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Neuroscience

Vivo सी. में neuronal कैल्शियम इमेजिंग में एलिगेंस

Published: April 10, 2013 doi: 10.3791/50357
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Physiology and Biophysics, Boston University School of Medicine, 2Boston University Photonics Center
* These authors contributed equally

Summary

अपने छोटे पारदर्शी शरीर, neuroanatomy अच्छी तरह से प्रलेखित और उत्तरदायी आनुवंशिक तकनीक और अभिकर्मकों के एक मेजबान के साथ,

Abstract

निमेटोड कीड़ा सी. एलिगेंस अपेक्षाकृत सरल है, vivo में कम लागत neuronal इमेजिंग के लिए एक आदर्श मॉडल जीव है. अपने छोटे पारदर्शी शरीर और सरल, अच्छी तरह से विशेषता तंत्रिका तंत्र और बरकरार पशु के भीतर किसी भी न्यूरॉन के प्रतिदीप्ति इमेजिंग की पहचान की अनुमति देता है. पशु शरीर क्रिया विज्ञान पर न्यूनतम प्रभाव के साथ सरल स्थिरीकरण तकनीक विस्तारित समय चूक इमेजिंग की अनुमति देते हैं. cameleon 1 और 2 GCaMP के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संवेदनशील fluorophores के विकास neuronal दोनों सेल फिजियोलॉजी और neuronal गतिविधि से संबंधित कैल्शियम के vivo इमेजिंग में अनुमति देते हैं. कई ट्रांसजेनिक विशिष्ट न्यूरॉन्स में इन fluorophores व्यक्त उपभेदों आसानी से उपलब्ध हैं या अच्छी तरह से स्थापित तकनीक का उपयोग करते हुए निर्माण किया जा सकता है. यहाँ, हम vivo में एक न्यूरॉन का उपयोग दोनों GCaMP और cameleon के भीतर कैल्शियम गतिशीलता को मापने के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है. हम फायदे और disadvant पर चर्चादोनों की उम्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूना (जानवर स्थिरीकरण) तैयार करने और छवि विश्लेषण के विभिन्न तरीकों. अंत में, हम दो प्रयोगों से परिणाम वर्तमान: 1) GCaMP का उपयोग करने के लिए एक बाहरी बिजली के क्षेत्र और 2 के लिए एक विशिष्ट न्यूरॉन के संवेदी प्रतिक्रिया) cameleon का उपयोग करने के लिए दर्दनाक लेजर क्षति के लिए एक न्यूरॉन के शारीरिक कैल्शियम प्रतिक्रिया को मापने को मापने. इस तरह के रूप में इन कैल्शियम इमेजिंग तकनीक सी. में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है एलिगेंस और आज़ादी से चलती जानवरों, एक साथ एकाधिक न्यूरॉन्स और तुलना में किया गया है आनुवंशिक पृष्ठभूमि भर माप सी. बढ़ाया. एलिगेंस लिए अन्य मॉडल सिस्टम पर तकनीकी सादगी और लागत में लाभ के साथ vivo neuronal इमेजिंग में एक मजबूत और लचीली प्रणाली प्रस्तुत करता है.

Introduction

यहाँ हम सी. में vivo कैल्शियम इमेजिंग में वर्तमान के लिए व्यावहारिक तरीके एलिगेंस न्यूरॉन्स. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम के प्रति संवेदनशील fluorophores के उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ विकास सी. बनाता है neurophysiology और गतिविधि की माप के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी प्रणाली एलिगेंस. हमारी इमेजिंग आमतौर पर उपलब्ध fluorophores के व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग एक मानक यौगिक खुर्दबीन के साथ किया जाता है. हम कई विभिन्न fluorophores और अलग नमूना तैयारी रोजगार तकनीक मौजूद है, और प्रत्येक की ताकत और कमजोरी पर चर्चा. डाटा तो दो उदाहरण प्रयोगों से प्रस्तुत किया है. यहाँ वर्णित तकनीकों पर एक उत्कृष्ट अतिरिक्त संसाधन, आर Kerr द्वारा "न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की गतिविधि इमेजिंग" (WormBook में पाया जा सकता http://www.wormbook.org 3).

Geneti के दो प्रमुख वर्गोंबड़ी सफाई encoded फ्लोरोसेंट कैल्शियम संवाददाताओं से सामान्यतः सी. में उपयोग किया जाता है एलिगेंस एकल चैनल GCaMP और झल्लाहट आधारित cameleon:. हम विधियों का वर्णन और प्रत्येक के द्वारा उत्पन्न डेटा के लिए उदाहरण दिखा देंगे.

GCaMP एक संशोधित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) कि आसपास के कैल्शियम एकाग्रता के प्रति संवेदनशील है पर आधारित है. यह GFP की विलय और उच्च कैल्शियम आत्मीयता प्रोटीन calmodulin, जैसे कि कैल्शियम की calmodulin से बाध्यकारी एक कुशल फ्लोरोसेंट 2 पुष्टि GFP अणु में लाता है के द्वारा पूरा किया है. इन fluorophores में हाल ही में प्रगति प्रतिदीप्ति तीव्रता में कैल्शियम का स्तर एक शारीरिक श्रृंखला और ~ 95 मिसे वृद्धि समय और ~ 650 मिसे क्षय 4 समय के काफी तेजी से कैनेटीक्स पर 500% अप करने के लिए वृद्धि के साथ असाधारण संकेत आकार उत्पन्न करते हैं. अपेक्षाकृत कम समय अवधि (मिनट), इन बड़े संकेत कम संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति (कम वृद्धि) और कर सकते हैं, एक init अच्छी तरह से व्यवहारial आधारभूत माप, निरंतर आधारभूत या तुलनात्मक माप के लिए आवश्यकता नकारना.

Cameleon एक fluorophore झल्लाहट आधारित है कि एक ratiometric दो स्वतंत्र चैनल या 1 तरंगदैर्य की तुलना माप उत्पन्न होने का फायदा है. यह दो अलग (सियान और पीले उत्सर्जन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, CFP और YFP) fluorophores एक calmodulin प्रोटीन से जुड़े हुए होते हैं. जटिल नीले प्रकाश (440 एनएम) कि CFP उत्तेजित के साथ प्रबुद्ध है. कैल्शियम की बाइंडिंग fluorophores करीब एक साथ लाता है, CFP (दाता) से प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) बढ़ती YFP (स्वीकर्ता) और CFP उत्सर्जन (480 एनएम) में कमी करने के लिए और YFP उत्सर्जन (535 एनएम) को बढ़ाने के कारण . रिश्तेदार कैल्शियम का स्तर YFP / CFP तीव्रता के अनुपात के रूप में मापा जाता है. Cameleon कैनेटीक्स GCaMP, vivo में मापा ~ 1 सेकंड की वृद्धि समय और ~ 3 5 सेकंड के एक क्षय समय की तुलना में धीमी गति से कर रहे हैं. हालांकि,oppositely आगे बढ़ संकेतों के संकेत अनुपात का आकार बढ़ता है और fluorophore एकाग्रता, गति, या फोकस बहाव और विरंजन में परिवर्तन की वजह से संभव कलाकृतियों की एक संख्या के लिए compensates.

