Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Published: April 10, 2013 doi: 10.3791/50357
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Physiology and Biophysics, Boston University School of Medicine, 2Boston University Photonics Center
* These authors contributed equally

Summary

مع صغر الجسم التشريح العصبي شفافة موثقة جيدا، ومجموعة من التقنيات الجينية قابلة والكواشف،

Abstract

والديدان الخيطية دودة C. ايليجانس هو كائن النموذج المثالي لبسيطة نسبيا، والتصوير بتكلفة منخفضة الخلايا العصبية في الجسم الحي. جسمها شفافة صغيرة وبسيطة وجيدة تتسم الجهاز العصبي يسمح بتحديد والتصوير مضان من الخلايا العصبية داخل أي الحيوان سليمة. تقنيات بسيطة الشلل مع تأثير ضئيل على علم وظائف الأعضاء في الحيوان السماح الممتدة الوقت الفاصل بين التصوير. تطوير fluorophores الكالسيوم وراثيا ترميز حساسة مثل cameleon 1 و 2 تسمح GCaMP في التصوير المجراة من الكالسيوم العصبية تتعلق بكل علم وظائف الأعضاء والخلايا نشاط الخلايا العصبية. سلالات معدلة وراثيا معربا عن العديد من هذه الخلايا العصبية في fluorophores محددة متوفرة أو يمكن بناؤها باستخدام تقنيات راسخة. هنا، نحن تصف الإجراءات التفصيلية لقياس ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا العصبيه واحدة في الجسم الحي باستخدام كل GCaMP وcameleon. نناقش مزايا وdisadvantالأعمار من كلا فضلا عن أساليب مختلفة لإعداد العينات (تجميد الحيوانات) وتحليل الصور. وأخيرا، فإننا نقدم نتائج تجربتين: 1) عن طريق GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية الحسية لمحددة لمجال كهربائي خارجي و 2) عن طريق cameleon لقياس استجابة الكالسيوم الفسيولوجية للخلية عصبية إلى أضرار الليزر الصدمة. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم مثل هذه على نطاق واسع في C. وقد تم تمديد ايليجانس والقياسات في الحيوانات التحرك بحرية، الخلايا العصبية متعددة في نفس الوقت والمقارنة بين خلفيات وراثية. C. ايليجانس يقدم نظام قوي ومرن لفي الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية مع أنظمة المزايا على نموذج آخر من البساطة الفنية والتكلفة.

Introduction

هنا نقدم طرق عملية لفي الجسم الحي التصوير الكالسيوم في C. الخلايا العصبية ايليجانس. تطوير fluorophores الكالسيوم الحساسة للترميز وراثيا مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية يجعل C. ايليجانس نظام بسيط نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لقياس الفسيولوجيا العصبية والنشاط. ويتم التصوير لدينا مع المجهر المركب باستخدام معيار واسع المجال من التصوير مضان fluorophores المتاحة عموما. نقدم العديد من التقنيات المختلفة التي تستخدم fluorophores والاستعدادات عينة مختلفة، ومناقشة نقاط القوة والضعف لكل منها. وترد البيانات من التجارب ثم المثال الثاني. ويمكن الاطلاع ممتازة من الموارد الإضافية على التقنيات الموضحة هنا في WormBook، "تصوير نشاط الخلايا العصبية والعضلات" من قبل كير R.، ( http://www.wormbook.org ) 3.

فئتين الرئيسية للجينياويشيع استخدام ترميز أتوماتيكيا للصحفيين الفلورسنت الكالسيوم في C. ايليجانس: واحد GCaMP قناة وcameleon الحنق القائم. سنقوم بشرح أساليب وتظهر أمثلة للبيانات التي تم إنشاؤها بواسطة كل منهما.

