Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Summary

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y reactivos,

Abstract

El gusano nematodo C. elegans es un organismo modelo ideal para relativamente simple, formación de imágenes de bajo coste neuronal in vivo. Su pequeño cuerpo transparente y simple, bien caracterizado sistema nervioso permite la identificación y obtención de imágenes de fluorescencia de cualquier neurona en el animal intacto. Técnicas sencillas de inmovilización con un impacto mínimo sobre la fisiología del animal permitir extendido time-lapse de imágenes. El desarrollo de los fluoróforos de calcio genéticamente codificados sensibles como cameleon ¹ y ² GCaMP permitir la formación de imágenes in vivo de calcio neuronal relacionada tanto fisiología celular y la actividad neuronal. Numerosas cepas transgénicas que expresan estos fluoróforos en neuronas específicas están fácilmente disponibles o se pueden construir utilizando técnicas bien establecidas. A continuación, se describen los procedimientos detallados para medir la dinámica del calcio dentro de una sola neurona in vivo utilizando tanto GCaMP y cameleon. Se discuten las ventajas y disadvantedades de ambos, así como varios métodos de preparación de la muestra (inmovilización animal) y análisis de imagen. Finalmente, se presentan los resultados de dos experimentos: 1) Usando GCaMP para medir la respuesta sensorial de una neurona específica a un campo eléctrico externo y 2) Utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológico de una neurona a daño traumático láser. Técnicas de formación de imágenes de calcio tales como éstos se utilizan ampliamente en C. elegans y se han extendido a las mediciones en los animales que se desplazan libremente, neuronas de forma simultánea y la comparación entre fondos genéticos. C. elegans presenta un sistema robusto y flexible para imágenes in vivo neuronal con ventajas sobre otros sistemas modelo de sencillez técnica y coste.

Introduction

Aquí presentamos métodos prácticos para la formación de imágenes in vivo del calcio en C. Elegans neuronas. El desarrollo de las codificadas genéticamente sensibles calcio-fluoróforos con alta relación de señal a ruido hace C. elegans un sistema efectivo comparativamente sencillo y rentable para la medición de la neurofisiología y la actividad. Nuestra formación de imágenes se realiza con un microscopio compuesto estándar utilizando amplio campo de imágenes de fluorescencia de los fluoróforos disponibles comúnmente. Se presentan varias técnicas que emplean diferentes fluoróforos y preparaciones diferentes de la muestra, discutir las fortalezas y debilidades de cada uno. Los datos se presentan a continuación, a partir de dos experimentos de ejemplo. Un excelente recurso adicional sobre las técnicas descritas aquí se pueden encontrar en WormBook, "Imagen de la actividad de las neuronas y los músculos" por R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Dos clases principales de genéticamentecamente codificados reporteros fluorescentes de calcio se utilizan comúnmente en C. elegans: GCaMP solo canal y cameleon FRET basada. Vamos a describir los métodos y ejemplos para mostrar los datos generados por cada uno.

GCaMP se basa en una modificación de la proteína verde fluorescente (GFP) que es sensible a la concentración de calcio circundante. Esto se logra mediante la fusión de GFP y la calmodulina calcio de alta afinidad de proteína, de tal manera que la unión del calcio por la calmodulina lleva la molécula de GFP en una confirmación eficiente fluorescente ^2. Los recientes avances en estos fluoróforos generar tamaño de la señal excepcional con hasta 500% de aumento en la intensidad de fluorescencia en un rango fisiológico de los niveles de calcio y la cinética razonablemente rápidos de ~ 95 ms tiempo de subida y el tiempo de decaimiento ~ 650 mseg ^4. Durante períodos de tiempo relativamente cortos (minutos), estas señales pueden permitir grandes para obtener imágenes de resolución más baja (menor magnificación) y, dado un buen comportamiento initmedida de referencia ial, niega la necesidad de línea de base continua o mediciones comparativas.

Cameleon tiene la ventaja de ser un fluoróforo FRET basada en el que genera una medición radiométrica comparando dos canales independientes o longitudes de onda ^1. Se compone de dos fluoróforos diferentes (proteínas fluorescentes cian y amarillo, emisores de PPC y YFP) unidos por una proteína calmodulina. El complejo está iluminado con luz azul (440 nm) que excita la PPC. La unión de calcio trae los fluoróforos más juntos, aumentando la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) de la PPC (donante) a la YFP (aceptor) y provocando la emisión PPC (480 nm) para disminuir la emisión y YFP (535 nm) para aumentar . Los niveles relativos de calcio se mide como la relación de la intensidad YFP / CFP. Cinética Cameleon son más lentas que la de GCaMP, medido in vivo para tener un tiempo de subida de ~ 1 sec y un tiempo de desintegración de 3 ~ ⁵ seg. Sin embargo,la relación de las señales que se mueven opuestamente aumenta el tamaño de la señal y compensa un número de posibles artefactos debido a los cambios en la concentración de fluoróforo, el movimiento o la deriva enfoque y blanqueo.