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट पत्रकारों से नमूना exogenously प्रशासित जांच और सी. के साथ आवश्यक तैयारी की बहुत नकारना एलिगेंस छोटे पारदर्शी शरीर बरकरार सरल प्रतिदीप्ति व्यापक क्षेत्र का उपयोग पशु भीतर इमेजिंग की अनुमति देता है. नमूना तैयार करने में मुख्य तकनीकी चुनौती है इसलिए जानवरों के लिए सुरक्षित रूप से स्थिर है. वहाँ अलग फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीकों का एक नंबर रहे हैं. जानवरों को पंगु बना एक औषधीय एजेंट का प्रयोग को लागू करने के लिए आसान है और एक तैयारी पर कई जानवरों के बढ़ते (levamisole, एक cholinergic agonist है कि मांसपेशियों के ऊतकों को जब्त करने का कारण बनता है आम तौर पर प्रयोग किया जाता 6) की अनुमति देता है सी.. एलिगेंस भी शारीरिक रूप से उन्हें बढ़ते द्वारा स्थिर हो सकता हैकड़ी 10% agarose 7, 8 पर. पशु शरीर क्रिया विज्ञान पर यह कम से कम प्रभाव है, लंबी अवधि के इमेजिंग (घंटे) और कई जानवरों की वसूली की अनुमति देता है, लेकिन और अधिक तकनीकी रूप से कठिन है. इन तकनीकों के दोनों जानवरों (जो एक कवर पर्ची के तहत कर रहे हैं) के लिए शारीरिक का उपयोग सीमित है और इसलिए केवल कुछ प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं (जैसे प्रकाश, तापमान, बिजली के क्षेत्र में या लेजर क्षति के रूप में) के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. या रसायनों के संपर्क प्रशासन के रूप में जहां शारीरिक का उपयोग की आवश्यकता है उत्तेजनाओं के लिए, कई अध्ययनों सफलतापूर्वक सी. चिपके हैं जगह में एलिगेंस (पशु चिकित्सा ग्रेड गोंद का उपयोग कर) 9. यह तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण है, एक एकल पशु तैयारी है और जानवर वसूली की अनुमति नहीं है. अंत में, कई microfluidic उपकरणों नियोजित किया गया है कि शारीरिक रूप से सी. को नियंत्रित एलिगेंस, पशु शरीर क्रिया विज्ञान के संरक्षण, उत्तेजनाओं (डिवाइस डिजाइन पर निर्भर करता है) के सबसे प्रकार के लिए जोखिम की अनुमति सक्षम कर सकते हैं और तेजी से और पशुओं की विनिमय वसूली

यहाँ प्रस्तुत तरीकों neuronal और सी. में सेल फिजियोलॉजी गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एलिगेंस. हम प्रत्येक का एक उदाहरण दे: GCaMP का उपयोग करने के लिए एक बाहरी बिजली क्षेत्र के लिए ASJ न्यूरॉन का संवेदी प्रतिक्रिया को मापने, और cameleon का उपयोग करने के लिए शारीरिक कैल्शियम एक न्यूरॉन के लेजर क्षति प्रतिक्रिया उपाय. इन उदाहरणों fluorophores के लिए दो प्रकार के लाभ और कमियां दिखाने के लिए और वर्णन क्या प्रणाली के साथ संभव है.