ويستند GCaMP على بروتين الفلورية الخضراء تعديل (GFP) التي تعتبر حساسة لتركيز الكالسيوم المحيطة بها. ويتم إنجاز هذا عن طريق مزيج من GFP وتقارب الكالسيوم عالية البروتين كالمودولين، على ان يكون ملزما من الكالسيوم عن طريق كالمودولين يرتفع جزيء GFP في تأكيد على كفاءة الفلورسنت 2. التطورات الأخيرة في هذه fluorophores توليد إشارة استثنائية مع زيادة حجم ما يصل الى 500٪ في كثافة مضان على نطاق والفسيولوجية للمستويات الكالسيوم وحركية بسرعة معقولة من 95 مللي ثانية ~ الوقت وارتفاع ~ تسوس ميللي ثانية 650 مرة 4. على مدى فترات زمنية قصيرة نسبيا (دقائق)، يمكن لهذه الإشارات كبيرة تسمح للتصوير دقة أقل (أقل التكبير)، ونظرا لحسن تصرف الحرف الأولالاتحاد العالمي للتعليم قياس خط الأساس، ينفي ضرورة أساسية متصلة أو قياسات نسبية.

Cameleon له ميزة كونه fluorophore الحنق على أساس أن يولد قياس ratiometric المقارنة بين اثنين من قنوات مستقلة أو موجات 1. وهي تتألف من اثنين fluorophores منفصلة (البروتينات الفلورية سماوي والصفراء التي ينبعث منها، وYFP CFP) ويربطها به كالمودولين بروتين. يضيء مجمع مع الضوء الأزرق (440 نانومتر) التي يثير CFP. ملزمة من الكالسيوم يرتفع fluorophores أقرب معا، وزيادة نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) من CFP (المانحة) إلى YFP (متقبل) والتسبب في انبعاث CFP (480 نانومتر) لتقليل الانبعاثات وYFP (535 نانومتر) لزيادة . يتم قياس مستويات الكالسيوم النسبية بأنه نسبة كثافة YFP / CFP. حركية Cameleon تكون أبطأ من تلك التي GCaMP، وتقاس في الجسم الحي لقضاء وقت صعود ثانية 1 ~ وزمن اضمحلال 3 ~ 5 ثوانى. ومع ذلك،نسبة إشارات تتحرك معاكس يزيد من حجم إشارة ويعوض عن عدد من القطع الأثرية ممكن نظرا للتغيرات في حركة fluorophore، أو الانجراف التركيز التركيز والتبييض.

للصحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا ينفي الكثير من إعداد العينات المطلوبة مع تحقيقات تدار خارجيا وC. ايليجانس الجسم شفاف يسمح التصوير داخل صغيرة الحيوان سليمة باستخدام بسيطة مضان حقل واسع. التحدي الرئيسي في إعداد العينات التقنية لذلك لشل حركة الحيوانات بأمان. هناك عدد من التقنيات المختلفة المستخدمة لكل منها مزايا وعيوب. استخدام وكيل الدوائية على شل الحيوانات من السهل لتنفيذ ويسمح للتصاعد من الحيوانات متعددة على واحد إعداد (الليفاميزول، ناهض الكولينية التي تسبب الأنسجة العضلية للاستيلاء وعادة ما تستخدم 6). C. ويمكن أيضا أن يجمد ايليجانس الجسدي من قبل متزايدة منهمعلى تصلب الاغاروز 10٪ 7 و 8. يقلل هذا التأثير على علم وظائف الأعضاء الحيوانية، ويسمح على المدى الطويل التصوير (ساعة) والانتعاش من الحيوانات متعددة ولكن هو أكثر صعوبة من الناحية الفنية. كل من هذه التقنيات تقييد الوصول الفعلي إلى الحيوانات (التي هي تحت الغطاء زلة) وبالتالي يمكن أن تستخدم إلا مع المحفزات التجريبية معينة (مثل الضوء، حقل، ودرجة الحرارة الكهربائية أو تلف ليزر). لالمحفزات التي تتطلب الوصول المادي، مثل اللمس أو إدارة المواد الكيميائية، والعديد من الدراسات لصقها بنجاح C. ايليجانس في مكان (باستخدام الغراء البيطرية الصف) 9. هذا هو أكثر تحديا من الناحية الفنية، هو إعداد حيوان واحد، ولا تسمح الانتعاش الحيوان. وأخيرا، فقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك العديدة التي تقيد جسديا C. ايليجانس، يمكن الحفاظ على فسيولوجيا الحيوان، مما يسمح التعرض لمعظم أنواع المنبهات (اعتمادا على تصميم الجهاز) وتمكين التبادل السريع والتعافي من الحيوانات

