In vivo Neuronal Kalsium Imaging i C. elegans

Summary

Med sin lille transparent kropp, veldokumentert nevroanatomi og en rekke mottagelig genetiske teknikker og reagenser,

Abstract

Hvalkveisen ormen C. elegans er en ideell modell organisme for relativt enkel, rimelig neuronal bildebehandling in vivo. Sine små transparent kropp og enkel, tillater godt karakterisert nervesystemet identifikasjon og fluorescens bildebehandling av enhver Nevron innenfor intakt dyret. Enkle immobilisering teknikker med minimal innvirkning på dyrets fysiologi gir ekstra time-lapse imaging. Utviklingen av genetisk kodede kalsium sensitive fluoroforer som Cameleon ¹ og GCaMP ² tillater in vivo avbildning av neuronal kalsium knyttet både celle fysiologi og neuronal aktivitet. Tallrike transgene stammer som uttrykker disse fluoroforer i bestemte nevroner er lett tilgjengelig eller kan bli konstruert ved hjelp av veletablerte teknikker. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for måling kalsium dynamikk innenfor en enkelt nervecelle i vivo ved hjelp av både GCaMP og Cameleon. Vi diskuterer fordeler og disadvantalderen både samt ulike metoder for prøveopparbeidelse (dyr immobilisering) og bildeanalyse. Endelig, presenterer vi resultater fra to eksperimenter: 1) Ved hjelp av GCaMP å måle sensorisk responsen for en spesifikk nervecelle til en ekstern elektrisk felt og 2) Bruk Cameleon å måle den fysiologiske kalsium respons av en nervecelle til traumatisk laser skade. Kalsium imaging teknikker som disse er brukt mye i C. elegans og har blitt utvidet til målinger i fritt bevegelige dyr, flere nevroner samtidig og sammenligning på tvers av genetiske bakgrunn. C. elegans presenterer en robust og fleksibelt system for in vivo neuronal avbildning med fordeler fremfor andre modellsystemer i teknisk enkelhet og kostnadseffektivitet.

Introduction

Her presenterer vi praktiske metoder for in vivo kalsium bildebehandling i C. elegans nerveceller. Utviklingen av genetisk kodede kalsium-sensitive fluoroforer med høyt signal-til-støy-forhold gjør C. elegans en forholdsvis grei og kostnadseffektivt system for måling av nevrofysiologi og aktivitet. Vår bildebehandling er gjort med en standard forbindelse mikroskop med wide-feltet fluorescens avbildning av lett tilgjengelige fluoroforer. Vi presenterer flere teknikker ansette ulike fluoroforer og ulike eksempler preparater, diskutere styrker og svakheter ved hver. Data blir deretter presentert fra to eksempel eksperimenter. En utmerket ytterligere ressurs på teknikkene som er beskrevet her kan bli funnet i WormBook, "Imaging aktiviteten av nevroner og muskler" av R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

To store klasser av genetisktisk kodet fluorescerende kalsium journalister er ofte brukt i C. elegans: enkelt kanal GCaMP og FRET-baserte Cameleon. Vi vil beskrive metoder og vise eksempler for data generert av hver.

GCaMP er basert på en modifisert grønt fluorescerende protein (GFP) som er følsom for den omgivende kalsiumkonsentrasjon. Dette oppnås ved fusjon av GFP og den høye kalsium affinitet protein kalmodulin, slik at bindingen av kalsium ved kalmodulin bringer GFP molekylet til en effektiv fluorescerende bekreftelse ^2. De siste fremskritt i disse fluoroforer generere eksepsjonell signal størrelse med opptil 500% økning i fluorescens intensitet over en fysiologisk spekter av kalsium og rimelig rask kinetikk ~ 95 msek økning tid og ~ 650 msek desintegrasjonstid ^4. Over relativt korte tidsperioder (minutter), kan disse store signaler tillate lavere oppløsning imaging (lavere forstørrelse), og gitt en veloppdragen initial baseline måling, negere nødvendigheten for kontinuerlig baseline eller komparative målinger.

