Summary
Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e reagentes,
Abstract
O verme nemátodo C. elegans é um organismo modelo ideal para imagens relativamente simples, de baixo custo neuronal in vivo. O corpo transparente e simples pequeno, bem caracterizado, sistema nervoso permite a identificação e imagens de fluorescência de qualquer neurónio dentro do animal intacto. Técnicas de imobilização simples, com um impacto mínimo sobre a fisiologia do animal permitir imagens com lapso de tempo prolongado. O desenvolvimento de fluoróforos geneticamente codificados de cálcio sensíveis como cameleon 1 e 2 permitem GCaMP imagem in vivo de cálcio neuronal relacionada a fisiologia celular e da atividade neuronal. Foram identificadas numerosas estirpes transgénicas que expressam estas fluoróforos em neurónios específicos estão prontamente disponíveis ou podem ser construídos usando técnicas bem estabelecidas. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para medir a dinâmica do cálcio dentro de um único neurônio in vivo utilizando tanto GCaMP e cameleon. Discutimos vantagens e disadvantidades de ambos, assim como vários métodos de preparação da amostra (imobilização de animais) e análise de imagem. Por fim, apresentamos os resultados de dois experimentos: 1) utilizando GCaMP para medir a resposta sensorial de um neurônio específico para um campo elétrico externo e 2) Usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio de um neurônio a danos de laser traumático. Técnicas de cálcio de imagem, como estes são usados extensivamente em C. elegans e foram estendidos para medições em animais livremente móveis, neurônios múltiplas simultaneamente e comparação entre fundos genéticos. C. elegans apresenta um sistema robusto e flexível para a imagiologia neuronal in vivo com vantagens sobre outros sistemas de modelos em simplicidade técnica e custos.
Introduction
Aqui apresentamos métodos práticos para em imagens de cálcio vivo em C. neurônios elegans. O desenvolvimento de codificados geneticamente cálcio sensíveis fluoróforos com relação sinal-para-ruído de alto torna C. elegans um sistema relativamente simples e de baixo custo para a medição da neurofisiologia e da atividade. Nossa imagem é feita com um microscópio composto padrão, utilizando de campo amplo imagens de fluorescência de fluoróforos disponíveis correntemente. Nós apresentamos várias técnicas que empregam vários fluoróforos e preparações diferentes de amostra, discutir os pontos fortes e fracos de cada um. Os dados são então apresentados a partir de duas experiências de exemplo. Um excelente recurso adicional sobre as técnicas descritas aqui podem ser encontrados em WormBook, "Imaging a actividade dos neurónios e músculos" por R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) 3.
Duas grandes classes de geneticacamente codificados repórteres cálcio fluorescentes são comumente usados em C. elegans: GCaMP único canal e FRET baseada cameleon. Vamos descrever métodos e mostrar exemplos de dados gerados por cada um.
GCaMP baseia-se numa modificação Green Fluorescent Protein (GFP) que é sensível à concentração de cálcio circundante. Isto é realizado através da fusão de GFP e a alta afinidade da proteína de cálcio calmodulina, de tal modo que a ligação do cálcio por calmodulina traz a molécula GFP em uma confirmação eficiente fluorescente 2. Os avanços recentes no tamanho destes fluoróforos gerar sinal excepcional com aumento até 500% na intensidade de fluorescência ao longo de um intervalo fisiológico dos níveis de cálcio e de cinética razoavelmente rápidos de ~ 95 ms de tempo de subida e o tempo de decaimento ~ 650 mseg 4. Ao longo de períodos de tempo relativamente curtos (min), estes sinais grandes podem permitir a imagiologia de resolução mais baixa (inferior a ampliação) e, dado um bem comportado o initaferição ial, negar a necessidade de linha de base contínua ou medições comparativas.
Cameleon tem a vantagem de ser um fluoróforo com base em FRET, que gera uma medição raciométrica comparando dois canais independentes ou comprimentos de onda 1. É constituída por dois fluoróforos separadas (ciano e amarelo emissores de proteínas fluorescentes, PCP e YFP) ligadas por uma proteína calmodulina. O complexo é iluminado com luz azul (440 nm) que excita o PCP. A ligação de cálcio traz os fluoróforos mais juntos, o aumento de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a partir da PCP (dador) para o YFP (aceitador) e provocando a emissão de PCP (480 nm) para diminuir a emissão e YFP (535 nm) para aumentar . Os níveis de cálcio são medidos em relação como a razão entre a intensidade de YFP / PCP. Cinética Cameleon são mais lentos do que a de GCaMP, medido in vivo para ter um tempo de subida de uma sec ~ e um tempo de decaimento de ~ 3 seg 5. No entanto,a razão entre os sinais que se deslocam em oposição aumenta o tamanho do sinal e compensa para um certo número de possíveis artefactos devido a alterações na concentração de fluoróforo de movimento, ou o desvio de focagem e de branqueamento.