يمكن استخدام الأساليب المعروضة هنا لقياس نشاط الخلايا العصبية وعلم وظائف الأعضاء في الخلية C. ايليجانس. نعطي مثالا على كل منها: استخدام GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية الحسية من ASJ إلى حقل كهربائي خارجي، واستخدام cameleon لقياس استجابة الكالسيوم الفسيولوجية للضرر الليزر من الخلايا العصبية. هذه الأمثلة تبين مزايا وعيوب هذين النوعين من fluorophores وتوضيح ما هو ممكن مع النظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد البصرية

  1. استخدام المجهر المركب القياسية مع قدرات التصوير epifluorescence. نستخدم الكسوف نيكون تي U مقلوب المجهر مع اضاءة HG Intensilight.
  2. للحصول على أفضل صورة وجودة الإشارة استخدام تضخم عالية، وارتفاع الهدف الفتحة العددية. ونحن عادة استخدام X60 نيكون النفط 1،4 NA الهدف الغمر. في بعض الحالات، من الممكن استخدام أقل التكبير (X40، X20) اعتمادا على مستوى التعبير من fluorophore وقوة الإشارة.
  3. استخدام حساسية عالية تبريد الكاميرا CCD، مثل الكاميرا كلارا أندور لتعظيم حساسية الصورة وتقليل الضوضاء الخلفية.
  4. لfluorophores لون واحد مضان المجهر استخدام معيار تصفية مجموعة المصممة لطول موجة معينة من fluorophore. لاستخدام GCaMP وضع معيار GFP الأمثل لتصفية الإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات عند 525 نانومتر. وهناك حاجة إلى مزيد من التعديلات البصرية.
    5. الشكل رقم 1. وتتكون من:
    1. مرشح المجهر تعيين مع 440 ± 20 نانومتر والإثارة تصفية نانومتر 455 تمريرة طويلة مرآة مزدوج اللون.
    2. قناع الصورة وضعت في الطائرة الصورة الأولية على الفور خارج المجهر التصوير الميناء (حيث استشعار CCD كاميرا وعادة الجلوس). هذا يحد من مجال الرؤية من النوع الذي سيملأ فقط نصف مستشعر الكاميرا. وضع هذا القناع في صورة نتائج أول طائرة في حدود صورة حادة والتداخل لا عند المتوقع الصورتين جنبا إلى جنب.
    3. تعيين أول واحد تتابع عدسة البعد البؤري بعيدا عن رانه الأولي الطائرة الصورة بحيث collimates ضوء.
    4. مرآة مزدوج اللون الذي يقسم الضوء إلى أطوال موجية 2 التصوير منفصلة أو القنوات التي تعكس لون واحد (> 515 نانومتر، والأصفر)، في حين يحيل الآخر (<515 نانومتر، سماوي).
    5. مرشحات الانبعاثات (الفرقة تمرير مرشحات) تفرض قيودا إضافية على ضوء أحيلت إلى موجات محددة التصوير (سماوي عند 485 ± 40 نانومتر والأصفر عند 535 ± 30 نانومتر)،
    6. العدسات التتابع الثانية (واحد لكل قناة) وضعت في مسارات شعاع من النوع الذي يعيد تركيز الضوء على طائرة الصورة الثانية في الكاميرا CCD.
    7. ألف زوج من المرايا ومرآة مزدوج اللون 2 يوجه مسارات شعاع بحيث الصورتين معاد ويتوقع جنبا إلى جنب على جهاز الاستشعار CCD الكاميرا. الشكل 4A مثالا على الصورة الناتجة.
  5. محاذاة البصرية الأولية: بدء الإعداد والتنسيق للبصريات مع ايماج التباين العاليه استخدام عدسة التكبير المنخفض وتنتقل الإضاءة الخفيفة واسعة المجال (أ sharpie السوداء المسحوبة على شريحة المجهر يعمل بشكل جيد). إحضار صورة من خلال التركيز oculars المجهر وتحولت بعد ذلك إلى ميناء المجهر لاستخدامه. مع إضاءة ضوء ارتفاع عرض الصورة على بطاقة الرقم القياسي في الطائرة التنسيق الأولي (عدة سنتيمترات خارج الميناء المجهر). ضع العدسة التتابع الأول (C) في المسار الحزمة من النوع الذي هو واحد من الطائرة مسافة التنسيق التنسيق الأولي وcollimates ضوء في حين لا تنحرف مسار شعاع (أي مباشرة وتتركز في مسار شعاع). وضع قناع على طائرة الوصل الأولى، تعديل لتقييد نصف مجال الرؤية وإنتاج الحدود حادة في الصورة. وضع المرايا والفلاتر (D، E، G) بحيث يبقى مسار الشعاع موازية لسطح الطاولة ويعمل في مسارين متوازيين جنبا إلى جنب، كما هو مبين في الشكل 1B. مركز العدسات التتابع الثاني (F) في كل مساراتها وشعاعنقلها ذهابا وإيابا على طول مسارات لجلب الصور إلى التركيز على وضع مؤشر بطاقة استشعار CCD كانت الكاميرا سيكون. إذا فعلت بشكل صحيح يجب أن يكون الصورتين مستتب البؤرتين مع oculars المجهر والكاميرا الموانئ الأخرى. وأخيرا وضع الكاميرا في موقف وصقل المحاذاة.
  6. غرامة ضبط محاذاة الضوئية: استخدام الصورة المزدوجة عرضها من قبل الكاميرا CCD لضبط المحاذاة الضوئية. استخدام صورة عالية التباين والبدء مع انخفاض التكبير، والتحول إلى تضخم أعلى لمحاذاة النهائي. وضع الصورة المنقولة (سماوي القناة في الشكل 1B) لتغطية نصف مجال الكاميرا وجهة نظر عن طريق تحريك الكاميرا في المركز X Y. وتنعكس صورة (قناة الصفراء في الشكل 1B) لتغطية النصف الآخر من مجال عرض مشاركة عن طريق ضبط اثنين من المرايا (G) في مسار شعاع لها. تحسين التركيز عن طريق تحريك العدسة الثانية لتتابع كل قناة ذهابا وإيابا على طول مسار الشعاع. إذا تركتيجب الإعداد دون تغيير البصرية تكون مستقرة وتتطلب سوى نادرة التكيف تهذيب.