Cameleon har fordelen av å være en FRET-basert fluorofor som genererer en Proporsjonal måling sammenligner to uavhengige kanaler eller bølgelengder ^1. Den består av to separate fluoroforer (cyan-og gul-utslipp selvlysende proteiner, CFP og YFP) forbundet med en calmodulin protein. Komplekset er belyst med blått lys (440 nm) som interesserer CFP. Bindingen av kalsium bringer fluoroforer tettere sammen, øker fluorescens resonans energi overføring (FRET) fra CFP (donor) til YFP (akseptorfasen) og forårsaker CFP utslipp (480 nm) for å redusere og YFP utslipp (535 nm) for å øke . Relative kalsiumnivåer måles som forholdet mellom den YFP / CFP intensitet. Cameleon kinetikk er tregere enn GCaMP, målt in vivo for å ha en stigningstid på ~ 1 sekund og en desintegrasjonstid på ~ 3 sek ^5. Imidlertidforholdet motsatt bevegelige signaler øker signalet størrelse og kompenserer for en rekke mulige artefakter som skyldes endringer i fluorofor konsentrasjon, bevegelse eller fokus avdrift og bleking.

Genetisk kodet fluorescerende reportere negere mye av prøveopparbeidelse nødvendig med eksogent administrert prober og C. elegans liten gjennomsiktig kroppen tillater bildebehandling i intakt dyret ved hjelp av enkle bredt felt fluorescens. De viktigste tekniske utfordringen i prøveopparbeidelse er derfor å trygt immobilisere dyrene. Det finnes en rekke forskjellige brukte teknikker hver med fordeler og ulemper. Ved hjelp av en farmakologisk middel å lamme dyrene er lett å implementere og tillater montering av flere dyr på en prepareringsåpning (Levamisole, et kolinerg agonist som forårsaker muskelvev å gripe brukes typisk ^6). C. elegans kan også være fysisk immobilisert ved monterer dempå stiv 10% ^{7 agarose, 8.} Dette minimerer tyngre dyrefysiologi, tillater langvarig imaging (timer) og gjenvinning av flere dyr, men er mer teknisk vanskelig. Begge disse teknikkene begrense fysisk tilgang til dyrene (som er under et dekkglass) og kan derfor bare brukes med visse eksperimentelle stimuli (slik som lys, temperatur, elektrisk felt eller laser skade). For stimuli der fysisk tilgang kreves, for eksempel berøring eller administrasjon av kjemikalier, har mange studier hell limt C. elegans på plass (med veterinær klasse lim) ^9. Dette er teknisk mer krevende, er et enkelt dyr forberedelse og tillater ikke dyr utvinning. Endelig har mange microfluidic enheter vært ansatt som fysisk begrense C. elegans, kan bevare dyr fysiologi, slik eksponering for de fleste typer stimuli (avhengig av enheten design) og muliggjøre rask utveksling og gjenvinning av dyrene

Metodene som presenteres her kan brukes til å måle neuronal aktivitet og cellefysiologi i C. elegans. Vi gir et eksempel på hver: bruke GCaMP å måle den sensoriske respons av ASJ nervecelle til en ekstern elektrisk felt, og bruke Cameleon å måle den fysiologiske kalsium respons laser skade av et nevron. Disse eksempler viser de fordeler og ulemper ved de to typene fluoroforer og illustrere hva som er mulig med systemet.