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Protocol

1. ऑप्टिकल सेटअप

  1. Epifluorescence इमेजिंग क्षमताओं के साथ एक मानक यौगिक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें. हम एक Intensilight पारा प्रकाशक के साथ एक Nikon ग्रहण तिवारी यू औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें.
  2. सबसे अच्छी छवि और संकेत गुणवत्ता के लिए एक उच्च वृद्धि, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य से उपयोग करें. हम आम तौर पर एक Nikon X60 1.4 NA तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें. कुछ मामलों में यह संभव है fluorophore और सिग्नल की शक्ति की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है और कम बढ़ाई (X40, X20) का उपयोग करें.
  3. एक उच्च सीसीडी कैमरा ठंडा संवेदनशीलता एक Andor क्लारा कैमरा के रूप में छवि संवेदनशीलता को अधिकतम और पृष्ठभूमि शोर को कम से कम प्रयोग करें.
  4. एकल रंग fluorophores मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की fluorophore विशेष तरंगदैर्ध्य के लिए तैयार सेट फिल्टर का उपयोग करें. के लिए GCaMP एक मानक GFP फिल्टर का उपयोग 488 एनएम और 525 एनएम पर उत्सर्जन में उत्तेजना के लिए अनुकूलित सेट. आगे कोई ऑप्टिकल संशोधनों की आवश्यकता हैं.
    5. चित्रा 1 में सचित्र है. यह के होते हैं:
    1. एक खुर्दबीन 440 ± 20 एनएम उत्तेजना फिल्टर और 455 एनएम के साथ सेट फिल्टर लंबे dichroic दर्पण गुजरती हैं.
    2. एक छवि मुखौटा खुर्दबीन इमेजिंग बंदरगाह (जहां कैमरा सीसीडी सेंसर आमतौर पर बैठते थे) के बाहर तुरंत प्रारंभिक छवि विमान में रखा. यह ऐसी है कि यह सेंसर कैमरा का केवल आधा भर जाएगा देखने के क्षेत्र प्रतिबंधित. पहली छवि विमान तेज छवि सीमाओं में परिणाम और कोई ओवरलैप जब दो छवियों पक्ष द्वारा साइड पेश कर रहे हैं पर यह मुखौटा दे.
    3. 1 रिले लेंस एक फोकल लम्बाई सेट टी से दूरवह प्रारंभिक छवि ऐसी है कि यह प्रकाश collimates विमान.
    4. एक dichroic दर्पण है कि दो अलग - अलग इमेजिंग तरंगदैर्य या चैनल एक रंग (> 515 एनएम पीला,) को दर्शाती है, जबकि अन्य (<515 एनएम, सियान) संचारण में प्रकाश विभाजन है.
    5. उत्सर्जन (फिल्टर बैंड पास फिल्टर) आगे प्रेषित प्रकाश सीमित विशिष्ट इमेजिंग तरंगदैर्ध्य (485 सियान ± 40 एनएम और 535 पर पीले ± 30 एनएम),
    6. 2 रिले (एक प्रत्येक चैनल के लिए) लेंस बीम ऐसी है कि यह सीसीडी कैमरे में एक दूसरी छवि विमान प्रकाश refocuses पथ में रखा.
    7. दर्पण की एक जोड़ी और एक 2 dichroic दर्पण बीम ऐसी है कि दो छवियों recombined पथ का निर्देशन कर रहे हैं और कैमरा सीसीडी सेंसर पर पक्ष द्वारा साइड का अनुमान 4A चित्रा परिणामस्वरूप छवि का एक उदाहरण से पता चलता है.
  5. प्रारंभिक ऑप्टिकल संरेखण: सेटअप और प्रकाशिकी के संरेखण एक उच्च विपरीत imag के साथ आरंभई एक कम बढ़ाई लेंस और प्रेषित प्रकाश व्यापक क्षेत्र रोशनी (एक काले sharpie एक खुर्दबीन स्लाइड पर तैयार अच्छी तरह से काम करता है) का उपयोग. छवि को लाने के लिए खुर्दबीन oculars के माध्यम से ध्यान केंद्रित करने और तो माइक्रोस्कोप के लिए इस्तेमाल किया जा बंदरगाह के लिए बंद है. उच्च प्रकाश रोशनी के साथ एक सूचकांक कार्ड पर प्रारंभिक नाभीय विमान (खुर्दबीन बंदरगाह के बाहर कुछ सेमी) छवि को देखने. किरण पथ में 1 रिले लेंस (सी) की जगह ऐसी है कि यह एक प्रारंभिक फोकल हवाई जहाज़ से फोकल दूरी है और प्रकाश collimates जबकि किरण पथ (यानी सीधे किरण पथ में केन्द्रित है) deflecting नहीं. 1 फोकल हवाई जहाज़, देखने के आधा क्षेत्र को सीमित करने के लिए और छवि में एक तेज आवासी उत्पादन समायोजित पर नकाब रखें. दर्पण और फिल्टर (डी, ई, जी) ऐसी है कि किरण पथ मेज की सतह के समानांतर रहता और दो ​​समानांतर पक्ष द्वारा साइड पथ में चलाता है, के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया स्थान पर रखें. उनके संबंधित पथ किरण (एफ) में 2 रिले लेंस और केंद्रउन्हें आगे और पीछे के रास्तों साथ कदम एक सूचकांक थे कैमरा सीसीडी सेंसर होगा रखा कार्ड पर ध्यान केंद्रित करने के लिए छवियों को लाने. यदि सही ढंग से किया है दो छवियों खुर्दबीन oculars और अन्य कैमरा बंदरगाहों के साथ parfocal होना चाहिए. अंत में स्थिति में कैमरे की जगह और संरेखण ठीक धुन.
  6. ठीक ट्यूनिंग ऑप्टिकल संरेखण: ठीक धुन संरेखण ऑप्टिकल दोहरी सीसीडी कैमरे द्वारा देखी छवि का प्रयोग करें. एक उच्च विपरीत छवि का उपयोग करें और कम वृद्धि के साथ शुरू करने, अंतिम संरेखण के लिए उच्च वृद्धि के लिए स्विच. प्रेषित छवि (चित्रा 1B में सियान चैनल) की स्थिति के लिए एक्स और वाई स्थिति में कैमरा हिल परिलक्षित छवि (चित्रा 1B में पीले चैनल) के क्षेत्र के दूसरे आधे को कवर करने के लिए देखने के कैमरे के क्षेत्र के एक आधा कवर अपने किरण पथ में पिछले दो दर्पण (G) समायोजन करके देखें. प्रत्येक चैनल के लिए किरण पथ के साथ 2 रिले लेंस आगे और पीछे जाने से ध्यान केंद्रित ऑप्टिमाइज़ करें. अगर छोड़अनछुए ऑप्टिकल सेटअप स्थिर हो सकता है और केवल दुर्लभ ठीक धुन समायोजन की आवश्यकता चाहिए.

2. नमूना तैयार करने और डाटा अधिग्रहण.