2. تحضير العينة والحصول على البيانات.

  1. الحصول على الحيوانات تعبر عن fluorophore الكالسيوم الحساسة في الخلايا العصبية من الاهتمام من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) أو من مصادر أخرى. يمكن بناؤها الحيوانات المعدلة وراثيا بدلا من استخدام معيار C. ايليجانس التقنيات. واحد التعبير الخلية ليس من الضروري (وأحيانا غير مرغوب فيه إذا الخلايا العصبية متعددة للتحقيق، انظر 12) ما دامت الصور والقياسات من خلايا متعددة يمكن فصلها بسهولة. إذا لم يتم دمج التحوير fluorophore في الجينوم، ويمكن تفاوت كبير في التعبير تحدث من الحيوان الى الحيوان. في هذه الحالة، preselecting الحيوانات مع ارتفاع مستويات التعبير باستخدام مجهر الفلورسنت تشريح يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويحسن القياسات. مستويات التعبير Fluorophore نيد أن تكون كافية ليمكن تصوير بسهولة مع الكاميرا تحت المعلمات اقتناء المطلوبة من قبل التجربة.
  2. جعل منصات الاغاروز اللازمة لتقنية تجميد المطلوب (انظر 2.3 أدناه) عن طريق الضغط على قطرة صغيرة من الاغاروز المنصهر بين الشرائح الزجاج اثنين من مسافات قطعتين من الشريط المختبر. إذا لزم الأمر، يمكن نقل منصات الاغاروز إلى كوب زلة قبل تركيب غطاء الحيوانات. انظر الشكل 2.
  3. شل C. ايليجانس للتصوير باستخدام أحد الأساليب التالية:
    1. Paralyzation الدوائية: إضافة الليفاميزول 0.05٪ لمنصات الاغاروز 2٪ (خلطها في الاغاروز المنصهر قبل اتخاذ منصات في 2.2). اختيار الحيوانات 5-10 على منصة وتغطية زلة مع غطاء. تطبيق كميات صغيرة من خليط الشمع الساخن (50٪ شمع البارافين والفازلين 50٪) إلى زوايا الغطاء زلة لأنه عقد في الموقف. 5-10 دقيقة تسمح للالليفاميزول نافذة المفعول والحيوانات لبecome لا تزال تماما.
    2. الاغاروز شديدة الشلل: C. يمكن ايليجانس يجمد جسديا باستخدام منصات قوية 10٪ الاغاروز و 0.05 ميكرون الجسيمات النانوية البوليسترين القطر. جعل 10٪ الاغاروز منصات (10٪ الاغاروز في المخزن المؤقت NGM حسب الوزن) كما في 2.2. إضافة ~ 3 ميكرولتر من حل حبة (1:10 المجهرية البوليسترين في NGM من حيث الحجم) إلى الجزء العلوي من لوحة. بسرعة، واختيار 5-10 C. ايليجانس في بركة من حل حبة على منصة وبلطف مع تغطية زلة غطاء. استخدام الشمع المنصهر تطبيقها على زوايا غطاء زلة لأنه عقد في الموقف. (لمزيد من التفاصيل على هذه التقنية رؤية (7)، فضلا عن المادة السابقة إن الرب 8)
    3. الإلتصاق: C. ويمكن لصقها في مكانها باستخدام ايليجانس كميات صغيرة من مادة لاصقة الصف البيطرية المطبقة على جانب واحد من الحيوانات.
    4. أجهزة ميكروفلويديك: لقد تم تصميم أجهزة ميكروفلويديك عديدة لعقد جسديا C. ايليجانس في مكان التصوير.
    </ لى>
  4. ضع الشريحة أعد على المجهر والتركيز على الخلايا العصبية المطلوب. غالبا ما يكون من الأسهل العثور على C. ايليجانس باستخدام الإضاءة الساطعة الميدانية وتضخم منخفضة. ثم التحول إلى تضخم عالية والتصوير مضان لإيجاد والتركيز على الخلايا العصبية المحددة.
  5. التحفيز: إذا كانت هناك رغبة استجابة الخلايا العصبية لحافزا محددة (الضوء، المجال الكهربائي، والعظة ذوقي حاسة الشم، ودرجة الحرارة وما إلى ذلك)، يجب أن تكون مصممة جهاز التحفيز في الإعداد المجهر، بحيث يمكن أن تدار على الحيوانات في إعداد العينات في حين التصوير.
  6. الحصول على الصور باستخدام الكاميرا CCD المجهر. وسوف تعرض مرات والإثارة مستوى الضوء تعتمد على إشارة خط الأساس ومستوى التعبير من fluorophore، مع إشارات أضعف تتطلب أوقات أطول التعرض للقرار متناسق وقت أقل. نستخدم عادة التعرض ميللي ثانية ~ 300 مرة.
  7. الحصول على صور إما بشكل فردي أو على شكل منظمة الشفافية الدوليةلي مرور الفيلم. لأن C. الخلايا العصبية عموما ايليجانس عرض ديناميكية التنشيط بطيئة (أي أنها تفتقر إلى الإمكانيات القائمة على العمل الصوديوم)، معدلات الإطار بطيئة نسبيا من ثانية 1 ~ غالبا ما تكون كافية لقياس الخلايا العصبية المحركة. أسعار شراء ما يصل إلى ~ تم استخدام 90 لقطة في الثانية على الرغم من أن هذه قد تكون محدودة في الوقت التكامل اللازمة لمضان ضعيفة. يمكن مشاهدة الأفلام الفردية الخلايا العصبيه واحدة تمتد بسهولة لعدة دقائق (~ 5-10 دقيقة) أو لفترة أطول إذا إعداد تجميد مستقرة ومعدل الإطار بطيئة نسبيا.