Protocol

1. Optisk oppsett

1. Bruk en standard forbindelse mikroskop med epifluorescence imaging evner. Vi bruker et Nikon Eclipse Ti-U invertert mikroskop med en Intensilight HG Illuminator.
2. For beste bilde og signalkvalitet bruke en høy forstørrelse, høy numerisk apertur mål. Vi bruker vanligvis en Nikon X60 1,4 NA neddyppingsobjektivet. I noen tilfeller er det mulig å bruke lavere forstørrelse (X40, X20) avhengig ekspresjon nivå av fluoroforen og signalstyrke.
3. Bruk en høy følsomhet avkjølt CCD-kamera, for eksempel en Andor Clara Kamera å maksimere image følsomhet og minimere bakgrunnsstøy.
4. For ensfargede fluoroforer bruke standard mikroskop fluorescens filtersettet utformet for den spesielle bølgelengden til fluoroforen. For GCaMP bruke en standard GFP filter satt optimalisert for eksitasjon ved 488 nm og utslipp på 525 nm. Ingen ytterligere optiske modifikasjoner er nødvendig.
Figur 1. Den består av:
1. Et mikroskop filter sett med 440 ± 20 nm eksitasjon filter og 455 nm lange passere dichroic speil.
2. Et bilde maske plassert på innledende bildeplan umiddelbart utenfor mikroskopet bildebehandling porten (hvor kameraet CCD-sensor ville vanligvis sitter). Dette begrenser synsfeltet slik at den vil fylle bare halvparten av kameraets sensor. Plassere denne masken ved første bildeplan gir skarpe bilde grenser og ingen overlapping når de to bilder projiseres side-ved-side.
3. Den første relé objektiv innstilt en brennvidde unna than innledende bildeplan slik at det collimates lyset.
4. En dichroic speil som splitter lyset inn i to separate bildebehandling bølgelengder eller kanaler som reflekterer en farge (> 515 nm, gul) under sending den andre (<515 nm, cyan).
5. Emission filtre (båndpassfiltre) ytterligere begrenser det overførte lys til de spesifikke bildedannende bølgelengder (cyan på 485 ± 40 nm og gult 535 ± 30 nm),
6. De andre relé linser (en for hver kanal) plassert i bjelkeelementene baner slik at det refocuses lyset til et andre bildeplan i CCD-kamera.
7. Et par av speil og et andre dikroisk speil dirigerer bjelkeelementene baner slik at de to bildene rekombinert og projiseres side-ved-side på kameraet CCD-sensor. Fig. 4A viser et eksempel på det resulterende bildet.
5. Initial optisk justering: Start oppsett og justering av optikken med høy kontrast image med en lav forstørrelse linse og overføres brede felt lys belysning (en svart Sharpie trukket på et objektglass fungerer bra). Bring bilde å fokusere gjennom mikroskopet okulars og deretter byttet til mikroskopet porten som skal brukes. Med høy lys belysning vise bildet på en indeks kortet på den første fokusplan (noen cm utenfor mikroskop port). Plassere den første relé linse (C) i strålebanen slik at det er en brennvidde fra innledende fokalplan og collimates lyset mens ikke deflecting strålebanen (dvs. er direkte sentrert i strålebanen). Plasser masken ved første fokalplan, justeres for å begrense halve synsfelt og lage et skarpt boarder i bildet. Plasser speilene og filtre (D, E, G), slik at strålebanen forblir parallelt bordflaten og kjører i to parallelle spor side-ved-side, som vist i figur 1B. Sentrer andre stafetten linser (F) i sine respektive stråle stier ogflytte dem frem og tilbake langs stier å bringe bildene til et fokus på en indeks kortet plassert var kameraet CCD sensor vil bli. Hvis det gjøres riktig de to bildene skal være parfocal med mikroskop okulars og andre kamera porter. Endelig plassere kameraet i posisjon og finjustere justering.
6. Fin innstilling optisk justering: Bruk Dual Image sett av CCD-kamera for å finjustere den optiske justeringen. Bruk høy kontrast og starte med lavere forstørrelse, bytte til høyere forstørrelse for endelig justering. Plasser overførte bildet (cyan kanal i figur 1B) for å dekke den ene halvdelen av kameraets synsfelt ved å flytte kameraet i X og Y. Plasser Speilbildet (gul kanal i figur 1B) for å dekke den andre halvparten av feltet av vis ved å justere de to siste speil (G) i sin strålebanen. Optimaliser fokusere ved flytte andre relé linsen for hver kanal frem og tilbake langs strålebanen. Hvis venstreuendret den optiske oppsettet skal være stabil og krever bare sjelden finjustere justering.

