ננומטר ומסנן עירור 455 ננומטר ארוך לעבור מראה Dichroic.
- מסכת תמונה הונחה במטוס התמונה הראשונית מייד מחוץ למיקרוסקופ הדמית נמל (שבו חיישן CCD המצלמה הייתי יושב בדרך כלל). זה מגביל את שדה הראייה כך שזה יהיה למלא רק חצי מחיישן המצלמה. הצבת מסכה זו בתוצאות הראשונות תמונת המטוס בגבולות תמונה חדות וללא חפיפה, כאשר שני תמונותיהם מוקרנות Side-by-צד.
- עדשת הממסר הראשונה שנקבעה אורך מוקד אחד במרחק לאהוא מטוס תמונה ראשוני כזו כי זה collimates האור.
- מראה Dichroic שמפצל את האור לשני אורכי הגל הנפרדים ההדמיה או ערוצים המשקפים צבע אחד (> 515 ננומטר, צהוב) תוך העברה האחרת (<515 ננומטר, ציאן).
- מסנני פליטה (מסנני להקה עוקפת) המגבילים את האור מועבר בהמשך לאורכי הגל הספציפיים ההדמיה (ציאן ב485 ± 40 ננומטר וצהוב ב535 ± 30 ננומטר),
- עדשות 2 הממסר (אחד לכל ערוץ) שהונחו במסלולי קרנות כאלה שזה להתמקד במשהו את האור לתמונת מטוס שני במצלמת CCD.
- זוג מראות ומראה שנייה Dichroic מכוון מסלולי קרנות כאלה ששני תמונות recombined וצפוי Side-by-צד על חיישן CCD המצלמה. האיור 4A מראה דוגמה של תמונה הנוצרת.
- מערך אופטי ראשוני: התחל התקנה ויישור של אופטיקה עם ניגודיות גבוהה ולדמייןדואר באמצעות תאורת שדה רחב אור מועבר (sharpie שחור נמתח בשקופית מיקרוסקופ עובד היטב) עדשה והגדלה נמוכה. להביא את התמונה להתמקד דרך oculars מיקרוסקופ ולאחר מכן עבר לנמל מיקרוסקופ כדי לשמש. עם תאורת אור גבוהה להציג את התמונה על כרטיס מדד במישור המוקד הראשוני (כמה סנטימטרים מחוץ לנמל מיקרוסקופ). מניח את עדשת ממסר 1 (ג) בדרך הקורה כזה שזה מרחק מיקוד אחת ממישור המוקד הראשוני וcollimates האור בזמן לא להסיט את נתיב הקרן (כלומר הוא מרוכז בדיוק במסלול הקרן). מניח את המסיכה במישור המוקד הראשון, שהותאם ללהגביל את מחצית שדה הראיה ולייצר דיירת חדה בתמונה. מקם את המראות ומסננים (D, E, G) כאלה שדרך הקרן נותרת מקבילה למשטח השולחן ורצה בשני נתיבים מקבילים Side-by-לוואי, כפי שמוצגת בתרשים 1B. מרכז עדשות 2 הממסר (F) במסלולי הקרנות שלהם ולהעביר אותם הלוך ושוב לאורך השבילים כדי להביא את התמונות להתמקדות בכרטיס אינדקס הציב היו חיישן CCD המצלמה יהיה. אם נעשה בצורה נכונה את שתי תמונות צריכות להיות parfocal עם oculars מיקרוסקופ ונמלים אחרים מצלמה. לבסוף למקם את המצלמה במיקום ולכוונן את היישור.
- יישור פיין כוונון אופטי: השתמש בתמונה הכפולה שנצפתה על ידי מצלמת CCD לכוונן יישור האופטי. השתמש בתמונת ניגודיות גבוהה ולהתחיל עם גדלה נמוכה יותר, מעבר להגדלה גבוהה ליישור סופי. מקם את התמונה המשודרת (ציאן ערוץ בתרשים 1B) לכיסוי מחצית מהשטח של המצלמה על ידי הזזת המצלמה בעמדה X וי 'הבבואה (ערוץ צהוב בתרשים 1B) כדי לכסות את החצי השני של התחום להציג באמצעות התאמת שתי המראות האחרונות (G) בדרך לאלומה. לייעל להתמקד על ידי הזזת עדשת הממסר השנייה לכל ערוץ הלוך ושוב לאורך דרך הקורה. אם שמאלללא שינוי ההתקנה האופטית צריכה להיות יציבה ורק דורשת הסתגלות לכוונן נדירה.