3. تحليل البيانات

  1. هناك عدد من حزم البرامج المختلفة الفلورسنت التصوير المتاحة مع قدرات التحليل الديناميكي وratiometric بما في ذلك يماغيج وعناصر NIS. نستخدم برنامج MATLAB بسيطة المخصصة التي تقيس إشارة الفلورسنت متوسط ​​فوق منطقة مختارة من الفائدة.
  2. للصور الفردية (أو الوقت الفاصل بين الأفلام التي لا تزال قائمةلا تزال تماما) تحديد منطقة ذات الاهتمام (ROI) في الخلايا العصبية المصورة ومنطقة منفصلة في مكان قريب لقياس الخلفية. للصور ratiometric حدد ROI مماثلة والمناطق الخلفية لكل من الصور المزدوجة.
  3. حركة طفيفة من الخلايا العصبية المصورة داخل فيلم الوقت الفاصل بين التحليل يتطلب إضافية لتحديد تلقائيا ROI في كل إطار، والتي يمكن إنجازه باستخدام العديد من برامج التتبع الكائن. برنامجنا يعرض صورة مضغوطة من كل الصور في الفيلم الذي تم تحديده يدويا الحدود الخام (التي تشمل وجوه المصالح في جميع الأطر) واختيار منطقة الخلفية مستقلة. الإطار الأول لل، يتم تحديد يدويا ROI من داخل المنطقة الحدودية. لكل إطار لاحقة، كان يختار البرنامج ألمع بكسل من داخل المنطقة الحدودية لإنشاء ROI من الحجم الصحيح (أي نفس عدد بكسل كما ROI الإطار الأول دليل). للصور حيث objecر المصالح هو أكثر إشراقا بما فيه الكفاية ثم الخلفية المحيطة في المنطقة الحدودية هذا البروتوكول يختار ROI معقولة لكل إطار.
  4. يتم احتساب إشارة الفلورسنت، F، لكل إطار وحدة بكسل متوسط ​​العائد على الاستثمار في المتوسط ​​ناقص كثافة في المنطقة الخلفية. وتحسب القيم Ratiometric كنسبة من إشارات اثنين (YFP-YFP الخلفية) / (CFP-CFP الخلفية) -0.65. العامل بين 0.65 يعوض عن تنزف من خلال لقناة CFP في القناة YFP، والتي سوف تعتمد على fluorophores فضلا عن مجموعة خاصة تستخدم فلتر (هذه القيمة هي عادة ~ 0.6 من الاجهزة cameleon).
  5. يتم حساب مستوى الكالسيوم النسبية لكل إطار والتغيير في المئة في كثافة تطبيع إلى قيمة خط الأساس الأولي تقاس من الإطار الأول (أو سلسلة من إطارات): ΔF / F = (F (ر)-F س) / س F، حيث F (ر) هو في مضان ر س الوقت وFهو القيمة الأساسية الأولية.
  6. A ROI اختيار خلايا الجسم يولد أقوى إشارات أقوى ولكن من الممكن أيضا اختيار وقياس الاشارات من ROI على طول العمليات العصبية.