2. Prøveopparbeidelse og Data Acquisition.

1. Erverve dyr uttrykker en kalsium sensitiv fluoroforen i nervecellen interesse fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) eller andre kilder. Alternativt transgene dyr kan være konstruert ved hjelp av standard C. elegans teknikker. Enkelt celle uttrykk er ikke nødvendig (og noen ganger ikke ønskelig hvis flere neurons skal undersøkes, se ^12), så lenge som bilder og målinger fra flere celler kan lett skilles. Hvis fluoroforen transgenet ikke er integrert i genomet, kan betydelig variasjon i uttrykket oppstå fra dyr til dyr. I dette tilfellet, preselecting dyr med høyere ekspresjonsnivåer ved hjelp av en fluorescerende disseksjonsmikroskop øker signal-til-støy-forhold og forbedrer målingene. Fluoroforen uttrykk nivåer need å være tilstrekkelig til å være lett avbildet med kameraet Overtagelsen parametere som kreves i eksperimentet.
2. Gjør agarose pads kreves for ønsket immobilisering teknikken (se 2.3 nedenfor) ved å trykke en liten dråpe av smeltet agarose mellom to glassplater adskilt av to stykker av laboratoriet tape. Om nødvendig, kan agarose elektrodene overføres til et glass dekkglass før montering dyrene. Se figur 2.
3. Immobilize C. elegans for bildebehandling ved hjelp av en av følgende teknikker:
   1. Farmakologisk Paralyzation: Legg 0,05% Levamisole til 2% agarose pads (blande det inn den smeltede agarose før putene i 2.2). Plukk 5-10 dyr på puten og dekk med et dekkglass. Påfør små mengder varm voks blandingen (50% parafinvoks og 50% vaselin) hjørnene på dekkglass for å holde det i posisjon. Tillat 5-10 min for Levamisole skal tre i kraft, og dyrene til become helt stille.
   2. Stiff Agarose Immobilisering: C. elegans kan være fysisk immobilisert med stive 10% agarose pads og 0,05 mikrometer diameter polystyren nanopartikler. Gjøre 10% agarose pads (10% agarose i NGM buffer ved vekt) som i 2.2. Legg ~ 3 pl limstrengen løsning (01:10 polystyren mikrosfærer i NGM volumdeler) til toppen av puten. Raskt, plukke 5-10 C. elegans i bassenget av perle løsning på puten og forsiktig dekke med lokk. Bruk smeltede voks påføres hjørnene på dekkglass for å holde det i posisjon. (For flere detaljer om denne teknikken se ⁷ samt en tidligere Jove artikkel ⁸⁾
   3. Liming: C. elegans kan limes på plass ved hjelp av små mengder av veterinær klasse limet påføres en side av dyret.
   4. Microfluidic enheter: Mange microfluidic enheter har blitt designet for å fysisk holde C. elegans på plass for bildebehandling.
   </ Li>
4. Plasser forberedt lysbildet på mikroskopet og fokus på ønsket neuron. Det er ofte lettest å finne C. elegans med lyse feltet belysning og lav forstørrelse. Deretter bytte til stor forstørrelse og fluorescens bildebehandling for å finne og fokusere på spesifikke neuron.
5. Stimulus: Hvis en nerveaktivitet ved en spesifikk stimulus ønskes (lys, elektrisk felt, gustatory og olfactory signaler, temperatur etc.), må stimulus anordningen være utformet i mikroskopet oppsett, slik at det kan bli administrert til dyrene i prøveopparbeidelse mens bildebehandling.
6. Hente bilder ved hjelp av mikroskop CCD-kamera. Eksponeringstider og eksitasjon lysnivå vil avhenge referansebanen signalet og i nivået av fluoroforen, med svakere signaler krever lengre eksponeringstider med concordantly mindre tidsoppløsning. Vi bruker vanligvis ~ 300 msek eksponeringstider.
7. Hente bilder enten individuelt eller som en time-lapse film. Fordi C. elegans nevroner generelt vise langsomme aktivering dynamikk (dvs. de mangler natrium baserte aksjonspotensialer), relativt treg bildefrekvens på ~ 1 sek er ofte tilstrekkelig til å måle Nevron dynamikk. Oppkjøp på opptil ~ 90 bilder per sekund er blitt brukt, selv om disse kan være begrenset av integrering tiden som er nødvendig for svak fluorescens. Individuelle filmer av en enkelt nervecelle kan enkelt utvide i flere minutter (~ 5-10 min) eller lengre hvis immobilisering produktet er stabilt og bildefrekvens relativt treg.