Codificados genéticamente reporteros fluorescentes negar gran parte de la preparación de la muestra requiere exógenamente con sondas administrados y C. elegans pequeño cuerpo transparente permite visualizar imágenes en el animal intacto utilizando fluorescencia sencilla de campo amplio. El principal reto técnico en preparación de la muestra es por lo tanto, para inmovilizar de forma segura a los animales. Hay un número de diferentes técnicas comúnmente utilizadas cada uno con ventajas y desventajas. El uso de un agente farmacológico para paralizar a los animales es fácil de implementar y permite el montaje de múltiples animales en una preparación (Levamisol, un agonista colinérgico que hace que el tejido muscular para aprovechar se utiliza típicamente ^6). C. elegans también puede ser físicamente inmovilizada mediante el montaje de losen 10% de agarosa rígido ^{7, 8.} Esto minimiza el impacto en la fisiología del animal, permite a largo plazo de imágenes (horas) y la recuperación de varios animales, pero es más difícil técnicamente. Ambas técnicas restringir el acceso físico a los animales (que están bajo un cubreobjetos) y, por tanto, sólo pueden utilizarse con ciertos estímulos experimentales (tal como luz, temperatura, campo eléctrico o daño láser). Para los estímulos que se requiere acceso físico, como el tacto o la administración de los productos químicos, muchos estudios han pegado con éxito C. elegans en su lugar (el uso de pegamento de grado veterinario) ^9. Esto es técnicamente más difícil, es una preparación solo animal y no permite la recuperación de los animales. Por último, numerosos dispositivos de microfluidos han sido empleados que físicamente restringir C. elegans, preservando la fisiología animal, permitiendo la exposición a la mayoría de los tipos de estímulos (dependiendo del diseño del dispositivo) y puede permitir el intercambio rápido y la recuperación de los animales

Los métodos presentados aquí pueden ser utilizados para medir la actividad neuronal y la fisiología celular en C. elegans. Damos un ejemplo de cada uno de: el uso de GCaMP para medir la respuesta de la neurona sensorial ASJ a un campo eléctrico externo, y utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológica a la lesión con láser de una neurona. Estos ejemplos muestran las ventajas y los inconvenientes de los dos tipos de fluoróforos e ilustran lo que es posible con el sistema.