4. حل المشاكل

  1. تبيض: التعرض للضوء يمكن أن يسبب الإثارة تبيض من fluorophore ويتميز بانخفاض مطرد في إشارة إلى أن تعتمد على مستويات التعرض. قياسات Ratiometric مساعدة للتعويض عن ذلك. يمكن انتقائية لكن تبييض طول موجي واحد لا تزال تحدث (التبييض عادة أسرع CFP ثم YFP). إذا تبيض يحدث خفض مستوى التعرض للضوء عن طريق الحد من التعرض مرات و / أو شدة الإثارة (مع مرشحات الكثافة محايدة في مسار الإضاءة). إذا لزم الأمر، يمكن للمرء تعويض للتبييض عن طريق تشغيل محاكمات صورية (مع التعرض الإثارة نفسها ولكن لا التحفيز العصبي) وقياس الوقت المستمر للتسوس الإشارة.
  2. C. الحيوان لا يزال نسبيا طوال فترة تسجيل: ز> الشلل. ايليجانس الرد على التعرض للضوء والمحفزات التجريبية، مما يجعلها الأكثر عرضة للتنقل في وقت التسجيل. يمكن إدخال حركة طفيفة الضوضاء كبيرة في قياس وخصوصا عندما قياس العمليات من محور عصبي. تحليل Ratiometric يساعد على تخفيف هذه الآثار إلى حد ما والقياسات من خلايا الجسم هي أكثر قوة. والتنفيذ الدقيق وتنقيح الإجراءات تجميد يؤدي إلى الحيوانات لا تزال تماما.
  3. اختيار الخلفية: الاختيار الدقيق للمنطقة الخلفية اللازمة لتحليل الصور الناجحة. يجب أن تكون موحدة المناطق الخلفية بشكل معقول وأكثر قتامة ثم الخلايا العصبية المصورة. يجب إزالته بما فيه الكفاية لتجنب الضوء المتناثرة (وبالتالي التقاط إشارة) من الخلايا العصبية المصورة. نجد منطقة موحدة 20-50 ميكرون من ROI يعمل بشكل جيد في معظم الحالات.
  4. بصريات Ratiometric: المحاذاة الصحيحة للبصريات التصوير هو أمر حاسم لتوليد صورة واضحة مزدوجة. المرفقات المجهر التجارية للتصوير ratiometric متوفرة. تقنية البديل هو استخدام التصوير السريع متتابعة باستخدام عجلة سريعة للتبديل فلتر بسرعة بين موجات الانبعاثات أثناء تسجيل صور منفصلة لكل منها.
  5. تحليل Ratiometric: تحليل الموصوفة هنا هي تقنية بسيطة نسبيا والتي تولد إشارات قوية بحكم المتوسط ​​على مدى ROI. فإنه يتطلب كائن مشرق معترف بها لتحديد العائد على الاستثمار. المزيد من التحليل ratiometric متطورة من الممكن عن طريق مواءمة بدقة ورسم الخرائط على الصور المزدوجة بحيث يمكن حساب نسبة الفلورسنت بكسل بكسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا نقدم نتائج تجربتين منفصلتين. أول توظف GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية لمن الحسية محددة لتحفيز خارجي تعريف، وإعطاء مثال جيد على كيفية استخدام الكالسيوم للصحفيين الفلورسنت لرصد نشاط الخلايا العصبية في بصريا C. سليمة ايليجانس. والثاني يعمل cameleon لقياس الكالسيوم داخل الخلايا عابرة أثار داخل الخلية العصبية استجابة لأضرار الليزر محددة، وهو ما يدل بالتالي