Codificados geneticamente repórteres fluorescentes anular grande parte da preparação da amostra necessária com sondas exogenamente administrado e C. elegans pequeno corpo transparente permite imagens dentro do animal intacto utilizando fluorescência de campo simples de largura. O principal desafio técnico na preparação da amostra é, portanto, de forma segura para imobilizar os animais. Há um número de diferentes técnicas usadas cada uma com vantagens e desvantagens. Usando um agente farmacológico para paralisar os animais é fácil de implementar e permite que a montagem de vários animais em uma preparação (Levamisole, um agonista colinérgico que provoca o tecido do músculo para aproveitar é tipicamente usado 6). C. elegans pode também ser fisicamente imobilizado por montá-losna dura de agarose a 10% 7, 8. Isto minimiza o impacto sobre a fisiologia do animal, permite que a longo prazo de imagens (horas) e recuperação de vários animais, mas é mais difícil tecnicamente. Ambas as técnicas de restringir o acesso físico para os animais (que se encontram sob uma lâmina de cobertura) e podem, portanto, ser utilizados apenas com certos estímulos experimentais (tais como a luz, a temperatura do campo eléctrico ou danos no laser). Para estímulos onde o acesso físico é necessário, como o toque ou a administração de produtos químicos, muitos estudos com sucesso colado C. elegans em vigor (usando cola grau veterinária) 9. Isso é tecnicamente mais desafiador, é uma preparação único animal e não permitir a recuperação dos animais. Por fim, vários dispositivos têm sido utilizados microfluidicos que fisicamente conter C. elegans, preservando a fisiologia animal, permitindo que a exposição à maioria dos tipos de estímulos (dependendo da concepção do dispositivo) e pode permitir a troca rápida e recuperação dos animais Os métodos aqui apresentados podem ser usados para medir a actividade neuronal e da fisiologia celular em C. elegans. Nós dar um exemplo de cada um: usando GCaMP para medir a resposta do neurônio sensorial ASJ a um campo elétrico externo, e usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio a danos de laser de um neurônio. Estes exemplos demonstram as vantagens e desvantagens dos dois tipos de fluoróforos e ilustram o que é possível com o sistema.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Configuração óptica
- Use um microscópio composto padrão com recursos de imagens de epifluorescência. Nós usamos um microscópio Nikon Eclipse Ti-U invertido com um iluminador HG Intensilight.
- Para uma melhor imagem e qualidade de sinal usar uma grande ampliação, o objetivo alta abertura numérica. Normalmente usamos uma Nikon X60 1,4 NA objetiva de imersão em óleo. Em alguns casos, é possível a utilização de mais baixa ampliação (X40, X20), dependendo do nível de expressão do fluoróforo e intensidade do sinal.
- Use uma alta sensibilidade arrefecida CCD da câmara, tal como uma câmera Clara Andor para maximizar a sensibilidade da imagem e minimizar o ruído de fundo.
- Para fluoróforos de cor única utilização do filtro de fluorescência padrão microscópio ajustado concebido para o comprimento de onda particular do fluoróforo. Para usar um padrão GCaMP GFP filtro definido optimizado para a excitação a 488 nm e emissão a 525 nm. Sem mais modificações ópticas são necessárias.
- Um filtro microscópio definido com 440 ± 20 nm filtro de excitação e 455 nm de comprimento passar espelho dicróico.
- Uma máscara colocada no plano da imagem inicial imediatamente fora do microscópio de imagem da porta (onde a câmera sensor CCD normalmente sentar). Isto restringe o campo de visão tal que irá preencher apenas metade do sensor da câmara. Colocando a máscara para os resultados de imagem primeiro plano na imagem fronteiras nítidas e sem sobreposição quando as duas imagens são projectadas lado-a-lado.
- A lente primeiro relé definir uma distância focal longe de tele plano de imagem inicial de tal forma que colima a luz.
- Um espelho dicróico que divide a luz em dois comprimentos de onda de imagem separados ou canais que reflectem uma cor (> 515 nm, amarela), enquanto que o outro transmissor (<515 nm, ciano).