Protocol

1. Configuración óptica

1. El uso de un microscopio compuesto estándar con capacidades de imagen de epifluorescencia. Utilizamos una Nikon Eclipse Ti-U microscopio invertido con un iluminador Intensilight HG.
2. Para una mejor imagen y calidad de la señal utiliza un gran aumento, objetivo gran apertura numérica. Nos suelen utilizar una Nikon X60 1,4 NA objetivo de inmersión en aceite. En algunos casos es posible usar menor aumento (X40, X20) dependiendo del nivel de expresión del fluoróforo y fuerza de la señal.
3. Utilice una alta sensibilidad enfriado cámara CCD, tal como una cámara de Andor Clara para maximizar la sensibilidad de la imagen y minimizar el ruido de fondo.
4. Para fluoróforos individuales de color utilizan el filtro microscopio de fluorescencia estándar diseñado para establecer la longitud de onda particular del fluoróforo. Para GCaMP utilizar un filtro estándar de GFP conjunto optimizado para la excitación a 488 nm y emisión a 525 nm. No hay modificaciones ópticas se necesitan más.
figura 1. Se compone de:
1. Un filtro microscopio ajustado con 440 ± 20 nm de excitación y filtro de 455 nm de paso largo espejo dicroico.
2. Una máscara de imagen colocada en el plano de la imagen inicial inmediatamente fuera de la imagen de microscopio puerto (donde el sensor de la cámara CCD generalmente se sentaban). Esto limita el campo de visión de tal manera que se llene sólo un medio de sensor de la cámara. La colocación de esta máscara a los resultados de primer plano de la imagen en las fronteras y la superposición de imágenes nítidas sin que las dos imágenes se proyectan de lado a lado.
3. La lente de primer relé establecer una longitud focal lejos de tél plano de la imagen inicial tal que colima la luz.
4. Un espejo dicroico que divide la luz en las dos longitudes de onda de formación de imágenes separadas o canales que reflejan un color (> 515 nm, amarillo), mientras que la transmisión de la otra (<515 nm, cyan).
5. Filtros de emisiones (filtros de paso de banda) que restringen aún más la luz transmitida a las longitudes de onda específicas de imagen (cian a 485 ± 40 nm y amarillo a 535 ± 30 nm),
6. Las lentes de relé segundos (uno para cada canal) colocados en las trayectorias de rayos de tal manera que se vuelve a enfocar la luz a un segundo plano de imagen en la cámara CCD.
7. Un par de espejos y un segundo espejo dicroico dirige las trayectorias de rayos de tal manera que las dos imágenes recombinan y se proyectan de lado a lado en el sensor de la cámara CCD. Figura 4A muestra un ejemplo de la imagen resultante.
5. La alineación óptica inicial: Iniciar la configuración y alineación de la óptica con un alto contraste image utiliza un objetivo de bajo aumento y se transmite de amplio campo de iluminación de luz (un rotulador negro dibujado en un portaobjetos de microscopio funciona bien). Llevar la imagen para enfocar a través de los oculares del microscopio y después se cambiaron al puerto microscopio para ser utilizado. Con la iluminación de luz de alta visualizar la imagen en una tarjeta en el plano focal inicial (unos pocos centímetros fuera del puerto microscopio). Coloque la primera lente de retransmisión (C) en la trayectoria del haz de tal manera que es una distancia focal desde el plano focal inicial y colima la luz mientras no desviar la trayectoria del haz (es decir, se centra directamente en la trayectoria del haz). Coloque la máscara en el primer plano focal, ajustado para restringir medio del campo de visión y producir una frontera nítida en la imagen. Coloque los espejos y filtros (D, E, G) de manera que la trayectoria del rayo se mantiene paralelo a la superficie de la mesa y se ejecuta en dos trayectorias paralelas de lado a lado, como se muestra en la Figura 1B. Centro de las lentes de relé segunda (F) en sus respectivas trayectorias de rayos ymoverlos hacia atrás y adelante a lo largo de los caminos para llevar las imágenes a un foco en una ficha colocada fuera el sensor de la cámara CCD será. Si se hace correctamente las dos imágenes deben ser parfocal con los oculares del microscopio y otros puertos de cámara. Por último colocar la cámara en posición y ajustar la alineación.
6. Alineación Fine Tuning óptico: Utiliza la imagen dual visto por la cámara CCD para afinar la alineación óptica. Utilizar una imagen de alto contraste y comenzar con un menor aumento, el cambio a un aumento mayor para la alineación final. Coloque la imagen transmitida (cian canal en la Figura 1B) para cubrir una media de campo de la cámara de vista moviendo la cámara en la posición X e Y. la imagen reflejada (canal amarillo en la Figura 1B) para cubrir la otra mitad del campo de ver mediante el ajuste de las últimas dos espejos (G) en su trayectoria del haz. Optimizar el enfoque moviendo la lente segundo relé para cada canal de un lado a otro a lo largo de la trayectoria del haz. Si se dejainalterada la configuración óptica debe ser estable y sólo requieren un ajuste excepcional sintonía fina.