  1. Caenorhabditis जेनेटिक्स (CGC) केंद्र या अन्य स्रोतों से ब्याज की न्यूरॉन में एक कैल्शियम संवेदनशील fluorophore व्यक्त जानवरों मोल. वैकल्पिक रूप से ट्रांसजेनिक जानवरों सी. मानक का उपयोग कर निर्माण किया जा सकता है एलिगेंस तकनीक. सिंगल सेल अभिव्यक्ति आवश्यक (और कभी कभी वांछनीय नहीं अगर कई न्यूरॉन्स के लिए जांच की जानी हैं, 12) छवियों और कई कक्षों से मापन आसानी से अलग किया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में नहीं है. यदि fluorophore transgene जीनोम में एकीकृत नहीं है, अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण बदलाव जानवर से जानवर के लिए हो सकता है. इस मामले में, उच्च अभिव्यक्ति एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन विदारक प्रयोग के स्तर के साथ पशुओं preselecting संकेत करने वाली शोर अनुपात बढ़ जाती है और माप में सुधार. Fluorophore अभिव्यक्ति nee स्तरघ अधिग्रहण के द्वारा प्रयोग आवश्यक मापदंडों के तहत आसानी से कैमरे के साथ imaged किया जा पर्याप्त हो.
  2. Agarose पैड पिघला हुआ agarose दो गिलास प्रयोगशाला टेप के दो टुकड़े के अंतराल स्लाइड्स के बीच एक छोटी सी बूंद दबाकर वांछित स्थिरीकरण तकनीक (2.3 नीचे देखें) के लिए आवश्यक है. यदि आवश्यक हो, तो agarose पैड पशुओं के बढ़ते पहले एक गिलास को कवर पर्ची के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है. चित्रा 2 देखें.
  3. सी. स्थिर इमेजिंग के लिए निम्न तकनीक का उपयोग एलिगेंस:
    1. भेषज Paralyzation: 2% agarose पैड (पिघला हुआ agarose में यह 2.2 में पैड बनाने से पहले मिश्रण) को 0.05% levamisole जोड़ें. पैड पर 5-10 जानवरों उठाओ और एक कवर पर्ची के साथ कवर. कवर पर्ची के कोनों को गर्म मोम मिश्रण की छोटी मात्रा में (50% पैराफिन मोम और 50% पेट्रोलियम जेली) लागू करने के लिए यह स्थिति में पकड़ है. Levamisole के लिए 5-10 मिनट प्रभाव और ख के लिए पशुओं को ले जाने की अनुमति देंपूरी तरह से अभी ecome है.
    2. कड़ी agarose स्थिरीकरण: सी. एलिगेंस शारीरिक रूप से कठोर 10% agarose पैड और 0.05 सुक्ष्ममापी व्यास polystyrene नैनोकणों का उपयोग कर स्थिर कर सकते हैं. 2.2 के रूप में 10% agarose पैड (एन जी एम बफर में 10 agarose वजन%). पैड के शीर्ष पर ~ मनका समाधान के 3 μl (मात्रा द्वारा 1:10 एन जी एम में polystyrene microspheres) जोड़ें. जल्दी, 5-10 सी. लेने में पैड पर मनका समाधान के पूल और धीरे एलिगेंस एक कवर पर्ची के साथ कवर. पिघला हुआ कवर पर्ची के कोनों को लागू करने के लिए यह स्थिति में पकड़ मोम का प्रयोग करें. (इस तकनीक पर अतिरिक्त जानकारी के लिए 7 के रूप में पिछले एक जौव 8 लेख के रूप में अच्छी तरह से देख)
    3. Gluing: सी. एलिगेंस पशु चिकित्सा ग्रेड चिपकने वाला जानवर के एक तरफ करने के लिए लागू की छोटी मात्रा का उपयोग कर जगह में सरेस से जोड़ा हुआ जा सकता है.
    4. Microfluidic उपकरणों: कई microfluidic उपकरणों के लिए शारीरिक रूप से सी. पकड़ के लिए डिजाइन किया गया है इमेजिंग के लिए जगह में एलिगेंस.
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  4. खुर्दबीन पर तैयार स्लाइड प्लेस और वांछित न्यूरॉन पर ध्यान केंद्रित किया है. यह अक्सर आसान सी. उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी और कम बढ़ाई का उपयोग एलिगेंस. तो खोजने के लिए और विशिष्ट न्यूरॉन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उच्च वृद्धि और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए स्विचन.
  5. प्रेरणा: यदि एक विशिष्ट उत्तेजना एक neuronal प्रतिक्रिया (प्रकाश, बिजली क्षेत्र, स्वाद और घ्राण cues, तापमान आदि) वांछित है, प्रोत्साहन तंत्र खुर्दबीन सेटअप है, जैसे कि यह जानवरों के लिए दी जा सकती में तैयार किया जाना चाहिए इमेजिंग जबकि नमूना तैयारी.
  6. खुर्दबीन सीसीडी कैमरे का उपयोग कर छवियों मोल. एक्सपोजर बार और उत्तेजना प्रकाश स्तर आधारभूत संकेत और की fluorophore अभिव्यक्ति के स्तर पर कमजोर संकेतों सादृश्यपूर्वक कम समय के संकल्प के साथ अब जोखिम बार की आवश्यकता के साथ निर्भर करेगा. हम आम तौर पर ~ 300 मिसे जोखिम बार का उपयोग करें.
  7. छवियों या तो व्यक्तिगत रूप से या एक तिवारी के रूप में मोलफिल्म ने मुझे चूक. क्योंकि सी. एलिगेंस न्यूरॉन्स आम तौर पर धीमी गति से सक्रियण गतिशीलता (यानी वे सोडियम आधारित कार्रवाई की क्षमता की कमी है) प्रदर्शित करने के लिए, अपेक्षाकृत धीमी ~ 1 सेकंड के फ्रेम दर अक्सर न्यूरॉन गतिकी को मापने के लिए पर्याप्त हैं. अधिग्रहण की दर ~ 90 फ्रेम प्रति सेकंड हालांकि इन एकीकरण कमजोर प्रतिदीप्ति के लिए आवश्यक समय के द्वारा सीमित किया जा सकता है किया गया है. एक न्यूरॉन के व्यक्तिगत फिल्में आसानी से कई (~ 5-10 मिनट) मिनट या उससे अधिक समय के लिए विस्तार अगर स्थिरीकरण तैयारी स्थिर है और फ्रेम दर अपेक्षाकृत धीमी गति से कर सकते हैं.

3. डेटा विश्लेषण

  1. वहाँ अलग फ्लोरोसेंट इमेजिंग सॉफ्टवेयर गतिशील और ratiometric ImageJ और एनआईएस - तत्वों सहित विश्लेषण क्षमताओं के साथ उपलब्ध संकुल के एक नंबर रहे हैं. हम एक सरल कस्टम MATLAB प्रोग्राम है कि ब्याज की एक चयनित क्षेत्र में औसत फ्लोरोसेंट संकेत उपाय का उपयोग करें.
  2. व्यक्ति (छवियों या समय चूक फिल्मों है कि रहने के लिएपूरी तरह से अभी भी) imaged न्यूरॉन और पृष्ठभूमि माप के लिए एक अलग पास के क्षेत्र के भीतर ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन करें. Ratiometric छवियों के लिए समान हैं और दोहरी छवियों के प्रत्येक के लिए रॉय पृष्ठभूमि क्षेत्रों का चयन करें.
  3. एक समय व्यतीत हो फिल्म के भीतर imaged न्यूरॉन के मामूली आंदोलन अतिरिक्त विश्लेषण की आवश्यकता है के लिए स्वचालित रूप से प्रत्येक फ्रेम, जो कई वस्तु ट्रैकिंग योजनाओं का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है में रॉय का चयन करें. हमारे कार्यक्रम जिसमें से एक मोटा सीमा (सभी फ्रेम में हितों का उद्देश्य को शामिल) मैन्युअल रूप से चयन किया जाता है और एक स्वतंत्र पृष्ठभूमि क्षेत्र का चयन फिल्म में सभी छवियों की एक संकुचित छवि प्रदर्शित करता है. पहला फ्रेम के लिए, एक रॉय मैन्युअल सीमा क्षेत्र के भीतर से चुना जाता है. बाद के प्रत्येक फ्रेम के लिए, इस कार्यक्रम के सीमा क्षेत्र के भीतर से प्रतिभाशाली पिक्सल का चयन करने के लिए सही आकार (यानी मैनुअल पहला फ्रेम ROI ज़्यादा से ज़्यादा के रूप में पिक्सल के एक ही नंबर) के एक रॉय उत्पन्न. छवियों के लिए जहां objecहितों की टी पर्याप्त इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक फ्रेम के लिए एक उचित रॉय का चयन सीमा क्षेत्र के भीतर आसपास के पृष्ठभूमि तो उज्जवल है.
  4. फ्लोरोसेंट संकेत, प्रत्येक फ्रेम के लिए एफ, ROI में औसत पिक्सेल तीव्रता ऋण पृष्ठभूमि क्षेत्र में औसत तीव्रता के रूप में गणना की है. Ratiometric मूल्यों दो संकेतों के अनुपात (YFP YFP पृष्ठभूमि) / (CFP CFP पृष्ठभूमि) -0.65 के रूप में गणना कर रहे हैं. 0.65 का कारक YFP चैनल है, जो fluorophores पर निर्भर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशेष फिल्टर इस्तेमाल किया (इस मूल्य आमतौर पर है ~ cameleon setups के लिए 0.6) सेट हो जाएगा में CFP चैनल के माध्यम से खून बहाना के लिए compensates.
  5. प्रत्येक फ्रेम के लिए रिश्तेदार कैल्शियम का स्तर एक प्रारंभिक आधारभूत मूल्य 1 फ्रेम (या फ्रेम की श्रृंखला) से मापा प्रतिशत सामान्यीकृत तीव्रता में परिवर्तन के रूप में गणना की है: ΔF / एफ = (F-) एफ (टी ओ) / एफ ओ, जहां एफ (टी) समय टी और एफ ओ में प्रतिदीप्तिप्रारंभिक आधारभूत मूल्य है.
  6. ROI ज़्यादा से ज़्यादा मजबूत सबसे मजबूत संकेतों सेल शरीर का चयन उत्पन्न करता है, लेकिन यह भी संभव है का चयन करने के लिए और तंत्रिका प्रक्रियाओं के साथ एक रॉय से संकेतों को मापने.