2. לדוגמא הכנה ואיסוף נתונים.
- רכישה מבטאות חי fluorophore רגיש הסידן בנוירון ריבית מCaenorhabditis גנטיקת המרכז (CGC) או מקורות אחרים. בעלי חיים מהונדסים לחלופין ניתן לבנות באמצעות התקן ג טכניקות elegans. ביטוי תא בודד לא הכרחי (ולעתים לא רצוי אם נוירונים מרובים הם להיחקר, ראה 12) עוד תמונות ומדידות ממספר תאים ניתן להפריד בקלות. אם transgene fluorophore אינו משתלב בגנום, שינוי משמעותי בביטוי יכול להתרחש מחיה לחיה. במקרה זה, preselecting חיות עם רמות ביטוי גבוהות יותר באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון מגדיל את יחס אות לרעש ומשפר את המדידות. רמות ביטוי fluorophore לביתד כדי להיות מספיק כדי להיות צלם בקלות עם המצלמה תחת הפרמטרים לרכישה נדרשים על ידי הניסוי.
- הפוך את רפידות agarose נדרשות לטכניקת הקיבוע הרצוי (ראה 2.3 להלן) על ידי לחיצה על טיפה קטנה של agarose המותך בין שתי שקופיות זכוכית במרווחים על ידי שתי חתיכות של קלטת מעבדה. במידת צורך, רפידות agarose ניתן להעביר תלוש כיסוי זכוכית לפני שעלה לבעלי החיים. ראה איור 2.
- לשתק ג elegans להדמיה באמצעות אחת מהשיטות הבאות:
- השבתה תרופתית: הוסף Levamisole 0.05% לרפידות agarose 2% (לערבב אותו לתוך agarose המותך לפני ביצוע הרפידות ב2.2). פיק חיות 5-10 על המשטח ולכסות עם פתק כיסוי. החל כמויות קטנות של תערובת שעווה חמה (50% שעוות פרפין ו50% וזלין) לפינות להחליק הכיסוי להחזיק אותו בתפקיד. אפשר דקות 5-10 לLevamisole ייכנס לתוקף והחיות לבecome לחלוטין עדיין.
- Immobilization הנוקשה agarose: ג elegans יכול להיות משותק פיזי באמצעות רפידות נוקשות 10% agarose ו0.05 חלקיקי פוליסטירן בקוטר מיקרומטר. הפוך 10% agarose רפידות (10% agarose בחיץ NGM לפי משקל) כמו ב2.2. הוסף ~ 3 μl של פתרון חרוז (1:10 הקלקר microspheres לNGM לפי נפח) לחלק העליון של הכרית. במהירות, לקחת 5-10 ג elegans לתוך הברכה של פתרון חרוז על המשטח ולכסות בעדינות עם פתק כיסוי. השתמש שעווה מותכת להחיל את הפינות של תלוש הכיסוי להחזיק אותו בעמדה. (לפרטים נוספים על טכניקה זו רואה 7 כמו גם מאמר קודם של יופיטר 8)
- הדבקה: ג elegans יכול להיות מודבק במקום שימוש בכמויות קטנות של דבק כיתת וטרינרית מוחל על צד אחד של בעלי החיים.
- התקני microfluidic: מכשירי microfluidic רבים תוכננו פיזי להחזיק ג elegans במקום להדמיה.
- הנח את השקף המוכן במיקרוסקופ ולהתמקד בנוירון הרצוי. זה בדרך כלל קל ביותר כדי למצוא את ג elegans באמצעות תאורת שדה בהירה והגדלה נמוכה. אז מעבר להגדלה גבוהה ודימות פלואורסצנטי למצוא ולהתמקד בנוירון הספציפי.