2. Preparación de la muestra y la adquisición de datos.

1. Adquirir animales que expresan un fluoróforo sensible al calcio en la neurona de interés desde el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) o de otras fuentes. Alternativamente animales transgénicos se pueden construir utilizando estándar de C. elegans técnicas. Expresión de células individuales no es necesario (y, a veces no es deseable si múltiples neuronas han de ser investigados, véase ^12), siempre y cuando las imágenes y las mediciones de células múltiples se pueden separar fácilmente. Si el transgén fluoróforo no se integra en el genoma, la variación significativa en la expresión puede ocurrir de animal a animal. En este caso, la preselección de los animales con los niveles de expresión más altos, utilizando un microscopio de disección fluorescente aumenta la relación señal a ruido y mejora las mediciones. Los niveles de expresión fluoróforo need que es suficiente para ser fácilmente imágenes con la cámara bajo los parámetros de adquisición requeridas por el experimento.
2. Hacer las almohadillas de agarosa requeridos para la técnica de inmovilización deseado (ver más abajo 2,3) pulsando una pequeña gota de agarosa fundida entre dos placas de vidrio separadas por dos piezas de cinta de laboratorio. Si es necesario, almohadillas de agarosa puede ser transferida a una hoja de cubierta de vidrio antes de montar los animales. Véase la Figura 2.
3. Inmovilizar C. elegans para formación de imágenes utilizando una de las técnicas siguientes:
   1. Paralización Farmacológica: Agregar un 0,05% a 2% Levamisol pastillas de agarosa (mezclándolo con la agarosa fundida antes de tomar las pastillas en 2,2). Elige animales 5-10 en la almohadilla y se cubre con un cubreobjetos. Aplique pequeñas cantidades de mezcla de cera caliente (50% de cera de parafina y 50% de vaselina) a las esquinas de la hoja de la cubierta para mantenerla en su posición. Permitir 5-10 minutos para el levamisol a surtir efecto y los animales a become completamente inmóvil.
   2. Stiff Inmovilización Agarosa: C. elegans puede ser físicamente inmovilizada usando rígidos 10% almohadillas de agarosa y 0,05 m de diámetro nanopartículas de poliestireno. Hacer 10% de agarosa almohadillas (10% de agarosa en tampón de NGM en peso) como en 2,2. Añadir ~ 3 l de solución de bolas (1:10 microesferas de poliestireno en NGM en volumen) a la parte superior de la almohadilla. Rápidamente, recoger 5-10 C. elegans en la piscina de solución de bolas en el teclado y suavemente cubrir con un cubreobjetos. Use cera fundida se aplica a las esquinas de la hoja de la cubierta para mantenerla en su posición. (Para más detalles sobre esta técnica véase ^7, así como un artículo anterior JoVE ⁸⁾
   3. Encolado: C. elegans puede ser pegado en su lugar usando pequeñas cantidades de adhesivo de grado veterinaria aplicada a un lado del animal.
   4. Los dispositivos microfluídicos: Numerosos dispositivos microfluídicos se han diseñado para sostener físicamente C. elegans en lugar de imágenes.
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4. Colocar el portaobjetos preparado en el microscopio y se centran en la neurona deseado. Es a menudo más fácil para encontrar el C. elegans utilizando iluminación de campo claro con pocos aumentos. Luego de cambiar a gran aumento y de imágenes de fluorescencia para encontrar y centrarse en la neurona específica.
5. Estímulo: Si una respuesta neuronal a un estímulo específico que se desee (campo de luz, eléctrica, señales gustativas y olfativas, temperatura, etc), el aparato de estímulo debe ser diseñada en la configuración de microscopio, de tal manera que se puede administrar a los animales en la preparación de la muestra mientras que las imágenes.
6. Adquirir imágenes con la cámara CCD microscopio. Los tiempos de exposición y el nivel de luz de excitación depende de la señal de línea de base y nivel de expresión del fluoróforo, con las señales más débiles que requieren largos tiempos de exposición con resolución de tiempo concordantemente menos. Nos suelen utilizar tiempos de exposición ~ 300 ms.
7. Adquisición de imágenes de forma individual o como una TIme de intervalo. Debido a que C. elegans neuronas muestran generalmente lenta dinámica de activación (es decir, que carecen de los potenciales de acción basados ​​en sodio), velocidades de cuadro relativamente lentas de ~ 1 seg suelen ser suficientes para medir la dinámica de las neuronas. Velocidades de adquisición de hasta ~ 90 cuadros por segundo se han utilizado aunque éstos pueden estar limitados por el tiempo de integración necesaria para la fluorescencia débil. Los vídeos individuales de una sola neurona puede extender durante varios minutos (min ~ 5-10) o más si la inmovilización preparación es estable y la velocidad de cuadros relativamente lento.