- Filtros de emissões (filtros passa-banda) restringindo ainda mais a luz transmitida para os comprimentos de onda específicos de imagem (ciano de 485 ± 40 nm e amarelas em 535 ± 30 nm),
- A segunda lentes de retransmissão (uma para cada canal) colocados nos percursos dos feixes esses que reorienta a luz para um plano de imagem segundo a imagem da câmara CCD.
- Um par de espelhos e um espelho dicróico segunda dirige os percursos dos feixes de modo que as duas imagens e recombinadas são projectadas lado-a-lado sobre o sensor CCD da câmara. Figura 4A mostra um exemplo da imagem resultante.
- Alinhamento óptico inicial: Iniciar configuração e alinhamento da óptica com uma imag alto contrastee usando uma lente de ampliação baixa iluminação e da luz transmitida de campo amplo (a preto sharpie desenhada numa lâmina de microscópio funciona bem). Trazer a imagem para focar através das oculares de microscópio e em seguida comutado para a porta de microscópio para ser usado. Com iluminação de luz alta visualizar a imagem em um cartão de índice no plano inicial focal (alguns centímetros fora do porto microscópio). Posicionar a lente do primeiro relê (C) no caminho do feixe de forma que ele é uma distância focal a partir do plano focal inicial e colima a luz, enquanto não desviar o percurso do feixe (isto é, está directamente centrado no caminho do feixe). Coloque a máscara no primeiro plano focal, ajustados para restringir metade do campo de visão e produzir uma fronteira nítida na imagem. Posicionar os espelhos e filtros (D, E, G) de tal forma que o percurso do feixe permanece paralelo à superfície da mesa e é executado em dois caminhos paralelos lado a lado, como mostrado na Figura 1B. Centro das lentes de retransmissão segundo (F) nos seus respectivos percursos dos feixes emovê-los e para trás ao longo dos caminhos para levar as imagens para um foco em um cartão colocado foi o sensor CCD da câmera será. Se feito corretamente as duas imagens deve ser parfocal com as oculares de microscópio e portos outras câmaras. Finalmente coloque a câmera na posição e ajustar o alinhamento.
- Alinhamento Sintonia fina óptica: Use a imagem dupla visto pela câmera CCD para afinar o alinhamento óptico. Usar uma imagem de alto contraste e iniciar com menor ampliação, a mudança para uma ampliação maior para o alinhamento final. Posicionar a imagem transmitida (ciano canal na Figura 1B), para cobrir uma metade do campo da câmara de vista movendo a câmara na posição X e Y. da imagem reflectida (canal amarelo na Figura 1B), para cobrir a outra metade da área de ver, ajustando os últimos dois espelhos (G), no seu caminho do feixe. Optimizar concentrar movendo a lente segundo relê para cada canal e para trás ao longo do percurso de feixe. Se esquerdoconfiguração do inalterado óptico deve ser estável e só requer ajuste sintonia rara multa.
2. Preparação de amostras e Aquisição de Dados.
- Adquirir animais que expressam um fluoróforo de cálcio no neurônio sensível de interesse do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) ou de outras fontes. Animais transgénicos Alternativamente pode ser construído usando o padrão C. técnicas elegans. Expressão única célula não é necessária (e por vezes não é desejável se os neurónios são múltiplos a ser investigado, ver 12), desde que as imagens e as medições de várias células pode ser prontamente separados. Se o transgene fluoróforo não é integrado no genoma, uma variação significativa na expressão pode ocorrer de animal para animal. Neste caso, a pré-selecção de animais com níveis mais elevados de expressão, utilizando um microscópio de dissecação fluorescente aumenta a relação sinal-ruído e melhora as medições. Fluoróforo níveis de expressão need de ser suficiente para ser facilmente visualizado com a câmara sob os parâmetros de aquisição exigidos pela experiência.
- Fazer as almofadas de agarose necessários para a técnica de imobilização desejado (ver 2.3), pressionando uma pequena gota de agarose fundida entre duas lâminas de vidro espaçadas por dois pedaços de fita de laboratório. Se necessário, as almofadas de agarose podem ser transferidas para uma lamela de vidro antes da montagem dos animais. Veja a Figura 2.
- Imobilizar C. elegans para imagens utilizando uma das técnicas seguintes:
- Paralisação Farmacológica: Adicionar Levamisole 0,05% a almofadas de agarose (2% de mistura-o na agarose fundida, antes de fazer as almofadas em 2.2). Escolha 5-10 animais para a almofada e cobrir com uma lamela. Aplicar pequenas quantidades de mistura de cera quente (cera de parafina a 50% e 50% de vaselina), para os cantos da lâmina de cobertura para mantê-lo em posição. Permitir 5-10 minutos para o Levamisol para ter efeito e os animais para become completamente imóvel.