كيف يمكن قياس الكالسيوم في علم وظائف الأعضاء خلية واحدة في الجسم الحي. التركيز على الجوانب التقنية لقياس كل وتعرض نتائج التجارب الفردية ومناقشتها بالتفصيل. غالبا ما يتم احتساب متوسط ​​الاستجابة على مر الزمن (محسوبة على أنها استجابة المتوسط ​​في كل نقطة زمنية فيما يتعلق التحفيز) أو متري محددة (مثل السعة متوسط ​​الاستجابة) عبر العديد من المحاكمات. عادة 10-20 التجارب ضرورية لإنشاء قياس متوسط ​​مقبول ولكن روالرقم الذي سجله تعتمد في تقلب المتأصلة في الاستجابة. ويمكن الاطلاع على هذه البيانات لتحليل التجارب التي تمت مناقشتها هنا في 12 و 13.

GCaMP قياس استجابة حسية: عندما يتعرض إلى حقل كهربائي قوي خارجية (≥ 3 V / سم)، C. ايليجانس الزحف بنشاط نحو القطب السلبي من الميدان مع دقة الحركة الموجهة. أظهرنا سابقا أن توسط في المقام الأول هذا السلوك من قبل الخلايا العصبية electrotactic ASJ اليسار واليمين، الخلايا العصبية الحسية الموجودة في amphid رأس الحيوان 12. لتصور هذا الرد كنا سلالة معدلة وراثيا معربا عن GCaMP3 تحديدا في الخلايا العصبية ASJ اليسار واليمين تحت المروج-9 برنامج العمل العالمي. نحن يجمد الحيوانات للتصوير باستخدام منصات تحتوي على الاغاروز الليفاميزول 0.05٪ تقع بين تغطية زلات اثنين (كما هو موضح في الإجراءات). كانت تدار من التحفيز الكهربائي باستخدام دائرة مخصصة بنيت التصوير الذي يناسب علىمرحلة مجهر مقلوب تي نيكون (انظر 12). وباختصار، يتم وضع غطاء إعداد زلة (مع الجانب دودة أسفل) أكثر من ثقب في غرفة صغيرة من البلاستيك مما يتيح الوصول للأهداف من دون معيار والتصوير من خلال زلة غطاء. وقد شغل الغرفة مع كلوريد الصوديوم 0.25 ملم و 50 ملم والجلسرين العازلة الحافز تطبيق الحقل الكهربائي باستخدام الأقطاب الكهربائية البلاتين 2 بطانة نهايات الدائرة. كما هو موضح أعلاه، واحدة معربا عن الخلايا العصبية ASJ تم تصويرها باستخدام CGaMP X100 النفط 1،4 NA الهدف الغمر ومستوى تصفية مجموعة GFP. وكانت الشركة قد فيلم الوقت الفاصل بين لمدة 80 ثانية (1 الإطار / ثانية، 300 ميللي ثانية زمن التعرض)، في حين إخضاع الحيوان لخارجي مجال V 3 سم / الكهربائية لمدة ثلاث محاكمات منفصلة كل 10 ثانية دائم (الشكل 3). قمنا بقياس كثافة مضان في خلايا الجسم باستخدام تحليل الصور الموصوفة أعلاه. الفيديو يعرض أخطاء طفيفة من كل من حركة الانجراف والتركيز على مدى التجربة. القديسrength للإشارة GCaMP لا يزال قويا لكن تظهر زيادة كبيرة ~ 250٪ في مضان ردا على كل من شارع (1) والثالثة و 3 المحفزات. النتيجة من المحفزات الثاني هو إلى حد كبير قلص يدل التباين في استجابة الخلايا العصبية. تبيض هو الحد الأدنى كما هو واضح من العودة إلى مستوى خط الأساس متسقة.