3. Análisis de Datos

1. Hay un número de diferentes paquetes de software de imágenes fluorescentes disponibles con capacidades de análisis dinámicos y radiométrica incluyendo ImageJ y NIS-elementos. Usamos un programa MATLAB personalizado simple que mide la media de la señal fluorescente sobre una región seleccionada de interés.
2. Para las imágenes individuales (o time-lapse películas que permanecenperfectamente inmóvil) seleccionar una región de interés (ROI) dentro de la neurona formado la imagen y una región separada cercano para la medición del fondo. Para imágenes ratiometric seleccionar ROI similar y las regiones de fondo para cada una de las dobles imágenes.
3. Un ligero movimiento de la neurona imagen formada dentro de una película de lapso de tiempo requiere un análisis adicional para seleccionar automáticamente la ROI en cada trama, lo que se puede lograr utilizando numerosos sistemas de seguimiento de objetos. Nuestro programa muestra una imagen comprimida de todas las imágenes de la película de la que está manualmente un límite aproximado (que abarca el objeto de los intereses de todos los marcos) seleccionado y selecciona una región de fondo independiente. Para la primera trama, una ROI se selecciona manualmente desde dentro de la región límite. Para cada trama posterior, el programa selecciona los píxeles más brillantes dentro de la región límite de generar un retorno de la inversión del tamaño correcto (es decir, el mismo número de píxeles como la ROI primer fotograma manual). Para las imágenes donde el objetivot de intereses es suficientemente brillante que el fondo circundante dentro de la región límite de este protocolo selecciona una ROI razonable para cada trama.
4. La señal fluorescente, F, para cada trama se calcula como la media de intensidad de los píxeles en la ROI menos la intensidad media en la región del fondo. Valores ratiométrica se calcula como la relación de las dos señales (YFP-YFP _fondo) / (CFP-PPC _fondo) -0,65. El factor de 0,65 compensa sangrado a través del canal de PPC en el canal de YFP, que será dependiente de los fluoróforos, así como el conjunto de filtro particular utilizado (este valor es normalmente ~ 0,6 para las configuraciones de cameleon).
5. El nivel de calcio relativa para cada trama se calcula como el porcentaje de cambio en intensidad normalizada a un valor de referencia inicial medido desde el primer fotograma (o una serie de fotogramas): Df / F = (F (t)-F _o) / F _o, donde F (t) es la fluorescencia en el tiempo t y _o Fes el valor de referencia inicial.
6. Un ROI seleccionar el cuerpo de la célula genera las señales más fuertes más robustos, pero también es posible seleccionar y medir las señales de un retorno de la inversión a lo largo de los procesos nerviosos.

4. Resolución de Problemas

1. Blanqueo: La exposición a la luz de excitación puede causar la decoloración del fluoróforo y se caracteriza por una disminución constante de la señal que es dependiente de los niveles de exposición. Mediciones ratiométrica ayudar a compensar esto. Sin embargo blanqueo selectivo de una longitud de onda pueden ocurrir (por lo general más rápido blanqueadores PPC YFP entonces). Si se produce decoloración reducir el nivel de exposición a la luz mediante la reducción de los tiempos de exposición y / o la intensidad de excitación (con filtros de densidad neutra en la vía de iluminación). Si es necesario, se puede compensar para el blanqueo mediante la ejecución de ensayos simulados (con la exposición de excitación mismo pero sin estímulo neuronal) y la cuantificación de la constante de tiempo de caída de la señal.
2. C.. elegans responder a la exposición a la luz y estímulos experimentales, haciéndolos más probable que se mueva en el momento de la grabación. Un ligero movimiento puede introducir ruido significativo en la medición, especialmente cuando se mide a partir de los procesos axonales. Análisis radiométrico ayuda a mitigar estos efectos hasta cierto punto y las mediciones desde el cuerpo celular son más robustos. Ejecución cuidadosa y perfeccionamiento de los procedimientos de inmovilización dará lugar completamente inmóvil animales.
3. Selección del fondo: selección cuidadosa de una región de fondo es necesaria para el análisis de imagen de éxito. Regiones fondo debe ser razonablemente uniforme y más oscuro que la neurona de imágenes. Debe estar lo suficientemente retirado para evitar la luz dispersada (y por lo tanto una señal de recogida) desde la neurona de imágenes. Nos encontramos con una región uniforme 20-50 m desde el retorno de la inversión funciona bien en la mayoría de los casos.
4. Óptica Proporcional: La correcta alineación de la óptica de imagen es esencial para generar una imagen dual clara. Archivos adjuntos Comerciales microscopio para obtener imágenes radiométrica están disponibles. Una técnica alternativa es emplear rápida de imagen secuencial usando una rueda de filtro rápido para cambiar rápidamente entre longitudes de onda de emisión durante la grabación de imágenes independientes para cada uno.
5. Análisis radiométrico: El análisis descrito aquí es una técnica relativamente simple que genera señales de sólidos en virtud de un promedio de más de un ROI. Se requiere un objeto reconocible brillante para seleccionar el ROI. Más análisis radiométrico sofisticado es posible por alineando con precisión y la cartografía de las dobles imágenes tales que la relación fluorescente se puede calcular píxel por píxel.