- גירוי: אם תגובה עצבית לגירוי מסוים היא רצויה (שדה אור, חשמלי, התעוררו אצל רמזים וחוש ריח, וכו 'טמפרטורה), מנגנון התמריצים חייב להיות מתוכנן להתקנת המיקרוסקופ, כך שזה יכול להינתן לבעלי החיים ב הכנת מדגם תוך הדמיה.
- לרכוש תמונות באמצעות מצלמת CCD מיקרוסקופ. זמני חשיפה ורמת אור עירור יהיו תלויים באות הבסיסית ורמת ביטוי של fluorophore, עם אותות חלשים הדורשים זמני חשיפה ארוכות יותר עם רזולוצית הזמן concordantly פחות. אנחנו בדרך כלל להשתמש ~ 300 פעמי חשיפת msec.
- לרכוש תמונות בנפרד או כtiלשגות סרט. בגלל ג הנוירונים elegans בדרך כלל להציג דינמיקת הפעלה איטית (כלומר הם חסרי פוטנציאל פעולה מבוסס נתרן), שיעורי מסגרת איטיים יחסית של ~ 1 שניות הם לעתים קרובות מספיק כדי למדוד את דינמיקת נוירון. שיעורי רכישה עד ~ 90 פריימים לשניים היו בשימוש אם כי אלה עשויים להיות מוגבלים על ידי זמן האינטגרציה ההכרחי לפלואורסצנטי החלש. סרטים בודדים של נוירון בודד יכולים בקלות להרחיב במשך כמה דקות (5-10 דקות ~) או יותר, אם הכנת הקיבוע יציבה וקצב הפריימים איטי יחסית.
3. ניתוח נתונים
- ישנן מספר החבילות שונות ניאון הדמית תוכנה זמינות עם יכולות ניתוח דינמיות וratiometric כוללים ImageJ ואלמנטי ש"ח. אנו משתמשים בתכנית מותאמת אישית MATLAB פשוטה המודדת את אות הניאון הממוצעת מעל אזור שנבחר מתוך אינטרס.
- לתמונות בודדות (או סרטי זמן לשגות שנותרומושלם עדיין) בחר אזור של עניין (ROI) בתוך נוירון ההדמיה ואזור סמוך נפרד למדידת הרקע. לתמונות ratiometric בחר ROI דומה ואזורי רקע לכל אחת מהתמונות הכפולות.
- תנועה קלה של נוירון ההדמיה בתוך סרט זמן לשגות דורשת ניתוח נוסף כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה בכל מסגרת, שניתן להשיג באמצעות תוכניות מעקב אובייקטים רבות באופן אוטומטי. התכנית שלנו מציגה תמונה דחוסה של כל התמונות בסרט שמן הגבול גס (הכולל את האובייקט של אינטרסים בכל המסגרות) נבחר באופן ידני ואזור רקע עצמאי נבחרו. למסגרת הראשונה, החזר על השקעה הוא נבחר באופן ידני מתוך אזור הגבול. עבור כל מסגרת שלאחר מכן, התכנית בוחרת את הפיקסלים הבהירים מתוך אזור הגבול כדי לייצר החזר על השקעה של הגודל הנכון (אותו מספר פיקסלים כמו ROI המסגרת הראשונה הידני כלומר). עבור תמונות שבי object של אינטרסים הוא מספיק בהיר אז הרקע מסביב באזור הגבול בפרוטוקול זה בוחר ROI סביר לכל מסגרת.
- אות הניאון, F, לכל מסגרת, מחושבת כממוצע עוצמת פיקסל בROI מינוס העצימות הממוצעות באזור הרקע. ערכי Ratiometric מחושבים כיחס בין שני האותות (רקע YFP-YFP) / (רקע CFP-CFP) -0.65. הגורם של 0.65 מפצה על לדמם דרכו של ערוץ CFP לתוך תעלת YFP, אשר תהיה תלוי בfluorophores כמו גם להגדיר מסנן מסוים בשימוש (ערך זה הוא בדרך כלל ~ 0.6 עבור setups Cameleon).