4. समस्या को सुलझाने

  1. ब्लीचिंग: उत्तेजना प्रकाश एक्सपोजर की fluorophore विरंजन है और संकेत है कि जोखिम के स्तर पर निर्भर करता है में लगातार कमी के द्वारा चिह्नित पैदा कर सकता है. Ratiometric मापन के लिए इस के लिए क्षतिपूर्ति करने में मदद करते हैं. हालांकि एक तरंग दैर्ध्य के चयनात्मक विरंजन अभी भी (आम तौर पर जल्दी CFP तो bleaches YFP) हो सकता है. यदि विरंजन जोखिम बार और / या उत्तेजना तीव्रता (मार्ग में रोशनी तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ) को कम करने के द्वारा प्रकाश जोखिम के स्तर को कम करने के लिए होता है. यदि आवश्यक हो, एक विरंजन के लिए नकली परीक्षण चल (एक ही उत्तेजना जोखिम लेकिन कोई neuronal प्रोत्साहन के साथ) और संकेत क्षय के समय लगातार बढ़ाता द्वारा क्षतिपूर्ति कर सकते हैं.
  2. सी. यह महत्वपूर्ण है जानवर रिकॉर्डिंग की अवधि भर में अपेक्षाकृत अभी भी बनी हुई है. एलिगेंस प्रकाश जोखिम और प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं जवाब, उन्हें सबसे रिकॉर्डिंग के समय में स्थानांतरित करने की संभावना है. मामूली आंदोलन माप में महत्वपूर्ण शोर खासकर जब मापने अक्षतंतु प्रक्रियाओं से शुरू कर सकते हैं. Ratiometric विश्लेषण करने के लिए कुछ हद तक और सेल शरीर से माप और अधिक मजबूत करने के लिए इन प्रभावों को कम करने में मदद करता है. सावधान निष्पादन और स्थिरीकरण प्रक्रियाओं के शोधन के अभी भी पूरी तरह से जानवरों में परिणाम देगा.
  3. पृष्ठभूमि चयन: एक पृष्ठभूमि क्षेत्र का चयन सावधानी से सफल छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक है. पृष्ठभूमि क्षेत्रों यथोचित वर्दी और imaged न्यूरॉन तो गहरा होना चाहिए. यह पर्याप्त imaged न्यूरॉन से बिखरे हुए प्रकाश (और इस प्रकार एक संकेत पिक) से बचने के लिए हटाया जाना चाहिए. हम एक वर्दी 20-5 क्षेत्र मिलROI का 0 सुक्ष्ममापी ज्यादातर मामलों में अच्छी तरह से काम करता है.
  4. Ratiometric प्रकाशिकी: इमेजिंग प्रकाशिकी के सही संरेखण एक स्पष्ट दोहरी छवि पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है. Ratiometric इमेजिंग के लिए वाणिज्यिक खुर्दबीन संलग्नक उपलब्ध हैं. एक वैकल्पिक तकनीक तेजी से अनुक्रमिक इमेजिंग एक तेजी से फिल्टर पहिया का उपयोग करने के लिए तेजी से उत्सर्जन तरंगदैर्य के बीच स्विच जबकि प्रत्येक के लिए अलग छवियों रिकॉर्डिंग को रोजगार है.
  5. Ratiometric विश्लेषण: विश्लेषण यहाँ वर्णित एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है कि एक रॉय से अधिक औसत के आधार पर मजबूत संकेत उत्पन्न है. यह एक मान्यतापूर्वक उज्ज्वल वस्तु रॉय का चयन करने की आवश्यकता है. अधिक परिष्कृत ratiometric विश्लेषण ठीक aligning और मानचित्रण दोहरी ऐसी है कि फ्लोरोसेंट अनुपात पिक्सेल द्वारा पिक्सेल की गणना कर सकते हैं छवियों के द्वारा संभव है.

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Representative Results

यहाँ हम दो अलग - अलग प्रयोगों से परिणाम प्रस्तुत करते हैं. 1 एक विशिष्ट संवेदी न्यूरॉन के एक परिभाषित बाह्य प्रेरणा के लिए प्रतिक्रिया को मापने GCaMP रोजगार, कैसे फ्लोरोसेंट कैल्शियम संवाददाताओं से ऑप्टिकली बरकरार सी. में neuronal गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अच्छा उदाहरण दे रही है एलिगेंस. 2 cameleon को मापने के लिए intracellular क्षणिक कैल्शियम विशिष्ट लेजर क्षति जवाब में एक न्यूरॉन के भीतर शुरू हो, इस प्रकार illustrating कैसे कैल्शियम शरीर क्रिया विज्ञान vivo में एकल कक्ष के भीतर मापा जा सकता है रोजगार. व्यक्तिगत परीक्षण के परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं और विस्तार से चर्चा की प्रत्येक माप के तकनीकी पहलुओं पर ध्यान केंद्रित है. अक्सर कई परीक्षणों के पार (प्रोत्साहन के लिए सम्मान के साथ हर समय बिंदु पर औसत प्रतिक्रिया के रूप में गणना) या एक विशिष्ट (जैसे प्रतिक्रिया के औसत आयाम के रूप में) मीट्रिक पर औसत प्रतिक्रिया की गणना कर रहे हैं. आमतौर पर 10-20 परीक्षणों एक स्वीकार्य औसत माप उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है, लेकिन टी रहे हैंउसका नंबर प्रतिक्रिया के निहित परिवर्तनशीलता में निर्भर करेगा. यहाँ विचार - विमर्श के प्रयोगों के लिए इस तरह के डेटा विश्लेषण 12 और 13 में पाया जा सकता है.