Representative Results

Aquí se presentan los resultados de dos experimentos separados. El primero emplea GCaMP para medir la respuesta de una neurona sensorial específico a un estímulo externo definido, dando un buen ejemplo de cómo los reporteros fluorescentes de calcio se puede utilizar para controlar ópticamente la actividad neuronal en intacto C. elegans. El segundo emplea cameleon para medir el calcio intracelular transitoria activa dentro de una neurona en respuesta al daño del láser específico, lo que ilustra cómo la fisiología de calcio puede ser medida dentro de una célula in vivo. Para centrarse en los aspectos técnicos de cada medición de los resultados de los ensayos individuales se presentan y discuten en detalle. A menudo, la respuesta promedio en el tiempo (calculado como el promedio de respuesta en cada punto de tiempo con respecto al estímulo) o una métrica específica (tal como la amplitud media de la respuesta) se calculan a través de numerosos ensayos. Típicamente 10-20 ensayos son necesarios para generar una medición promedio aceptable pero tsu número dependerá de la variabilidad inherente de la respuesta. Tal análisis de datos para los experimentos discutidos aquí se pueden encontrar en ¹² y ^13.

GCaMP medición de respuesta sensorial: Cuando se somete a un fuerte campo eléctrico externo (≥ 3 V / cm), C. elegans activamente arrastrarse hacia el polo negativo del campo con el movimiento preciso dirigida. Anteriormente mostró que este comportamiento electrotactic está mediado principalmente por las neuronas ASJ izquierdo y derecho, amphid neuronas sensoriales localizados en la cabeza del animal ^12. Para visualizar esta respuesta se utilizó una cepa transgénica que expresa GCaMP3 específicamente en las neuronas ASJ izquierda y derecha, en el gpa-9 promotor. Nos inmovilizado animales para obtención de imágenes usando almohadillas de agarosa que contenían 0,05% Levamisol intercalada entre dos hojas de la cubierta (como se describe en los procedimientos). El estímulo eléctrico se administró utilizando una costumbre construido cámara de imágenes que cabe en eletapa de un microscopio invertido Nikon Ti (ver ^12). En resumen, la preparación de cubreobjetos se coloca (con el lado de tornillo sin fin hacia abajo) sobre un agujero en una pequeña cámara de plástico que permite el acceso de los objetivos de abajo y estándar de formación de imágenes a través de la hoja de cubierta. La cámara se llenó con 0,25 mM de NaCl y 50 mM de tampón de glicerol y el estímulo campo eléctrico aplicado utilizando dos electrodos de platino que recubren los extremos de la cámara. Como se describió anteriormente, una única neurona ASJ expresar CGaMP formó una imagen usando un X100 1,4 NA objetivo de inmersión en aceite y estándar GFP filtro. Una película de lapso de tiempo fue adquirido por 80 seg (1 cuadros / s, tiempo de exposición 300 ms), mientras que someter el animal a un externo 3 V / cm campo eléctrico de tres ensayos separados con una duración de 10 seg (Figura 3). Se midió la intensidad de fluorescencia en el cuerpo de la célula mediante el análisis de imagen descrito anteriormente. El vídeo muestra fallos leves de tanto el movimiento y la deriva de enfoque durante el transcurso del experimento. El strength de la señal GCaMP sigue siendo robusto sin embargo mostrando un aumento grande ~ 250% de la fluorescencia en respuesta tanto a la 1 ^ª y 3 ^ª estímulos. El resultado de los estímulos segundo se reduce sustancialmente demostrando la variabilidad en la respuesta neuronal. La decoloración es mínimo, como es evidente por el retorno a un nivel de referencia constante.

Cameleon medición de la fisiología celular de calcio: lesión traumática celular desencadena un incremento transitorio de calcio dentro de una neurona que juega un papel esencial en la respuesta destino dictando fisiológico celular (muerte celular frente a la iniciación de los procesos de reparación). Se puede medir esta respuesta al daño inducido in vivo utilizando un láser de femtosegundo para cortar individuo C. elegans neuronas ^14, mientras que la medición simultánea de señales celulares de calcio utilizando cameleon YC3.60 ^{13, 15.} Los animales que expresan cameleon YC3.60 en los seis neuronas mechanosensory (bajo lamec promotor-4), se inmovilizaron utilizando 10% de agarosa y poliestireno nanopartículas como se describe en los procedimientos. Se empleó óptica dual de imágenes para registrar las señales de ambos canales de la PPC y YFP fluorescencia como se describe en los procedimientos. Hemos fotografiado una única neurona ALM y láser dirigido el axón ~ 20 m desde el cuerpo celular (Figura 4A). El axón se cortó por un breve (<1 segundo) la exposición a la luz de un láser pulsado de femtosegundo infrarroja centrado en el punto de destino a lo largo del axón por el objetivo de imágenes (ver ¹³ para obtener más información sobre la cirugía láser). Time-lapse imágenes en un marco cada 3 s, con 400 ms tiempo de exposición se registraron 320 sec mientras se realiza la cirugía láser y los niveles de calcio calculados mediante el análisis radiométrico.