3. Dataanalyse

1. Det finnes en rekke ulike fluorescerende imaging programvarepakker tilgjengelig med dynamiske og Proporsjonal analyse inkludert ImageJ og NIS-Elements. Vi bruker et enkelt tilpasset MATLAB program som måler den gjennomsnittlige fluorescerende signal over en valgt region av interesse.
2. For enkelte bilder (eller time-lapse filmer som gjenstårhelt stille) velg en region av interesse (ROI) i den avbildede nevron og en egen nærliggende regionen for bakgrunnen målingen. For Proporsjonal bilder velger lignende ROI og bakgrunn regioner for hver av de to bildene.
3. Liten bevegelse av den avbildede nervecellen innen en time-lapse film krever ytterligere analyse for å automatisk velge den ROI i hver ramme, noe som kan oppnås ved hjelp tallrike objekt sporing ordninger. Vårt program viser et komprimert bilde av alle bildene i filmen som en grov grense (omfatter gjenstand for interesse i alle rammer) er manuelt valgt og en uavhengig bakgrunn region valgt. For den første rammen, blir en ROI manuelt valgt fra innenfor grensen regionen. For hvert påfølgende ramme, velger programmet de smarteste piksler fra innenfor grensen regionen for å generere en avkastning i riktig størrelse (dvs. samme antall piksler som den manuelle første rammen ROI). For bilder hvor målsettingert av interesser er tilstrekkelig lysere da de omkringliggende bakgrunnen innenfor grensen regionen denne protokollen velger en rimelig avkastning for hver ramme.
4. Den fluorescerende signal, F, for hver ramme er beregnet som den gjennomsnittlige pikselintensiteten i ROI minus gjennomsnittlig intensitet i bakgrunnen regionen. Proporsjonal beregnes som forholdet mellom de to signalene (YFP-YFP _bakgrunn) / (CFP-CFP _bakgrunn) -0,65. En faktor på 0,65 kompenserer for utfalling gjennom i CFP kanal inn i den YFP kanalen, som vil være avhengig av at fluoroforer samt bestemt filter som brukes (denne verdien er typisk ~ 0,6 for Cameleon oppsett).
5. Det relative kalsium nivået for hver ramme er beregnet som den prosentvise endring i intensitet normalisert til en initial grunnverdi målt fra den første ramme (eller serie av rammer): Af / F = (f (t)-F _o) / F _o, hvor F (t) er fluorescensen på tidspunktet t og K _oer den første grunnverdier.
6. En ROI markere cellen kroppen genererer de sterkeste mest robuste signaler, men det er også mulig å velge og måle-signaler fra en ROI langs nerve prosesser.

4. Problemløsning

1. Bleking: Eksponering for eksitasjon lys kan føre til bleking av fluoroforen og er preget av en jevn nedgang i signal som er avhengig av eksponeringsnivåer. Proporsjonal målinger bidra til å kompensere for dette. Men selektiv bleking av én bølgelengde kan fortsatt skje (vanligvis CFP blekemidler raskere deretter YFP). Hvis bleking oppstår redusere lyset eksponeringsnivået ved å redusere eksponering ganger og / eller eksitasjon intensitet (med nøytral tetthet filtre i belysning sti). Om nødvendig, kan en kompensere for bleking ved å kjøre mock studier (med samme magnetisering eksponering men ingen neuronal stimulus) og kvantifisering tidskonstanten av signal forfall.
2. C.. elegans svare lyseksponering og eksperimentelle stimuli, noe som gjør dem mest sannsynlig å flytte ved opptaket. Liten bevegelse kan introdusere betydelig støy i målingen, spesielt når du måler fra axon prosesser. Proporsjonal analyse bidrar til å motvirke disse effektene til en viss grad og målinger fra cellen kroppen er mer robust. Forsiktig gjennomføring og videreutvikling av immobilisering prosedyrer vil resultere i helt stille dyr.
3. Bakgrunn Selection: Nøye seleksjon av en bakgrunn region er nødvendig for vellykket bildeanalyse. Bakgrunn regioner bør være rimelig ensartet og mørkere da den avbildede neuron. Det må være tilstrekkelig fjernet for å unngå strølys (og dermed pickup et signal) fra den avbildede neuron. Vi finner en enhetlig region 20-50 mikrometer fra ROI fungerer godt i de fleste tilfeller.
4. Proporsjonal Optikk: Riktig justering av imaging optikk er kritisk for å generere et klart dual bilde. Kommersielle mikroskop vedlegg for Proporsjonal bildebehandling er tilgjengelig. En alternativ teknikk er å ansette rask sekvensiell avbildning ved hjelp av en rask filter hjulet til raskt bytte mellom utslipp bølgelengder under opptak separate bilder for hver.
5. Proporsjonal Analyse: Analysen beskrevet her er en relativt enkel teknikk som genererer robuste signaler i kraft av gjennomsnitt over en ROI. Det krever en recognizably lysende objekt for å velge ROI. Mer sofistikert Proporsjonal analyse er mulig ved nettopp å samkjøre og kartlegge de doble bildene slik at det fluorescerende forholdet kan beregnes piksel for piksel.