- רמת הסידן ביחס לכל מסגרת מחושבת כאחוז השינוי בעוצמת מנורמלת לערך בסיסי ראשוני נמדד מהפריים הראשון (או סדרה של מסגרות): ΔF / F = (F (t)-F o) / F o, כאשר F (t) הוא את הקרינה בזמן t ו F oהוא הערך הבסיסי ראשוני.
- ROI בחירת גוף התא מייצר את האותות החזקים ביותר החזקים ביותר, אבל אפשר גם לבחור ולמדוד אותות מהחזר השקעה לאורך התהליכים העצביים.
4. פתרון בעיות
- הלבנה: חשיפה לאור עירור יכול לגרום להלבנה של fluorophore ומתאפיין בירידה מתמדת באות שתלויה ברמות חשיפה. מדידות Ratiometric לעזור כדי לפצות על זה. עם זאת הלבנה סלקטיבית של אורך גל 1 עדיין יכול להתרחש (בדרך כלל bleaches CFP מהר אז YFP). אם הלבנה מתרחשת לצמצם את רמת חשיפה לאור על ידי צמצום זמני חשיפה ו / או עצימות עירור (עם מסנני צפיפות ניטראליים במסלול התאורה). אם יש צורך, אפשר לפצות על ידי הפעלת הלבנת משפטים מבוימים (עם אותה חשיפת העירור אבל שום גירוי עצבי) וכימות של קבוע הזמן של דעיכת אות.
- בחירת רקע: בחירה זהירה של אזור רקע הכרחית לניתוח תמונה מוצלחת. אזורי רקע צריכים להיות סביר ואחידים כהים אז הנוירון ההדמיה. את חייב להסיר מספיק כדי להימנע מאור מפוזר (ולכן טנדר אות) מתא עצב ההדמיה. אנחנו מוצאים את אזור אחיד 20-50 מיקרומטר מROI עובד היטב ברוב המקרים.
- אופטיקה Ratiometric: יישור נכון של אופטיקה ההדמיה הוא קריטי ליצירת תמונה כפולה ברורה. קבצים מצורפים מיקרוסקופ מסחריים להדמית ratiometric זמינים. טכניקת אלטרנטיבה היא להעסיק הדמיה רציפה מהירה באמצעות גלגל סינון מהיר במהירות כדי לעבור בין אורכי גל פליטה בעת הקלטת תמונות נפרדות עבור כל אחד.
- ניתוח Ratiometric: הניתוח שתואר כאן הוא טכניקה פשוטה יחסית שיוצרת אותות חזקים מכוח בממוצע על החזר על השקעה. זה דורש אובייקט מוכר כבהיר כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה. עוד הניתוח ratiometric מתוחכם ניתן על ידי יישור בדיוק ומיפוי תמונות כאלה שיחס הניאון יכול להיות מחושב על ידי פיקסל פיקסל הכפולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מציגים תוצאות משני ניסויים נפרדים. 1 מעסיק GCaMP למדוד את התגובה של תא עצב תחושתי ספציפי לגירוי חיצוני מוגדר, נותן דוגמה טובה כיצד ניתן להשתמש בו לכתבי סיד ניאון אופטי כדי לעקוב אחר פעילות עצבית בג השלם elegans. 2 מעסיקים Cameleon למדוד סיד החולף התאי מופעל בתוך תא עצב בתגובה לניזק ליזר מסוים, ובכך ממחיש כיצד פיזיולוגית סידן ניתן למדוד בתוך תא בודד בגוף חי. כדי להתמקד בהיבטים הטכניים של כל מדידת תוצאות ניסוי בודדות שהוצגו ונדונו בהרחבה. לעתים קרובות התגובה הממוצעת לאורך זמן (כפי שחושב תגובה הממוצעת בכל נקודת זמן ביחס לגירוי) או מדד ספציפי (כגון המשרעת הממוצעת של התגובה) מחושבת על פני ניסויים רבים. בדרך כלל 10-20 ניסויים נחוצים כדי לייצר מדידה ממוצעת מקובלת אבל לאהמספר שלו יהיה תלוי בשוני הפנימי של התגובה. ניתוח נתונים כגון לניסויים דנו כאן ניתן למצוא 12 ו 13.