Las señales se han medido de forma independiente en el cuerpo de la célula (Figura 4B) y para el segmento de axón dentro de 5 m del punto de corte (Figura 4C). Las cifras ponen de manifiesto tanto la CIntensidades de PF y YFP así como provocar la relación de FRET. La medición en el cuerpo de la célula se comporta bien con la PPC disminuyendo rápidamente y la YFP aumentar en respuesta al daño en el láser sec t = 0 (flecha roja). Esto da lugar a un inmediato aumento ~ 200% en la señal radiométrica (Df / F), que se mantiene durante ~ 90 segundos antes de volver a caer a los niveles basales cerca. El blanqueo es mínima, como es evidente a partir de la línea de base consistente.

En el segmento de axón cerca del punto de corte, la cantidad local de fluoróforo varía durante el curso del experimento, lo que complica la señal. La cirugía con láser corta el axón y brevemente rompe la membrana, lo que permite escapar a fluoróforo y temporalmente reduciendo su concentración citoplásmica local. Esto es evidente a partir de una disminución inicial en la traza YFP en la Figura 4C y una comparación del segmento axonal cerca del punto de daño en las imágenes YFP en los instantes t = 0 y t = sec sec 6, la Figura 4A. En later puntos de tiempo, el extremo cortado se hincha como parte de su recuperación continua, resultando en más localizada fluoróforo y un aumento de la intensidad. Esto es más evidente en la traza aumentando lentamente la PPC en la Figura 4C y una comparación del segmento de axón en imágenes la PPC en los instantes t = 0 y t = sec sec 270, la Figura 4A. Sin embargo estas variaciones afectan tanto a los canales por igual y la relación de FRET compensa eficazmente. La medida resultante muestra una respuesta similar a la del cuerpo celular con un aumento inmediato ~ 150% en la señal (Df / F), una recuperación dramática a la línea base cerca a ~ 90 segundos, y luego un adicional de respuesta secundaria, más pequeña en ~ 150 seg. El análisis radiométrico es crítico para esta medición, ya que sería extremadamente difícil de separar la señal de calcio de los otros efectos, que pueden variar ampliamente de una neurona a otra y la cirugía de la cirugía. La señal de axón tiene más ruido en comparación con la señal del cuerpo celular principalmente debido a la atenuación de fluorescencia yel retorno de la inversión menor en el axón más estrecho.

Figura 1. Configuración básica y la óptica proporcional. A) La fotografía muestra la configuración experimental que consiste en un microscopio compuesto invertido y óptica de formación de imágenes ratiometric. B) Un diagrama esquemático que ilustra el sistema óptico de formación de imágenes necesarias para los ratiometric FRET basados ​​en mediciones. La imagen se divide en las dos longitudes de onda o canales, que se proyectan de lado a lado sobre el conjunto CCD.

Figura 2. Preparación de la muestra. C. elegans están montados en finas almohadillas de agarosa para formación de imágenes. almohadillas A) de agarosa se ​​realizan intercalando una pequeña gota deagarosa fundida entre dos portaobjetos separados por dos piezas de cinta de laboratorio. B) Los animales son transferidos sobre la almohadilla de agarosa y se cubre con un cubreobjetos, mantiene en su lugar por una pequeña cantidad de cera en cada una de las cuatro esquinas.

Figura 3. GCaMP datos de ejemplo. La señal GCaMP, Df / F, grabado en vivo desde el cuerpo celular de la neurona ASJ responder a una alternancia de encendido / apagado de campo eléctrico (verde traza). Las líneas gruesas grises indican períodos en los que el campo eléctrico externo (3 V / cm) se aplica al animal. La barra de escala representa 100% de aumento en la intensidad de fluorescencia.

Figura 4. Cameleon datos de ejemplo. A) Tres marcos separados que muestra la imagen dualver de una neurona ALM antes y después de la cirugía láser de los axones 20 micras desde el cuerpo celular. La flecha roja en el panel central indica el punto de corte. El panel inferior muestra el cuerpo de la célula y el segmento de axón producir las señales en B y C. B) El cameleon YC3.60 la señal medida en el cuerpo celular de la neurona ALM antes y después de la cirugía con láser (flecha roja). C) El YC3 cameleon .60 señal medida en el segmento del axón dentro de los 5 m del punto de corte antes y después de la cirugía láser. Trazas amarillas indican señales YFP, huellas azules indican las señales de la PPC y trazas de naranja son la resultante FRET ratio. Todas las horas son relativos al momento de la cirugía láser. Las barras de escala representan un aumento del 100% en la intensidad de fluorescencia. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Discussion