Representative Results

Her presenterer vi resultater fra to separate eksperimenter. Den første benytter GCaMP å måle responsen av en spesifikk sensorisk nevron til en definert ytre stimuli, noe som gir et godt eksempel på hvordan fluorescerende kalsium reportere kan brukes til optisk overvåke neuronal aktivitet i intakte C. elegans. Den andre benytter Cameleon å måle intracellulær kalsium forbigående utløst innenfor et nevron i respons til spesifikke laser skade, og dermed viser hvordan kalsium fysiologi kan måles innenfor en enkelt celle in vivo. Å fokusere på de tekniske aspektene ved hver måling individuell prøve resultater presenteres og diskuteres i detalj. Ofte gjennomsnittlig respons over tid (beregnet som den gjennomsnittlige respons ved hvert tidspunkt med hensyn til stimulus) eller en bestemt beregning (eksempel gjennomsnittlige amplitude av responsen) beregnes over mange forsøk. Typisk 10-20 studier er nødvendig for å generere et akseptabelt gjennomsnittlig måling men thans tall vil avhenge i iboende variabilitet av responsen. Slike data-analyse for de eksperimentene diskutert her kan finnes i ¹² og ^13.

GCaMP måling av sensorisk respons: Når utsatt for en sterk ekstern elektrisk felt (≥ 3 V / cm), C. elegans aktivt krype mot minuspolen av feltet med presise rettet bevegelse. Vi tidligere viste at denne electrotactic atferd er hovedsak mediert av de venstre og høyre asj nevroner, amphid sensoriske nevroner lokalisert i dyrets hode ^12. For å visualisere dette svaret vi brukte en transgen belastning uttrykker GCaMP3 spesielt i venstre og høyre ASJ nevroner under GPA-9 promoter. Vi immobilized dyr for avbildning ved hjelp av agarose pads inneholder 0,05% Levamisole klemt mellom to dekkglass (som beskrevet i de prosedyrer). Den elektriske stimulus ble administrert ved hjelp av en tilpasset bygget bildebehandling kammer som passer påstadium av en invertert Nikon Ti mikroskop (se ^12). I korte trekk, blir dekkglass preparatet plassert (med ormen ned) over et hull i en liten plastkammer gir tilgang for målene nedenfra og standard avbildning gjennom dekkglass. Kammeret ble fylt med 0,25 mM NaCl og 50 mM glycerol buffer og det elektriske felt stimulus påføres med to platina elektroder lining endene av kammeret. Som beskrevet ovenfor, et enkelt ASJ neuron uttrykke CGaMP ble fotografert med en X100 1,4 NA neddyppingsobjektivet og standard GFP filter sett. En film med tidsforsinkelse ble kjøpt for 80 sek (en ramme / sek, 300 msek eksponeringstid), mens underkaste dyret til en ekstern 3 V / cm elektrisk felt for tre separate forsøk hver varer 10 sek (figur 3). Vi målt fluorescensintensitet på cellen kroppen bruker bildeanalyse beskrevet ovenfor. Videoen viser små feil av både bevegelse og fokus drift i løpet av eksperimentet. Strength av GCaMP signalet forblir robust men viser stor ~ 250% økning i fluorescens i respons til både ^1. og 3 ^rd stimuli. Resultatet fra andre stimuli er vesentlig redusert demonstrere variabiliteten i nerveaktivitet. Bleking er minimal som tydelig av avkastningen til en konsistent baseline nivå.

Cameleon måling av mobilnettet kalsium fysiologi: Traumatisk mobilnettet skade utløser et stort kalsium forbigående innenfor et nevron som spiller en viktig rolle i den fysiologiske responsen dikterer cellular skjebne (dvs. celledød vs oppstart av reparasjonsprosesser). Vi kan måle denne skaden-indusert respons in vivo ved hjelp av en femtosecond laser for å bryte enkelte C. elegans nevroner ¹⁴ samtidig måle mobilnettet kalsium signaler ved hjelp Cameleon YC3.60 ^{13, 15.} Dyr uttrykker Cameleon YC3.60 i de seks mechanosensory nevroner (underMEC-4 promoter), ble immobilisert ved anvendelse av 10% agarose og polystyren nanopartikler som beskrevet i fremgangsmåtene. Vi ansatt to bildebehandling optikk for å ta opp signaler fra både CFP og YFP fluorescens-kanaler som beskrevet i prosedyrene. Vi avbildes en enkelt ALM nevroner og laser målrettet axon ~ 20 mikrometer fra cellen kroppen (figur 4A). Axon ble kuttet med en kort (<1 sek) eksponering for lys fra en femtosecond pulserende infrarød laser fokusert på målet punkt langs axon av tenkelig formål (se ¹³ for mer informasjon om laser kirurgi). Time-lapse bilder på en ramme hver 3 sek, med 400 msek eksponeringstider ble registrert for 320 sek, mens du utfører laser kirurgi og kalsiumnivåer beregnet etter Proporsjonal analyse.