- Imobilização Agarose Stiff: C. elegans pode ser fisicamente imobilizado utilizando almofadas rígidas 10% de agarose e 0,05 uM nanopartículas de poliestireno diâmetro. Fazer almofadas de agarose a 10% (10% de agarose em tampão NGM em peso) como em 2.2. Adicionar ~ ul de solução de esferas 3 (1:10 microesferas de poliestireno em NGM por volume) para a parte superior da almofada. Rapidamente, escolha C. 5-10 elegans na piscina de solução de esferas na almofada e suavemente cubra com uma lamínula. Use cera fundida aplicada aos cantos da lâmina de cobertura para mantê-lo em posição. (Para detalhes adicionais sobre a técnica ver 7, bem como um artigo JoVE anterior 8)
- Colagem: C. elegans pode ser colada no local usando pequenas quantidades de adesivo de grau veterinária aplicada a um lado do animal.
- Dispositivos microfluídicos: Inúmeros dispositivos microfluídicos foram projetados para segurar fisicamente C. elegans no lugar para imagens.
- Coloque o slide preparado no microscópio e focar no neurônio desejado. É muitas vezes mais fácil de encontrar o C. elegans utilizando iluminação de campo claro e baixa ampliação. Em seguida, mudar para alta ampliação e imagens de fluorescência para encontrar e focar no neurônio específico.
- Estímulo: Se uma resposta neuronal a um estímulo específico for desejado (campo, luz eléctrica, sinais gustativos e olfactivos, temperatura, etc), o aparelho de estímulo devem ser concebidas para a instalação de microscópio, de tal forma que ele pode ser administrado aos animais no a preparação da amostra, enquanto imagens.
- Aquisição de imagens utilizando o microscópio câmera CCD. Os tempos de exposição e nível de luz de excitação depende do sinal de referência e o nível de expressão do fluoróforo, com sinais mais fracos que requerem tempos de exposição mais longos com resolução de tempo concordante menos. Normalmente usamos ~ 300 vezes a exposição ms.
- Adquirir imagens individualmente ou como um time-lapso filme. Porque C. neurônios elegans geralmente exibem dinâmica de ativação lenta (ou seja, eles não têm potencial de sódio base de ação), taxas de quadros relativamente lentos de ~ 1 seg são muitas vezes suficientes para medir neurônio dinâmica. Taxas de aquisição até ~ 90 quadros por segundo têm sido usados, embora estes possam ser limitado pelo tempo necessário para a integração de fluorescência fraca. Os filmes individuais de um único neurónio pode facilmente estender-se por alguns minutos (~ 5-10 min), ou mais se a preparação é estável e imobilização a taxa de quadros relativamente lenta.
3. Análise de Dados
- Há uma série de diferentes pacotes de imagens fluorescentes de software disponíveis com as capacidades de análise dinâmica e raciométrica incluindo ImageJ e NIS-Elements. Nós usamos um simples costume programa MATLAB, que mede a média do sinal fluorescente sobre uma região de interesse selecionada.
- Para imagens individuais (ou time-lapse filmes que permanecemperfeitamente imóvel) selecionar uma região de interesse (ROI) dentro do neurônio com imagens e uma região separada próxima para a medição de fundo. Para imagens raciométrica seleccionar ROI semelhante e as regiões de fundo para cada uma das imagens duplas.
- Ligeiro movimento do neurônio com imagens dentro de um filme de lapso de tempo requer uma análise adicional para selecionar automaticamente o ROI em cada quadro, o que pode ser feito usando esquemas de rastreamento inúmeros objetos. Nosso programa exibe uma imagem compactada de todas as imagens do filme a partir do qual um limite bruto (abrangendo o objeto de interesses em todos os quadros) é manualmente selecionados e uma região de fundo independente selecionada. Para o primeiro quadro, um ROI é manualmente selecionadas dentro da região de fronteira. Para cada quadro subsequente, o programa selecciona os pixels mais brilhantes de dentro da região de fronteira para gerar um ROI de tamanho correcto (isto é, o mesmo número de pixels, como o ROI armação manual do primeiro). Para imagens onde o object de interesses é suficientemente brilhante, então o fundo em torno na região de fronteira este protocolo seleciona um ROI razoável para cada quadro.