Genéticamente codificados indicadores de calcio se han utilizado ampliamente en C. elegans neurobiología. Numerosos grupos han empleado estas técnicas para estudiar la respuesta de las neuronas sensoriales primarias a estímulos externos como se demuestra aquí con la respuesta ASJ a un campo eléctrico. Ejemplos destacados incluyen sensación del tacto mecánico, productos químicos específicos, la temperatura y un campo eléctrico ^{12, 16-19.} Actividad de interneuronas y células musculares también han sido objeto de seguimiento tanto en respuesta a estímulos y en el control del comportamiento animal. Muchos de estos estudios han llevado a estas técnicas de un paso más allá mediante el reconocimiento de imágenes y técnicas de rastreo para permitir la grabación de las neuronas en los animales parcialmente restringidas o incluso mover libremente, así como la grabación de las neuronas al mismo tiempo. Estudios adicionales han investigado otros aspectos de la fisiología de calcio tales como la respuesta al daño neuronal ^{13, 20} tal como se presentan aquí, así comodegeneración neuronal en escalas de tiempo más largas ^21.

En el diseño de un experimento particular, cada una de las técnicas alternativas con respecto a los reporteros comúnmente usados ​​calcio e inmovilización animal debe ser considerado cuidadosamente. Técnicas de inmovilización será dictado por aspectos técnicos tales como la necesidad de acceso físico a los animales, la capacidad de recuperar los animales después de formación de imágenes o la necesidad de un alto rendimiento. Diferentes periodistas calcio fluorescentes tienen ventajas y desventajas. GCaMP emplea sencillo análisis de una sola imagen del canal y la gran señal-a-ruido hace que sea aplicable a muchas situaciones. Cameleon por otro lado requiere imágenes más complejas y análisis, pero la medición radiométrica resultante puede ser crítico en situaciones con artefactos potencialmente grandes. Por ejemplo, las fluctuaciones en la cantidad de fluoróforo (como en el ejemplo daños láser) también puede ocurrir durante periodos de tiempo largos(Horas) debido a cambios en los niveles de expresión. Otras estrategias de formación de imágenes duales también son posibles tales como GCaMP co-expresada con (o unidos físicamente a) un fluoróforo RFP. Aunque no FRET basada en esto de aprovechar la amplia gama dinámica de variantes GCaMP modernos mientras se utiliza el canal rojo como una medida de referencia en tiempo real.

Es importante tener en cuenta que numerosos sistemas de dos canales de formación de imágenes de microscopio y software de análisis que están disponibles comercialmente, mientras que a menudo más caro, puede ser atractivo para los investigadores reacios a construir el sistema de casa construida descrito aquí. Los sistemas comerciales de imágenes duales (DualView2-DV2, Photometrics) suelen utilizar ópticas similares a nuestro sistema de casa construida pero están contenidos dentro de un único archivo adjunto microscopio con procedimientos de alineación estandarizados. Por otra parte, los sistemas de intercambio rápido de filtro (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) permite una rápida imagen en tiempo real secuencial de dos canales de color wisn óptica de imagen adicionales pero también son caros y requieren una sincronización precisa entre el filtro de intercambio y adquisición cámara.

En resumen, C. elegans presenta una serie de ventajas como un sistema de formación de imágenes in vivo. Los fluoróforos genéticamente codificados son a menudo específica de la célula y puede eliminar la necesidad de la inyección o administración de fluoróforos exógenos. C. accesibilidad elegans óptico permite visualizar imágenes en animales intactos que son fáciles y rentables para mantener, no requieren la disección complicada o cultivo neuronal y preservar la fisiología celular. Además, C. elegans tiene grandes capacidades para el análisis genético con un gran número de reactivos disponibles y técnicas genéticas bien establecidas. Hay desventajas de curso en el sistema, la principal preocupación quizás es que es un invertebrado. Además, los fluoróforos informar de los cambios relativos en la concentración de calcio rather de un valor absoluto y la resolución temporal de las mediciones puede ser restringida por tanto la dinámica del fluoróforo sino también los tiempos de integración necesarios de débiles señales de fluorescencia. Finalmente, mientras que el calcio es una parte integral de la actividad neuronal y la señalización de los fluoróforos no directamente reportar el potencial de voltaje de la membrana, medido con técnicas electrofisiológicas. No obstante ilustra mediante los procedimientos que aquí se presentan, C. elegans es un atractivo, relativamente simple, rentable sistema para una amplia gama de estudios de imágenes neuronales.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B