संवेदी प्रतिक्रिया की GCaMP माप: जब एक मजबूत बाहरी बिजली क्षेत्र (≥ 3 वी / सेमी), सी. के अधीन एलिगेंस सक्रिय रूप से सटीक निर्देश आंदोलन के साथ क्षेत्र के नकारात्मक पोल की ओर क्रॉल. हम पहले से पता चला है कि इस electrotactic व्यवहार मुख्य रूप से बाएँ और दाएँ ASJ के न्यूरॉन्स amphid संवेदी न्यूरॉन्स जानवर के 12 सिर में स्थित द्वारा मध्यस्थता है. इस प्रतिक्रिया की कल्पना हम एक ट्रांसजेनिक GCaMP3 gpa 9 प्रमोटर के तहत छोड़ दिया और सही ASJ न्यूरॉन्स में विशेष रूप से व्यक्त तनाव का इस्तेमाल किया है. हम इमेजिंग agarose 0.05% दो कवर फिसल जाता है (के रूप में प्रक्रियाओं में वर्णित है) के बीच sandwiched levamisole युक्त पैड का उपयोग करने के लिए पशुओं immobilized. बिजली प्रोत्साहन एक कस्टम बनाया इमेजिंग कक्ष पर फिट बैठता है कि का उपयोग प्रशासित थाएक औंधा Nikon तिवारी खुर्दबीन के मंच (12 देखें). संक्षेप में, कवर पर्ची तैयारी कीड़ा नीचे की ओर () के साथ एक छोटे से प्लास्टिक कवर स्लिप के माध्यम से नीचे और मानक से इमेजिंग उद्देश्यों के लिए उपयोग की अनुमति देता है कक्ष में एक छेद पर रखा गया है. चैम्बर 0.25 मिमी NaCl के साथ भरा हुआ था और 50 मिमी ग्लिसरॉल बफर और बिजली के क्षेत्र में प्रोत्साहन दो प्लैटिनम चैम्बर के छोर अस्तर इलेक्ट्रोड का उपयोग कर लागू है. जैसा कि ऊपर वर्णित है, एक एकल ASJ न्यूरॉन व्यक्त CGaMP एक X100 1.4 NA तेल विसर्जन उद्देश्य और मानक GFP फ़िल्टर सेट का उपयोग imaged किया गया था. एक समय व्यतीत हो फिल्म सेकंड 80 (1 फ्रेम / सेक, 300 मिसे जोखिम समय) के लिए अधिग्रहण कर लिया था, जबकि तीन अलग - अलग परीक्षणों के लिए एक स्थायी 10 सेकंड (3 चित्रा) एक बाहरी 3 वी / सेमी बिजली के क्षेत्र में पशु subjecting. हम सेल छवि विश्लेषण ऊपर वर्णित का उपयोग कर शरीर में प्रतिदीप्ति तीव्रता मापा. वीडियो प्रदर्शित दोनों और प्रयोग के पाठ्यक्रम पर ध्यान केंद्रित बहाव आंदोलन की मामूली दोष. सेंटGCaMP संकेत के rength मजबूत बनी हुई है, लेकिन एक बड़े ~ दोनों 1 और 3 Rd उत्तेजनाओं जवाब में प्रतिदीप्ति में 250% की वृद्धि दर्शाता है. 2 उत्तेजनाओं से परिणाम काफी neuronal प्रतिक्रिया में कम परिवर्तनशीलता प्रदर्शन. विरंजन एक सुसंगत आधारभूत स्तर पर लौटने के द्वारा स्पष्ट रूप में न्यूनतम है.

Cameleon सेलुलर कैल्शियम शरीर क्रिया विज्ञान के माप: अभिघातजन्य सेलुलर चोट एक न्यूरॉन है कि शारीरिक प्रतिक्रिया हुक्म सेलुलर भाग्य (यानी कोशिका मृत्यु बनाम मरम्मत प्रक्रियाओं की दीक्षा) में एक आवश्यक भूमिका निभाता है के भीतर एक बड़ी क्षणिक कैल्शियम से चलाता है. हम vivo में इस प्रतिक्रिया क्षति प्रेरित एक femtosecond लेजर का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत सी. (सम्बन्ध) विच्छेद करना उपाय कर सकते हैं एलिगेंस 14 न्यूरॉन्स जबकि एक साथ सेलुलर कैल्शियम YC3.60 cameleon 13, 15 का उपयोग संकेतों को मापने. Cameleon YC3.60 छह mechanosensory न्यूरॉन्स (under में व्यक्त पशुmec 4 - प्रवर्तक), 10% agarose और polystyrene नैनोकणों के रूप में प्रक्रियाओं में वर्णित का उपयोग immobilized थे. हम दोहरी इमेजिंग प्रकाशिकी कार्यरत दोनों CFP और YFP प्रतिदीप्ति चैनलों के रूप में प्रक्रियाओं में वर्णित से संकेत रिकॉर्ड. हम एक एकल ALM न्यूरॉन imaged और लेजर ~ अक्षतंतु सेल शरीर (4A चित्रा) से 20 सुक्ष्ममापी को निशाना बनाया. अक्षतंतु एक संक्षिप्त (<1 सेकंड) एक अवरक्त इमेजिंग उद्देश्य (लेजर सर्जरी पर जानकारी के लिए 13 देखें) द्वारा अक्षतंतु साथ लक्ष्य बिंदु पर ध्यान केंद्रित लेजर स्पंदित femtosecond से प्रकाश के संपर्क से कटे किया गया था. हर 3 सेकंड 400 मिसे जोखिम बार के साथ फ्रेम, समय चूक छवियों 320 सेकंड के लिए दर्ज किया गया, जबकि लेजर सर्जरी और कैल्शियम ratiometric विश्लेषण का उपयोग कर की गणना के स्तर का प्रदर्शन.

सिग्नल सेल शरीर (4B चित्रा) में और कटौती बिंदु (चित्रा 4C) 5 सुक्ष्ममापी के भीतर अक्षतंतु खंड के लिए स्वतंत्र रूप से मापा गया. आंकड़े दोनों सी शोएफपी और YFP के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तीव्रता परिणामस्वरूप अनुपात झल्लाहट. सेल शरीर पर माप CFP तेजी से कम है और YFP = 0 टी सेकंड (लाल तीर) में लेजर क्षति के जवाब में वृद्धि के साथ व्यवहार किया जाता है. एक तत्काल ~ जो ~ 90 सेकंड के लिए आधारभूत स्तर के पास वापस गिरने से पहले निरंतर है ratiometric संकेत (/ ΔF एफ) में 200% वृद्धि में यह परिणाम है. ब्लीचिंग अनुरूप आधारभूत से स्पष्ट रूप में न्यूनतम है.