מדידת GCaMP תגובה חושית: כאשר נתון לשדה חזק חיצוני חשמלי (≥ 3 V / סנטימטר), ק elegans פעיל זוחל לכיוון הקוטב השלילי של השדה עם תנועה בבימוי מדויקת. אנחנו הראינו בעבר כי התנהגות electrotactic זה מתווכת בעיקר על ידי תאי העצב ימניים והשמאליים ASJ, הנוירונים חושיים amphid ממוקמים בראשו של בעל חי 12. כדי להמחיש את התגובה הזאת השתמשנו זן מהונדס להביע GCaMP3 במיוחד בנוירונים ASJ שמאל וימין תחת-9-GPA האמרגן. אנחנו משותקים חיות להדמיה באמצעות רפידות agarose המכילות Levamisole 0.05% דחוק בין שני תלושי כיסוי (כמתואר בהליכים). הגירוי החשמלי היה מנוהל באמצעות תא מותאם אישית נבנה הדמיה שמתאים עלבמה של מיקרוסקופ ההפוך ניקון טי (ראה 12). בקיצור, הכנת תלוש הכיסוי מושמת (עם צד התולעת למטה) מעל חור בתא פלסטיק קטן המאפשר גישה ליעדים מלמטה וסטנדרטי הדמיה באמצעות תלוש הכיסוי. החדר היה מלא ב0.25 המ"מ NaCl וחיץ 50 mM גליצרול וגירוי השדה החשמלי מיושמים באמצעות שתי אלקטרודות פלטינה המצפות את הקצוות של קאמרי. כפי שתואר לעיל, אחת ASJ נוירון להביע CGaMP היה צלם באמצעות אובייקטיבי x100 1.4 NA שמן טבילה ולהגדיר מסנן GFP סטנדרטי. סרט זמן לשגות נרכש עבור 80 שניות (1 מסגרת / שניות, זמן 300 msec חשיפה), ואילו הכפפת בעלי החיים לשדה חיצוני 3 V / סנטימטר חשמלי במשך שלושה משפטים נפרדים כל אחד נמשך 10 שניות (איור 3). אנחנו מדדנו את עוצמת קרינה בגוף התא באמצעות ניתוח התמונה שתואר לעיל. הווידאו מציג פגמים קלים של שניהם תנועה וסחיפת מוקד במהלך הניסוי. רחrength של אות GCaMP נותר חזק אך מראה גדולה ~ 250% עלייה בקרינה בתגובה לשניהם 1 ו 3 גירויי Rd. התוצאה מהגירויים 2 מצטמצמת באופן משמעותי הוכחת השתנות בתגובה העצבית. ההלבנה היא מינימאלית כמו מאליו על ידי חזרה לרמת בסיס עקבית.
Cameleon מדידה של פיזיולוגית הסידן תאית: פגיעה טראומטית סלולרית מפעילה סיד חולף בתוך תא עצב שממלא תפקיד חיוני בגורל הפיזיולוגי התגובה מכתיבות סלולרי (מוות לעומת ייזום של תהליכי תיקון תא כלומר) גדול. אנו יכולים למדוד את התגובה הזאת ניזק מושרה in vivo באמצעות ליזר femtosecond לנתק ג פרט elegans נוירונים 14 תוך מדידת אותות סיד סלולריים באמצעות Cameleon YC3.60 13, 15. בעלי חיים המבטאים Cameleon YC3.60 בששת נוירונים mechanosensory (תחתMEC-4 אמרגן), היינו משותק באמצעות 10% agarose וקלקר חלקיקים כמתוארים בהליכים. אנחנו עובדים אופטיקה הדמיה הכפולה להקליט אותות משני ערוצי YFP קרינת CFP וכמתואר בהליכים. אנחנו צלמנו ALM נוירון בודד וליזר ממוקד האקסון ~ 20 מיקרומטר מגוף התא (איור 4 א). האקסון נותק על ידי חשיפה קצרה (<1 שניות) להדליק מfemtosecond פעם ליזר אינפרא אדום הממוקד בנקודת היעד לאורך האקסון ידי אובייקטיבי הדמיה (ראה 13 לפרטים על ניתוח ליזר). תמונות זמן לשגות במסגרת כל 3 שניות, עם 400 זמני חשיפת msec נרשמו ל320 שניות בעת ביצוע ניתוח ליזר ורמות הסידן מחושבות באמצעות ניתוח ratiometric.