Signaler ble målt uavhengig på cellen kroppen (fig. 4B) og for axon segment innen 5 mikrometer av kuttet punktet (Figur 4C). Tallene viser både CFP og YFP intensiteter samt resulterende FRET forholdet. Målingen på cellen kroppen er frisk artet med CFP raskt avtagende og YFP øker i respons til laser skade ved t = 0 sek (rød pil). Dette resulterer i en umiddelbar ~ 200% økning i Proporsjonal signal (Af / F) som varer i ~ 90 sek før den falt tilbake til nær baseline nivåer. Bleking er minimal som fremgår av den konsekvente grunnlinjen.

I axon segmentet nær klippepunktet varierer lokalt mengde fluorofor løpet av eksperimentet, kompliserer signalet. Laser kirurgi servere axon og kort brudd i membranen, slik at fluorofor å unnslippe og midlertidig redusere sin lokale cytoplasmisk konsentrasjon. Dette er tydelig fra en innledende reduksjon i YFP spor i figur 4C, og en sammenligning av axon segmentet nær skaden peker i YFP bildene til tider t = 0 sek og t = 6 sek, figur 4A. På later tidspunkter, svulmer avkuttede enden som en del av sin fortsatte utvinning, som resulterer i mer lokaliserte fluoroforen og en økning i intensitet. Dette er mest tydelig i den langsomt økende CFP spor i figur 4C og en sammenligning av axon segmentet i CFP bilder ved tider t = 0 sek og t = 270 sek, figur 4A. Men disse variasjonene påvirker begge kanaler likt, og FRET forholdet effektivt kompenserer. Den resulterende målingen viser en respons lik cellen kroppen med en umiddelbar ~ 150% økning i signalet (Af / F), en dramatisk bedring til nærheten utgangsverdi ~ 90 sek og deretter en ytterligere mindre sekundær respons ved ~ 150 sek. Den Proporsjonal analysen er kritisk til denne målingen som det ville være ekstremt vanskelig å skille kalsium-signalet fra de andre virkninger, som kan variere sterkt fra nervecelle til nevron og kirurgi til kirurgi. Axon signalet har mer støy sammenlignet med cellen kroppen signalet hovedsakelig grunnet dimmer fluorescens ogmindre ROI i smalere axon.

Figur 1. Grunnleggende oppsett og Proporsjonal optikk. A) Fotografiet viser den eksperimentelle oppsett bestående av en invertert forbindelse mikroskop og Proporsjonal bildebehandling optikk. B) Et skjematisk diagram som illustrerer de bildedannende optikk som trengs for de Proporsjonal FRET-baserte målinger. Bildet er delt i de to bølgelengder eller kanaler, som er anslått side-ved-side på CCD array.

Figur 2. Prøveopparbeidelse. C. elegans er montert på tynne agarose pads for bildebehandling. A) Agarose putene er laget av sandwiching en liten dråpesmeltet agarose mellom to mikroskopobjektglass adskilt av to stykker av laboratoriet tape. B) Dyr overføres på agarose puten og dekket med et dekkglass, holdes på plass av en liten mengde voks ved hver av de fire hjørnene.

Figur 3. GCaMP eksempel data. GCaMP signal, Af / F, innspilt in vivo fra cellen kroppen av ASJ nervecellen svare på en alternerende på / av elektrisk felt (grønne kurven). Tykke grå linjene indikerer perioder når den eksterne elektriske feltet (3 V / cm) ble anvendt på dyret. Målestokk representerer 100% økning i fluorescensintensitet.