कटौती बिंदु के करीब अक्षतंतु खंड में, की fluorophore स्थानीय राशि प्रयोग के दौरान बदलता रहता है, संकेत उलझी. लेजर सर्जरी अक्षतंतु severs और संक्षिप्त झिल्ली ruptures, fluorophore बचने के लिए और करने के लिए अस्थायी रूप से अपने स्थानीय cytoplasmic एकाग्रता को कम करने की इजाजत दी. यह चित्रा 4C में एक YFP का पता लगाने में प्रारंभिक कमी और बार = 0 सेकंड और टी = 6 सेकंड, चित्रा -4 ए टी YFP छवियों में नुकसान बिंदु के पास अक्षतंतु खंड के एक तुलना से स्पष्ट है. लाआतंकवाद समय अंक, कटे अंत इसके निरंतर वसूली के हिस्से के रूप में फूल जाती है, अधिक स्थानीयकृत fluorophore और तीव्रता में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप. यह धीरे धीरे बढ़ती चित्रा 4C और बार = 0 सेकंड और टी = 270 सेकंड, चित्रा -4 ए टी CFP छवियों में अक्षतंतु खंड के एक तुलना में CFP ट्रेस में सबसे स्पष्ट है. हालांकि इन विविधताओं दोनों चैनलों को समान रूप से प्रभावित करती है और अनुपात झल्लाहट प्रभावी compensates. परिणामस्वरूप माप एक एक तत्काल ~ संकेत में 150% वृद्धि (/ ΔF एफ), ~ 90 सेकंड में निकट आधारभूत एक नाटकीय वसूली और फिर एक अतिरिक्त छोटे ~ 150 सेकंड में माध्यमिक प्रतिक्रिया के साथ सेल शरीर के लिए इसी तरह की प्रतिक्रिया से पता चलता है. ratiometric विश्लेषण इस माप के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह बेहद मुश्किल हो सकता है अन्य प्रभाव है, जो व्यापक रूप से न्यूरॉन से न्यूरॉन और शल्य चिकित्सा के लिए शल्य चिकित्सा के लिए भिन्न हो सकते हैं से कैल्शियम संकेत अलग होता है. अक्षतंतु संकेत सेल शरीर मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति dimmer के कारण संकेत करने के लिए और की तुलना में अधिक शोर हैसंकरा अक्षतंतु में छोटे ROI.

चित्रा 1
चित्रा 1. बुनियादी सेटअप और ratiometric प्रकाशिकी. एक तस्वीर) प्रयोगात्मक एक औंधा यौगिक माइक्रोस्कोप और ratiometric इमेजिंग प्रकाशिकी के मिलकर सेटअप से पता चलता है) बी. एक योजनाबद्ध आरेख illustrating इमेजिंग प्रकाशिकी ratiometric झल्लाहट आधारित मापन के लिए आवश्यक है. छवि दो तरंगदैर्य या चैनल, जो सीसीडी सरणी पर पेश कर रहे हैं पक्ष द्वारा साइड में विभाजित है.

चित्रा 2
चित्रा 2. नमूना तैयार सी.. एलिगेंस इमेजिंग के लिए पतली agarose पैड पर बढ़ रहे हैं ए) agarose पैड की एक छोटी सी बूंद sandwiching द्वारा बनाई गई हैं.दो माइक्रोस्कोप के बीच पिघला हुआ agarose प्रयोगशाला टेप के दो टुकड़े). बी पशु agarose पैड पर स्थानांतरित कर रहे हैं और एक coverslip, चार कोनों में से प्रत्येक पर एक मोम की एक छोटी राशि के द्वारा जगह में आयोजित के साथ कवर के अंतराल पर स्लाइड.

चित्रा 3
चित्रा 3. GCaMP उदाहरण डेटा GCaMP संकेत, / ΔF एफ, ASJ न्यूरॉन सेल शरीर एक बिजली के क्षेत्र (हरा ट्रेस) बंद / पर बारी जवाब देने से vivo में दर्ज की गई. मोटी ग्रे लाइनों से संकेत मिलता है जब बाहरी बिजली के क्षेत्र में पशु (3 वी / सेमी) के लिए लागू किया गया था. स्केल बार प्रतिदीप्ति तीव्रता में 100% की वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. Cameleon उदाहरण डेटा. ए) तीन अलग फ्रेम दोहरी छवि दिखानेसेल शरीर से अक्षतंतु 20 सुक्ष्ममापी की लेजर सर्जरी से पहले और बाद में एक ALM न्यूरॉन के देखने के लिए. मध्यम पैनल में लाल तीर कटौती बिंदु को इंगित करता है. नीचे के पैनल सेल शरीर और अक्षतंतु बी और सी में संकेत के उत्पादन क्षेत्र से पता चलता है). cameleon YC3.60 पहले और बाद में लेजर सर्जरी (लाल तीर) सी). cameleon YC3 ALM न्यूरॉन सेल शरीर में मापा संकेत .60 संकेत कटौती बिंदु के 5 सुक्ष्ममापी भीतर अक्षतंतु खंड में लेजर सर्जरी से पहले और बाद में मापा जाता है. पीला निशान YFP संकेतों, नीले निशान CFP संकेतों और नारंगी रंग के निशान से संकेत मिलता है जिसके परिणामस्वरूप अनुपात झल्लाहट संकेत मिलता है. सभी बार लेजर सर्जरी के समय के सापेक्ष हैं. स्केल सलाखों प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक 100% वृद्धि का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों को व्यापक रूप से किया गया है सी. में उपयोग एलिगेंस neurobiology. कई समूहों इन तकनीकों कार्यरत है प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के बाहरी उत्तेजनाओं को जवाब का अध्ययन करने के रूप में ASJ एक बिजली के क्षेत्र के लिए प्रतिक्रिया के साथ यहाँ का प्रदर्शन. प्रमुख उदाहरण यांत्रिक स्पर्श की अनुभूति, विशिष्ट रसायन, तापमान और एक बिजली के क्षेत्र 12, 16-19 में शामिल हैं. Interneuron और मांसपेशियों की कोशिकाओं की गतिविधि भी दोनों उत्तेजनाओं के जवाब में और पशुओं के व्यवहार के नियंत्रण में निगरानी भी किया गया है. इन अध्ययनों में से कई इन तकनीकों को एक कदम और आगे छवि मान्यता और ट्रैकिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए आंशिक रूप से स्र्द्ध या भी स्वतंत्र रूप से बढ़ने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पशुओं में कई न्यूरॉन्स से एक साथ रिकॉर्डिंग न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग सक्षम धक्का दिया है. अतिरिक्त अध्ययन neuronal क्षति 13, 20 के लिए प्रतिक्रिया के रूप में यहाँ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रस्तुत के रूप में कैल्शियम शरीर क्रिया विज्ञान के अन्य पहलुओं की जांच की हैलंबे समय 21 तराजू पर neuronal अध: पतन.