- O sinal de fluorescência, F, de cada quadro é calculado como a média de intensidade de pixel do ROI, menos a intensidade média da região do fundo. Os valores de medida proporcional são calculadas como a razão entre os dois sinais (YFP-YFP fundo) / (CFP-PCP fundo) -0,65. O factor de 0,65 compensa purga através do canal para o canal PCP YFP, que será dependente dos fluoróforos, bem como o conjunto de filtros particular usado (este valor é tipicamente ~ 0.6 para configurações cameleon).
- O nível de cálcio em relação a cada quadro é calculada como a percentagem de alteração na intensidade normalizada para um valor de linha de base inicial medido a partir do primeiro quadro (ou uma série de quadros): Af / F = (F (t)-F o) / F o, em que F (t) é a fluorescência no tempo t e o Fé o valor de referência inicial.
- A selecção do organismo ROI célula gera os sinais mais fortes mais robustas, mas também é possível seleccionar e medir os sinais a partir de uma ROI ao longo dos processos nervosos.
4. Resolução de Problemas
- Branqueamento: A exposição a luz de excitação pode causar descoloração do fluoróforo e é marcada por uma diminuição constante no sinal que é dependente do nível de exposição. Medições raciométrica ajudar a compensar esta situação. No entanto seletiva de branqueamento de um comprimento de onda ainda pode ocorrer (normalmente alvejantes PCP mais rápido, então YFP). Se ocorre branqueamento reduzir o nível de exposição à luz, reduzindo o tempo de exposição e / ou de intensidade de excitação (com filtros de densidade neutra na via de iluminação). Se necessário, pode-se compensar de branqueamento, executando testes simulados (com a mesma exposição excitação mas nenhum estímulo neuronal) e quantificando a constante de tempo de decaimento do sinal.
- C.. elegans responder à exposição à luz e estímulos experimentais, tornando-os mais susceptíveis de se mover, no momento da gravação. Ligeiro movimento pode introduzir ruído significativo na medição especialmente quando se mede a partir de processos de axônios. Análise raciométrica ajuda a minimizar estes efeitos, em certa medida e de medições a partir do corpo das células são mais robustas. Execução cuidadosa e refinamento dos procedimentos de imobilização irá resultar em animais completamente imóvel.
- Escolha do Fundo: A seleção cuidadosa de uma região de fundo é necessário para a análise de imagem de sucesso. Regiões fundo deve ser razoavelmente uniforme e mais escura, então o neurônio imagens. Deve ser suficientemente removidos para evitar a luz difusa (e, portanto, um captador de sinal) do neurónio imagens. Nós encontramos uma região uniforme 20-50 uM do ROI funciona bem na maior parte dos casos.
- Óptica raciométrica: O alinhamento correto da ótica de imagem é fundamental para a geração de uma imagem clara dupla. Anexos microscópio comerciais para imagiologia raciométrica estão disponíveis. Uma técnica alternativa é empregar imagiologia sequencial rápida utilizando uma roda de filtro rápido para rapidamente alternar entre comprimentos de onda de emissão durante a gravação de imagens separadas para cada um.
- Análise raciométrica: A análise aqui descrito é uma técnica relativamente simples que gera sinais robustos em virtude de uma média de mais de um ROI. Ele requer um objeto reconhecidamente brilhante para selecionar o ROI. Uma análise mais sofisticada raciométrica é possível alinhar com precisão e mapeamento das imagens duplas tais que a razão de fluorescência podem ser calculados pixel a pixel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aqui apresentamos os resultados de dois experimentos distintos. O primeiro utiliza GCaMP para medir a resposta de um neurónio sensorial específica a um estímulo externo definido, que dá um bom exemplo de como repórteres fluorescentes de cálcio pode ser utilizado para monitorizar a actividade neuronal opticamente em C. intacto elegans. O segundo emprega cameleon para medir a concentração de cálcio intracelular transiente provocado dentro de um neurónio, em resposta ao dano do laser específico, ilustrando assim como a fisiologia de cálcio podem ser medidos dentro de uma única célula in vivo. Para focalizar os aspectos técnicos de cada medição de resultados de ensaios individuais são apresentados e discutidos em detalhe. Muitas vezes, a resposta média ao longo do tempo (calculado como a resposta média em cada ponto de tempo em relação ao estímulo) ou uma métrica específica (como a amplitude média da resposta) são calculados através de vários testes. Tipicamente 10-20 ensaios são necessários para gerar uma medida média aceitável mas to seu número dependerá da variabilidade inerente da resposta. A análise de dados, tais para as experiências discutidas aqui podem ser encontrados em 12 e 13.