אותות נמדדו באופן עצמאי בגוף התא (איור 4 ב), ובמקטע אקסון בתוך 5 מיקרומטר של נקודת החתך (האיור 4C). הנתונים מראים גם Cעוצמות FP וYFP כמו גם יחס המתקבל סריג. המדידה בגוף התא התנהג היטב עם CFP יורד במהירות וYFP הגובר בתגובה לניזק ליזר בזמן t = 0 שניות (חץ אדום). התוצאה הוא ~ 200% גידול מיידי באות ratiometric (ΔF / F) אשר נגרמה ל~ 90 שניות לפני שנפל חזרה לרמות בסיס קרובות. ההלבנה היא מינימאלית כפי שעולה מהבסיס העקבי.
במגזר האקסון הקרוב לנקודת חתך, הכמות המקומית של fluorophore משתנית במהלך הניסוי, שמסבכת את האות. ניתוח הליזר מנתקת את האקסון ובקצרה ruptures הקרום, המאפשר fluorophore לברוח ואופן זמני הפחתת ריכוז cytoplasmic המקומי שלה. הדבר ניכר מירידה ראשונית בשמץ YFP ב4C האיור והשוואה של מגזר האקסון ליד נקודת ניזק בתמונות YFP בזמנים t = 0 שניות וt = 6 שניות, האיור 4A. בlaנקודתי זמן ter, בסוף ניתק מתנפחות כחלק מהמשך ההתאוששות שלה, וכתוצאה מfluorophore המקומיים יותר ועלייה בעוצמתם. זה בא לידי ביטוי ברוב עקבות CFP הגדלה לאט ב4C דמות והשוואה של מגזר האקסון בתמונות CFP בזמני t = 0 שניות וt = 270 שניות, האיור 4A. עם זאת וריאציות אלה ישפיעו על שני הערוצים באופן שווה ויחס סריג יעיל מפצה על כך. מדידת התוצאה מראה תגובה דומה לגוף התא עם ~ 150% גידול מיידי באות (ΔF / F), התאוששות דרמטית לבסיס הקרוב ב ~ 90 שניות ולאחר מכן תגובה שניונית קטנה נוספת ב~ 150 שניות. ניתוח ratiometric הוא קריטי למדידה זה כמו שזה יהיה מאוד קשה להפריד את אות הסידן מההשפעות האחרות, אשר יכול להשתנות במידה רבה מתא העצב לתא עצב וניתוח לניתוח. אות האקסון יש יותר רעש בהשוואה לאותות גוף התא בעיקר בשל דימר פלואורסצנטי וההחזר על ההשקעה הקטן יותר באקסון הצר יותר.
איור 1. הגדרה בסיסית ואופטיקה ratiometric. א) בתצלום נראה ההתקנה הניסיונית בהיקף של מיקרוסקופ מתחם ההפוך ואופטיקה ההדמיה ratiometric. B) תרשים סכמטי הממחיש את האופטיקה ההדמיה הדרושה למדידות ratiometric סריג המבוסס. התמונה מחולקת לשני אורכי הגל או הערוצים, המוקרנים Side-by-צד על CCD מערך.
איור 2. לדוגמא הכנה. ג elegans הם רכובים על רפידות agarose דקות להדמיה. א) רפידות agarose מבוצעות על ידי רבדת טיפה קטנה שלagarose המותך בין שתי שקופיות מיקרוסקופ מרווחים על ידי שתי חתיכות של קלטת מעבדה. ב ') בעלי חיים המועברים על גבי כרית agarose ומכוסים בcoverslip, נערך במקום על ידי כמות קטנה של שעווה בכל אחת מארבע הפינות.