एक विशेष प्रयोग डिजाइन, वैकल्पिक तकनीकों के बारे में आमतौर पर इस्तेमाल किया कैल्शियम पत्रकारों और पशु स्थिरीकरण के प्रत्येक ध्यान से विचार किया जाना चाहिए. स्थिरीकरण तकनीक जानवर को शारीरिक का उपयोग करने के लिए जरूरत है, इमेजिंग या उच्च throughput के लिए जरूरत के बाद जानवरों को ठीक करने की क्षमता के रूप में इस तरह के तकनीकी पहलुओं से तय किया जाएगा. अलग फ्लोरोसेंट कैल्शियम संवाददाताओं विशिष्ट फायदे और नुकसान के रूप में अच्छी तरह से है. GCaMP सीधा एकल चैनल छवि विश्लेषण रोजगार और बड़े संकेत करने वाली शोर अनुपात कई स्थितियों को लागू करता है. दूसरे हाथ पर Cameleon अधिक जटिल इमेजिंग और विश्लेषण की आवश्यकता है, लेकिन जिसके परिणामस्वरूप ratiometric माप संभावित बड़े कलाकृतियों के साथ स्थितियों में महत्वपूर्ण हो सकता है. उदाहरण के लिए, fluorophore की राशि (लेजर क्षति उदाहरण के रूप में) में उतार - चढ़ाव को भी लंबे समय अवधि से अधिक हो सकता है(घंटे) अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन की वजह से. अतिरिक्त दोहरी इमेजिंग रणनीतियों भी GCaMP के रूप में (या शारीरिक रूप से जुड़ा हुआ है) एक आरएफपी fluorophore साथ सह व्यक्त संभव हो रहे हैं. जबकि नहीं आधारित झल्लाहट इस आधुनिक GCaMP वेरिएंट की बड़ी गतिशील रेंज का लाभ लेने के समय वास्तविक समय एक आधारभूत माप के रूप में लाल चैनल का उपयोग होगा.

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि कई दो चैनल इमेजिंग खुर्दबीन प्रणालियों और विश्लेषण सॉफ्टवेयर है, जो अक्सर अधिक महंगा है, जबकि, घर बनाया यहाँ वर्णित प्रणाली का निर्माण करने के लिए अनिच्छुक शोधकर्ताओं के लिए आकर्षक हो सकता है के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. वाणिज्यिक दोहरी इमेजिंग सिस्टम (DualView2 DV2, Photometrics) आम तौर पर हमारे घर का निर्माण प्रणाली के लिए इसी तरह की प्रकाशिकी का उपयोग लेकिन मानकीकृत संरेखण प्रक्रियाओं के साथ एक एकल खुर्दबीन लगाव के भीतर समाहित कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, तेजी से फिल्टर विनिमय प्रणाली (Lambda DG-4/DG-5 इसके अलावा, Sutter इंस्ट्रूमेंट्स) तेजी से वास्तविक समय दो रंग चैनलों के अनुक्रमिक इमेजिंग वाई की अनुमतिअतिरिक्त इमेजिंग प्रकाशिकी thout लेकिन भी महंगे हैं और फिल्टर विनिमय और कैमरा अधिग्रहण के बीच सटीक तुल्यकालन की आवश्यकता होती है.

सारांश में सी. एलिगेंस vivo इमेजिंग प्रणाली में एक के रूप में लाभ के एक नंबर प्रस्तुत करता है. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores अक्सर सेल विशिष्ट और सी. या इंजेक्शन exogenous fluorophores के प्रशासन के लिए आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं. एलिगेंस ऑप्टिकल पहुँच बरकरार जानवरों है कि आसान और लागत प्रभावी बनाए रखने के लिए कर रहे हैं के भीतर इमेजिंग, जटिल विच्छेदन या neuronal संवर्धन की आवश्यकता नहीं है और सेल फिजियोलॉजी बनाए रखने की अनुमति देता है. इसके अलावा सी. एलिगेंस उपलब्ध आनुवंशिक अभिकर्मकों और अच्छी तरह से स्थापित तकनीक की एक बड़ी संख्या के साथ आनुवांशिक विश्लेषण के लिए महान क्षमता है. वहाँ पाठ्यक्रम नुकसान की व्यवस्था करने के लिए कर रहे हैं, प्राथमिक चिंता शायद कि यह किया जा रहा है एक invertebrate है. इसके अलावा, fluorophores कैल्शियम एकाग्रता तत्पर में रिश्तेदार परिवर्तन की रिपोर्टएक निरपेक्ष मान और माप के समय संकल्प से r की fluorophore दोनों गतिशीलता भी कमजोर संकेतों के प्रतिदीप्ति आवश्यक एकीकरण बार द्वारा प्रतिबंधित किया जा सकता है. अंत में, जबकि कैल्शियम neuronal गतिविधि का एक अभिन्न हिस्सा है और fluorophores संकेत सीधे झिल्ली वोल्टेज के रूप में electrophysiological तकनीकों के साथ मापा संभावित रिपोर्ट नहीं है. के बहरहाल यहां प्रस्तुत, सी. प्रक्रियाओं द्वारा सचित्र एलिगेंस एक आकर्षक, अपेक्षाकृत सरल है, neuronal इमेजिंग अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागत प्रभावी प्रणाली है.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

कई लोगों ने इस पत्र में वर्णित काम करने के लिए योगदान दिया. CVG प्रयोगात्मक सेटअप बनाया, और रास, SHC, और CVG प्रयोगों का प्रदर्शन किया. CVG और SHC पांडुलिपि लिखा था. सभी लेखकों बाद में संशोधन की प्रक्रिया में भाग लिया और पांडुलिपि के अंतिम प्रतिलिपि को मंजूरी दे दी है. हम GCaMP तनाव के लिए पॉल स्टर्नबर्ग धन्यवाद. कुछ निमेटोड इस काम में इस्तेमाल उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स (CGC) केंद्र है, जो अनुसंधान संसाधन के लिए NIH राष्ट्रीय केंद्र (NCRR) द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान किया गया. MATLAB छवि विश्लेषण कार्यक्रम 18 में इस्तेमाल किया है कि से अनुकूलित किया गया था. लेखक बोस्टन विश्वविद्यालय और मैसाचुसेट्स जीवन विज्ञान केंद्र द्वारा समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eclipse Ti-U inverted
microscope		 Nikon
Intensilight HG Illuminator Nikon C-HGFI Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil Nikon
Optical table or 3'X3' optical
grade breadboard		 Thor Labs If an optical table is not used an
optical grade breadboard on a
solid laboratory bench should
suffice.
Clara Interline Camera Andor
Technology		 High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission Chroma Technology
Corp.		 41015 GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm Chroma D440/20x EX excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm
longpass		 Chroma 455DCLP BS microscope dichroic for cameleon
imaging
Dichroic mirror > 515 nm
longpass		 Chroma 515DCLP BS dichroic mirror for cameleon
imaging
Filter 535 +/- 15 nm Chroma D535/30m EM YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm Chroma D485/40m EM CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat Thor Labs AC508-200-A1 Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror Thor Labs ME2S-P01 FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole Sigma
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 08691-10, 2.5% by
volume, 50 nm
diameter		 polystyrene nanoparticles for C.
elegans immobilization
Transgenic strain, Strain
gpa-9::GCaMP3(in pha-1;
him-5 bkg) 		Sternberg Lab Strain PS6388
Transgenic strain, mec-
4::YC3.60		 Gabel Lab Strain CG1B

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References

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<em>Vivo सी.</em> में neuronal कैल्शियम इमेजिंग <em>में एलिगेंस</em>
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Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V.… More

Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. (74), e50357, doi:10.3791/50357 (2013).

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