GCaMP medição das respostas sensoriais: quando submetido a um campo eléctrico forte externo (≥ 3 V / cm), C. elegans activamente rastejar para o pólo negativo do campo com o movimento dirigido preciso. Que anteriormente mostraram que este comportamento electrotactic é mediado principalmente pelos neurónios da esquerda e da direita, ASJ amphid neurónios sensoriais localizados na cabeça do animal 12. Para visualizar esta resposta foi utilizada uma cepa transgênica expressando GCaMP3 especificamente nos neurônios esquerdo e direito sob a ASJ-9 gpa promotor. Nós imobilizada animais para imagiologia utilizando almofadas de agarose contendo 0,05% de Levamisole ensanduichada entre duas folhas de cobertura (como descrito nos procedimentos). O estímulo elétrico foi administrada usando uma câmara de imagem personalizado construído que se encaixa napalco de um microscópio invertido Nikon Ti (ver 12). Em resumo, a preparação é colocada lamela (com o lado sem-fim para baixo) ao longo de um furo em uma pequena câmara de plástico que permite o acesso para os objectivos abaixo e padrão de imagem por meio da lâmina de cobertura. A câmara foi preenchida com 0,25 mM de NaCl e 50 mM de tampão de glicerol e o estímulo de campo eléctrico aplicado através de dois eléctrodos de platina que revestem as extremidades da câmara. Como descrito acima, um único neurónio ASJ expressando CGaMP foi fotografada utilizando um X100 1,4 NA objectiva de imersão em óleo e padrão GFP conjunto de filtros. Um filme de lapso de tempo foi adquirida por 80 seg (1 quadro / seg, o tempo de exposição 300 ms), enquanto submetendo o animal a um 3 V externa / centímetro campo eléctrico para três experiências separadas, cada uma com duração de 10 segundos (Figura 3). Medimos a intensidade de fluorescência para o corpo celular, utilizando a análise de imagem descrito acima. O vídeo mostra ligeiras falhas de tanto o movimento de deriva e de focagem ao longo do curso do experimento. O Strength do sinal mantém-se robusta GCaMP mostrando no entanto um grande aumento de ~ 250% de fluorescência em resposta a ambos os r 1 e 3 rd estímulos. O resultado dos estímulos segundo é substancialmente reduzida demonstrando variabilidade na resposta neuronal. Branqueamento é mínima, como é evidente pelo retorno a um nível de base consistente.
Cameleon medição da fisiologia celular de cálcio: lesão celular Traumático desencadeia uma grande cálcio transiente dentro de um neurônio que desempenha um papel essencial no destino resposta fisiológico ditando celular (ou seja, a morte celular versus início dos processos de reparação). Podemos medir esta resposta induzida por dano in vivo usando um laser para cortar femtosegundo C. indivíduo elegans neurônios 14, ao mesmo tempo medir sinais de cálcio celular usando cameleon YC3.60 13, 15. Animais expressando cameleon YC3.60 nos seis neurônios mecanosensorial (sob amec-4 promotor), foram imobilizadas usando 10% de agarose e as nanopartículas de poliestireno, tal como descrito nos procedimentos. Empregamos óptica de imagem dupla para gravar sinais de ambos os canais de PCP e YFP de fluorescência, tal como descrito nos procedimentos. Nós imaged um único neurónio e ALM alvejado laser do axónio ~ 20 um a partir do corpo celular (Figura 4A). O axônio foi cortada por uma exposição (<1 seg) breve a luz de um laser infravermelho pulsado de femtosegundos focada no ponto-alvo ao longo do axônio pelo objectivo de imagem (ver 13 para obter detalhes sobre a cirurgia a laser). Lapso de tempo imagens em um quadro a cada 3 seg, com 400 ms tempos de exposição foram registrados por 320 segundos ao realizar a cirurgia a laser e os níveis de cálcio calculados usando análise proporcional.
Os sinais foram medidos de forma independente para o corpo da célula (Figura 4B) e para o segmento axonal dentro de 5 mm do ponto de corte (Figura 4C). Os números mostram o CFP e intensidades YFP, assim como a proporção resultantes FRET. A medição no corpo da célula é bem comportada com a PCP a diminuir rapidamente e o aumento da YFP em resposta ao dano do laser em t = 0 seg (seta vermelha). Isso resulta em um aumento imediato ~ 200% no sinal raciométrica (Af / F), que é sustentado por ~ 90 segundos antes de cair de volta aos níveis basais próximo. O branqueamento é mínima, como é evidente a partir da linha de base consistente.