איור 3. נתוני דוגמה GCaMP. אות GCaMP, ΔF / F, נרשם בvivo מגוף התא של נוירון ASJ להגיב לסירוגין / כיבוי שדה חשמלי (ירוקות עקבות). קווים אפורים עבים מצביעים על תקופות שבן השדה החשמלי החיצוני (3 V / סנטימטר) היה מוחל על בעלי החיים. סרגל קנה מידה מייצג עלייה של 100% בעוצמת קרינה.
איור 4. נתוני דוגמא Cameleon. ) שלוש מסגרות נפרדות המציגות את התמונה הכפולהלהציג של ALM נוירון לפני ואחרי ניתוח ליזר של 20 מיקרומטר האקסון מגוף התא. החץ האדום בלוח המרכזי מציין את נקודת החיתוך. הפנל התחתון מראה גוף התא והאקסון מגזר ייצור האותות בB ו-C. B) YC3.60 אות Cameleon נמדד בגוף התא של נוירון ALM לפני ואחרי ניתוח ליזר (אדום חץ). C) Cameleon YC3 .60 אות נמדדה במגזר האקסון בתוך 5 מיקרומטר של נקודת החתך לפני ואחרי ניתוח ליזר. עקבות צהובות מצביעות אותות YFP, עקבות כחולות מצביעות אותות CFP ועקבות כתומות הן כתוצאה מסריג יחס. כל הזמנים ביחס למועד ניתוח ליזר. ברי קנה מידה מייצגים עלייה של 100% בעוצמת קרינה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אינדיקטורים סיד מקודד גנטי כבר נוצלו באופן נרחב בג elegans נוירוביולוגיה. קבוצות רבות שהעסיקו הטכניקות הללו כדי ללמוד תגובה של תאי עצב התחושתי העיקרי לגירויים חיצוניים כפי שמודגם כאן בתגובת ASJ לשדה חשמלי. דוגמאות בולטות כוללות תחושת המגע מכאני, כימיקלים מסוימים, טמפרטורה ושדה חשמלי 12, 16-19. פעילות של interneuron ותאי שריר יש גם פיקוח גם בתגובה לגירויים ושולטים בהתנהגות של בעלי חיים. רבים ממחקרים אלה דחפו את הטכניקות הללו צעד אחד קדימה באמצעות זיהוי תמונה וטכניקות מעקב כדי לאפשר הקלטה מתא העצב בבעלי חיים באופן חלקי או אפילו מאופקים שנעו בחופשיות, כמו גם הקלטה מתא העצב מרובה בו זמנית. מחקרים נוספים בחנו היבטים אחרים של פיזיולוגית סיד כגון תגובה לניזק עצבי 13, 20, כפי שהוצג כאן, כמו גםניוון עצבי על סולמות זמן ארוכים יותר 21.
בעיצוב ניסוי מסוים, כל אחת מהטכניקות החלופיות ביחס לכתבי סיד נפוצים וקיבוע חיה יש לשקול בזהירות. טכניקות קיבוע תהיינה מוכתבות על ידי היבטים טכניים, כגון צורך בגישה פיזית לבעלי החיים, היכולת לשחזר חיות בעקבות הדמיה או הצורך בקצב העברת נתונים גבוה. כתבי סיד ניאון שונים יש יתרונות וחסרונות מסוימים גם כן. GCaMP מעסיק ניתוח תמונה ישיר ערוץ יחיד והגדול ביחס אות לרעש עושה את זה ישים למצבים רבים. Cameleon מצד השני דורש הדמיה וניתוח מורכב יותר, אך מדידת ratiometric כתוצאה מכך יכולה להיות קריטית במצבים עם חפצים שעלולים להיות גדולים. לדוגמה, שינויים בכמות fluorophore (כמו בדוגמא ניזק הליזר) יכולים להתרחש גם על פני תקופות זמן ארוכות(שעות) עקב שינויים ברמות ביטוי. אסטרטגיות הדמיה כפולות נוספות גם אפשריות כגון GCaMP שיתוף הביע-עם (או צמוד פיזי) fluorophore RFP. אמנם לא להתרגז על בסיס זה, הייתי לנצל את הטווח הדינמי הגדול של גרסות GCaMP המודרניות תוך שימוש במסלול האדום כבסיס מדידה בזמן אמת.