Figur 4. Cameleon eksempel data. A) Tre separate rammer som viser dual bildevisning av en ALM nervecellen før og etter laser kirurgi av axon 20 mikrometer fra cellen kroppen. Den røde pilen i det midtre panelet viser klippepunktet. Den nederste panelet viser cellen kropp og axon segmentet produsere signaler i B og C. B) Cameleon YC3.60 signal målt på cellen kroppen av ALM nervecellen før og etter laser kirurgi (rød pil). C) Cameleon YC3 0,60 signal målt ved axon segment innen 5 mikrometer fra klippepunktet før og etter laser kirurgi. Gule spor tyder YFP signaler, blå spor tyder CFP signaler og oransje spor er den resulterende FRET forholdet. Alle tider er i forhold til tidspunktet for laser kirurgi. Skala søylene representerer en 100% økning i fluorescens intensitet. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Genetisk kodet kalsium indikatorer har vært mye brukt i C. elegans nevrobiologi. Tallrike grupper har anvendt disse teknikkene for å studere respons av primære sensoriske nevroner på ytre stimuli som demonstrert her med ASJ responsen til et elektrisk felt. Prominent eksempler er følelsen av mekanisk berøring, bestemte kjemikalier, temperatur og en elektrisk ^{12 felt, 16-19.} Aktivitet av interneuron og muskelceller har også blitt overvåket både som reaksjon på stimuli og i kontroll av dyrs atferd. Mange av disse studiene har skjøvet disse teknikkene et skritt videre ved hjelp av image anerkjennelse og sporing teknikker for å aktivere registrering fra nevroner i delvis behersket eller fritt bevegelige dyr samt opptak fra flere nevroner samtidig. Ytterligere studier har undersøkt andre aspekter av kalsium fysiologi som responsen på neuronal skade ^{13, 20} som presentert her samtneuronal degenerasjon på lengre tidsskalaer ^21.

I utformingen av en bestemt eksperiment, bør hver av de alternative teknikker om brukte kalsium journalister og dyr immobilisering vurderes nøye. Immobilisering teknikker vil være diktert av tekniske aspekter som behovet for fysisk tilgang til dyret, evnen til å gjenopprette forsøksdyr etter avbildning eller behovet for høy gjennomstrømning. Ulike fluorescerende kalsium journalister har spesifikke fordeler og ulemper også. GCaMP sysselsetter grei enkanals bildeanalyse og den store signal-til-støy-forhold gjør det gjelder for mange situasjoner. Cameleon derimot krever mer kompleks bildebehandling og analyse, men den resulterende Proporsjonal måling kan være kritisk i situasjoner med potensielt store gjenstander. For eksempel, kan svingninger i mengden av fluoroforen (som i laser skade eksempel) også skje over lange tidsperioder(Timer) på grunn av endringer i ekspresjonsnivåer. Ytterligere to imaging strategier er også mulig som GCaMP co-uttrykt med (eller fysisk koblet til) en RFP fluorophore. Selv om ikke FRET-basert dette ville dra nytte av den store dynamiske spekter av moderne GCaMP varianter mens du bruker den røde kanalen som en real-time baseline måling.

Det er viktig å merke seg at mange tokanals bildebehandling mikroskop systemer og analyseprogrammer er kommersielt tilgjengelig som, mens ofte dyrere, kan være attraktive for forskere motvillige å konstruere hjem bygget systemet beskrevet her. Kommersielle doble imaging-systemer (DualView2-DV2, Fotometri) bruker vanligvis optikk ligner vårt hjem bygget system, men er i en enkelt mikroskop vedlegg med standardiserte justering prosedyrer. Alternativt, rask filter utveksling systemer (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) tillater rask sanntid sekvensiell avbildning av to fargekanaler without ekstra bildebehandling optikk, men er også dyrere og krever nøyaktig synkronisering mellom filteret utveksling og kamera oppkjøpet.

Oppsummert, C. elegans presenterer en rekke fordeler som en in vivo imaging system. De genetisk kodede fluoroforer er ofte celle spesifikk og kan eliminere behovet for å injisere eller administrering av eksogene fluoroforer. C. elegans optisk tilgjengelighet tillater avbildning innen intakte dyr som er lett og kostnadseffektivt å vedlikeholde, ikke krever komplisert disseksjon eller neuronal dyrking og bevare cellefysiologi. I tillegg, C. elegans har gode muligheter for genetisk analyse med et stort antall tilgjengelige genetiske reagenser og veletablerte teknikker. Det er selvsagt også ulemper til systemet, den primære bekymring kanskje er at det er en invertebrate. I tillegg, fluoroforer rapporterer relative endringer i kalsiumkonsentrasjon Rather enn en absolutt verdi og tidsoppløsningen av målinger kan være begrenset av begge dynamikken i fluoroforen men også de nødvendige integrasjon tider på svake fluoressens signaler. Endelig er mens kalsium en integrert del av neuronal aktivitet og signaliserer fluoroforer ikke direkte rapportere membranen spenningspotensial målt med elektrofysiologiske teknikker. Likevel illustreres ved de prosedyrer som er presentert her, C. elegans er en attraktiv, relativt enkle, kostnadseffektivt system for et bredt spekter av nevronale imaging studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B