No segmento axonal próximo do ponto de corte, a quantidade de locais fluoróforo varia ao longo do curso da experiência, o que complica o sinal. A cirurgia a laser rompe o axônio e brevemente rompe a membrana, permitindo fluoróforo para escapar e, temporariamente, reduzir sua concentração local citoplasmática. Isto é evidente a partir de uma diminuição inicial no rastreamento YFP na Figura 4C e uma comparação entre o segmento axonal próximo do ponto de avaria nas imagens YFP nos tempos t = 0 e t = seg 6 seg, a Figura 4A. Em Lapontos de tempo ter, no final cortada incha como parte da sua recuperação contínua, resultando em mais do fluoróforo localizada e um aumento na intensidade. Isto é mais evidente no rastreamento aumentando lentamente PCP na Figura 4C e uma comparação entre o segmento axonal em imagens da PCP em tempos t = 0 seg e t = 270 segundos, a Figura 4A. No entanto, essas variações afetam igualmente ambos os canais ea relação FRET efetivamente compensa. A medição resultante mostra uma resposta semelhante à do corpo da célula, com um aumento imediato ~ 150% em sinal (Af / F), uma linha de base para a recuperação dramática perto a ~ 90 seg e em seguida, uma menor resposta secundária adicional em ~ 150 seg. A análise raciométrica é crítico para esta medição, uma vez que seria muito difícil de separar o sinal de cálcio a partir dos outros efeitos, que pode variar amplamente entre os neurônios e cirurgia para a cirurgia. O sinal de axónio tem mais ruído comparado com o sinal do corpo da célula, principalmente devido à fluorescência e dimmero menor ROI no estreito axônio.
Figura 1. Configuração básica e óptica proporcional. A) A fotografia mostra a montagem experimental consistindo de um microscópio invertido e composto óptica de imagem raciométrica. B) A diagrama esquemático que ilustra o sistema óptico de imagem necessários para os raciométrica FRET baseadas em medições. A imagem é dividida em dois comprimentos de onda ou canais, que se projectam do lado-a-lado na matriz CCD.
Figura 2. Preparação de amostras. C. elegans estão montadas em almofadas finas de agarose para imagiologia. A pastilhas) de agarose são feitos por ensanduichamento de uma pequena gota deagarose fundida entre duas lâminas de microscópio espaçadas por dois pedaços de fita de laboratório. B) Os animais são transferidos para a almofada de agarose e coberta com uma lamela, mantida no lugar por uma pequena quantidade de cera, em cada um dos quatro cantos.
Figura 3. Dados de exemplo GCaMP. O sinal GCaMP, Af / F, gravado in vivo a partir do corpo celular do neurónio ASJ respondendo a uma alternância de ligar / desligar do campo eléctrico (verde traço). Linhas grossas a cinzento indicam os períodos em que o campo eléctrico externo (3 V / cm) foi aplicado ao animal. Barra de escala representa 100% de aumento em intensidade de fluorescência.
Figura 4. Dados de exemplo Cameleon. A) Três quadros separados mostrando a imagem duplaver de um neurónio ALM antes e após a cirurgia a laser dos 20 uM de axónios de células do corpo. A seta vermelha no painel do meio indica o ponto de corte. O painel inferior mostra o corpo da célula e do segmento axonal produzir os sinais em B e C. B) O cameleon YC3.60 sinal medido no corpo celular do neurónio ALM antes e após a cirurgia a laser (seta vermelha). C) O YC3 cameleon 0,60 sinal medido no segmento axonal dentro de 5 mm do ponto de corte, antes e após a cirurgia a laser. Traços amarelos indicam sinais YFP, traços azuis indicam sinais de PCP e traços de laranja são a resultante FRET relação. Todos os horários são relativos ao tempo de cirurgia a laser. Barras de escala representam um aumento de 100% na intensidade de fluorescência. Clique aqui para ver maior figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indicadores de cálcio geneticamente codificados têm sido amplamente utilizados em C. elegans neurobiologia. Numerosos grupos têm utilizado as técnicas para estudar a resposta de neurónios sensoriais primários a estímulos externos, como aqui demonstrado com a resposta ASJ a um campo eléctrico. Exemplos proeminentes incluem sensação de toque mecânico, produtos químicos específicos, temperatura e um campo elétrico 12, 16-19. Actividade de células do músculo interneurônio e também foram monitorizadas tanto em resposta a estímulos e no controlo do comportamento animal. Muitos destes estudos levaram estas técnicas um passo adiante usando reconhecimento de imagem e técnicas de rastreamento para permitir a gravação de neurônios em animais parcialmente restringido ou mesmo movimentando-se livremente, bem como a gravação de neurônios simultaneamente. Estudos adicionais têm investigado os outros aspectos da fisiologia do cálcio, tais como a resposta ao dano neuronal 13, 20, tal como aqui apresentado, bem comodegeneração neuronal em escalas de tempo mais longos 21.