חשוב לציין כי מספר רב של שני ערוצים מיקרוסקופ מערכות הדמיה ותוכנות ניתוח זמינים מסחרי שאמנם לעתים קרובות יקר יותר, עשוי להיות אטרקטיבי לחוקרים סרבנים לבנות המערכת בנתה את הבית שתוארה כאן. מערכות הדמיה דו מסחריות (DualView2-dv2, Photometrics) בדרך כלל משתמשות באופטיקה דומה למערכת בנתה את הבית שלנו, אבל נמצאות בתוך קובץ מצורף מיקרוסקופ יחיד עם נהלי יישור סטנדרטיים. לחלופין, מסנן מערכות חילופים מהירות (למבדה DG-4/DG-5 פלוס, סאטר מכשירים) מאפשרות הדמיה מהירה בזמן אמת רציפה של שני ערוצי צבע wiגם בלי אופטיקה הדמיה נוספת, אבל הם גם יקרים ודורשים סינכרון מדויק בין חילופי המסנן ורכישת מצלמה.
לסיכום, ג elegans מציג מספר היתרונות כמו במערכת הדמית vivo. את fluorophores המקודד גנטי הוא לעתים קרובות תא ספציפי ויכול לבטל את הצורך בהזרקה או במנהל מfluorophores אקסוגניים. ג נגישות אופטית elegans מאפשרת הדמיה תוך חיות שלמות, כי הם קלים וחסכוניים לתחזוקה, אינה דורשת נתיחה מסובכת או culturing העצבי ולשמר פיזיולוגיה של תא. בנוסף, ג elegans יש לו יכולות נהדרות לניתוח גנטי במספר גדול של חומרים כימיים גנטיים זמינים וטכניקות מבוססות היטב. יש חסרונות כמובן למערכת, הדאגה העיקרית שאולי שזה חסר חוליות. בנוסף, fluorophores לדווח על שינויים יחסיים בrathe ריכוז הסידןr מערך מוחלט והרזולוציה בזמן של מדידות יכול להיות מוגבל על ידי שני את הדינמיקה של fluorophore אלא גם את פעמי האינטגרציה הדרושות של אותות קרינה חלשים. לבסוף, בעוד סיד הוא חלק בלתי נפרד מפעילות עצבית ומאותת על fluorophores לא ניתן לדווח באופן ישיר את פוטנציאל מתח הקרום כפי שנמדד עם טכניקות אלקטרו. עם זאת מאויר על ידי הנהלים שהוצגו כאן, ג elegans הוא מערכת אטרקטיבית, יחסית פשוטה, יעילה וחסכונית עבור מגוון רחב של מחקרי הדמיה עצביות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
כמה אנשים תרמו לעבודה מתוארת במאמר זה. CVG נבנה מערך הניסוי, וLS, הא"ס, וCVG בצעו את הניסויים. CVG והא"ס כתבו את כתב היד. כל המחברים לאחר מכן לקחו חלק בתהליך השינוי ואשרו את העותק הסופי של כתב היד. אנו מודים לפול סטרנברג למתח GCaMP. כמה זנים נמטודות משמשים בעבודה זו נמסרו על ידי גנטיקת Caenorhabditis המרכז (CGC), אשר ממומן על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). תכנית ניתוח תמונת MATLAB עובדת מזה המשמש בגיל 18. המחברים נתמכו על ידי אוניברסיטת בוסטון ומסצ'וסטס חי מרכז המדעים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3'X3' optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , The C. elegans Reseach Community. (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , The C. elegans Reseach Community. (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