Na concepção de um experimento em particular, cada um dos repórteres sobre técnicas alternativas de cálcio comumente usados e de imobilização animal deve ser cuidadosamente considerada. Técnicas de imobilização será ditada pelos aspectos técnicos, tais como a necessidade de ter acesso físico ao animal, a capacidade de recuperação dos animais sequência de imagens ou a necessidade de um rendimento elevado. Diferentes repórteres fluorescentes de cálcio tem vantagens e desvantagens específicas também. GCaMP emprega análise de imagem simples único canal e a razão sinal-para-ruído elevado faz com que seja aplicável a muitas situações. Cameleon por outro lado, exige uma imagem mais complexa e de análise, mas a medição resultante raciométrica pode ser crítico em situações com artefactos potencialmente grandes. Por exemplo, as flutuações na quantidade de fluoróforo (tal como no exemplo danos laser) também pode ocorrer ao longo de períodos de tempo longos(Horas) devido a alterações nos níveis de expressão. Estratégias adicionais de imagem dupla também são possíveis, tais como GCaMP co-expressa com (ou fisicamente ligado a) um fluoróforo RFP. Embora não FRET baseada esta possa tirar proveito de uma vasta gama dinâmica de variantes GCaMP modernas durante a utilização do canal de vermelho, como uma medição de linha de base de tempo real.
É importante notar que, de dois canais numerosos sistemas de imagem de microscópio e software de análise encontram-se comercialmente disponíveis, que, enquanto que muitas vezes mais caro, pode ser atractivo para os investigadores relutantes para construir o sistema de casa construída descrito aqui. Comerciais sistemas de imagem dupla (DualView2-DV2, Fotometria) normalmente usam óptica semelhantes ao nosso sistema de casa construída, mas estão contidas dentro de um anexo de microscópio único com procedimentos de alinhamento padronizados. Como alternativa, rápida troca de filtro de sistemas (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) permitir imagens em tempo real, rápida seqüencial de dois canais de cor wiThout óptica de imagem adicionais, mas também são caros e requerem a sincronização exacta entre o filtro de troca e aquisição câmara.
Em resumo, C. elegans apresenta uma série de vantagens como um sistema de imagem in vivo. Os fluoróforos geneticamente codificados são geralmente célula específica e pode eliminar a necessidade de uma injecção ou administração de fluoróforos exógenos. C. elegans acessibilidade óptico permite imagens em animais intactos, que são fáceis e de baixo custo para manter, não exigem dissecção complicado ou cultura neuronal e preservar a fisiologia celular. Além disso, o C. elegans tem grandes capacidades para análise genética com um grande número de reagentes disponíveis genéticos e técnicas bem estabelecidas. Existem desvantagens do curso para o sistema, a principal preocupação, talvez, sendo que se trata de um invertebrado. Além disso, os fluoróforos relatam mudanças relativas na concentração de cálcio rather do que um valor absoluto e a resolução de tempo de medições pode ser restringida por ambas as dinâmicas do fluoróforo mas também os tempos de integração necessários de fracos sinais de fluorescência. Finalmente, enquanto que o cálcio é uma parte integrante da actividade neuronal e sinalização dos fluoróforos não directamente relatar o potencial de tensão de membrana, como medido utilizando técnicas electrofisiológicas. No entanto ilustrados pelos procedimentos aqui apresentados, C. elegans é um atrativo, relativamente simples, sistema de custo-benefício para uma ampla gama de estudos de imagem neuronais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Várias pessoas contribuíram para o trabalho descrito neste artigo. CVG construiu a configuração experimental, e LS, SHC, e CVG realizados os experimentos. CVG e SHC escreveu o manuscrito. Todos os autores posteriormente participou no processo de revisão e aprovou a versão final do manuscrito. Agradecemos Paulo Sternberg para a cepa GCaMP. Algumas cepas de nematóides utilizados neste trabalho foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que é financiado pelo NIH National Center for Research Resources (NCRR). O programa de análise de imagem MATLAB foi adaptada da utilizada no 18. Os autores foram apoiados pela Boston University e do Massachusetts Life Sciences Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3'X3' optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , The C. elegans Reseach Community. (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , The C. elegans Reseach Community. (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