Cameleon قياس الكالسيوم الخلوية علم وظائف الأعضاء: إصابة الخلوية صدمة كبيرة يتسبب في الكالسيوم داخل الخلايا العصبية عابرة التي تلعب دورا أساسيا في مصير استجابة فسيولوجية يملي الخلوية (أي موت الخلايا مقابل بدء عمليات الإصلاح). يمكننا قياس هذا الرد الأضرار التي يسببها في الجسم الحي باستخدام ليزر الفيمتو ثانية لقطع الفردية C. ايليجانس الخلايا العصبية في وقت واحد 14 أثناء قياس الإشارات الخلوية باستخدام الكالسيوم cameleon YC3.60 13 و 15. معربا عن الحيوانات cameleon YC3.60 في الخلايا العصبية 6 ميكانيكية حسية (تحتMEC-4 المروج)، على الحركة باستخدام 10٪ الاغاروز والبوليسترين النانوية كما هو موضح في الإجراءات. استخدمنا البصريات التصوير المزدوج لتسجيل إشارات من CFP على حد سواء وقنوات YFP مضان كما هو موضح في الإجراءات. تصوير نحن واحدة ALM الخلايا العصبية والليزر تستهدف محور عصبي ~ 20 ميكرون من خلايا الجسم (الشكل 4A). وقد قطعت محور عصبي من قبل التعرض (<1 ثانية) موجز للضوء من الفيمتو ثانية نابض ليزر تحت الحمراء ركزت على نقطة الهدف على طول محور عصبي من قبل الهدف التصوير (انظر (13) لتفاصيل عن جراحة الليزر). وسجلت الوقت الفاصل بين الصور في إطار كل ثانية 3، مع 400 ميللي ثانية مرات التعرض للثانية 320 أثناء أداء الجراحة بالليزر ومستويات الكالسيوم حسابها باستخدام تحليل ratiometric.

تم قياس الإشارات بشكل مستقل في خلايا الجسم (الشكل 4B) وللجزء محور عصبي في غضون 5 ميكرون من نقطة قطع (الشكل 4C). الأرقام تظهر كل من CFP YFP وشدة وكذلك الناتجة عن الحنق النسبة. وتصرفت بشكل جيد في قياس خلايا الجسم مع CFP يتناقص بسرعة وYFP زيادة استجابة لأضرار الليزر في 0 ر = ثانية (السهم الأحمر). وهذا يؤدي إلى زيادة فورية ~ 200٪ في إشارة ratiometric (ΔF / F) الذي يستمر لثانية 90 ~ قبل أن يتراجع إلى مستويات خط الأساس القريب. تبيض هو الحد الأدنى كما هو واضح من الخط الخلفي ثابت.

محور عصبي في قطاع قريب من نقطة الفصل، وكمية من fluorophore المحلية تختلف على مدار التجربة، تعقيد الإشارة. جراحة الليزر يقطع محور عصبي لفترة وجيزة وتتمزق الغشاء، مما يسمح للهروب fluorophore والحد مؤقتا تركيزه حشوية المحلية. هذا هو واضح من انخفاض الأولي في تتبع الشكل 4C في YFP ومقارنة للجزء المحوار بالقرب من نقطة ضرر في الصور YFP في أوقات ر = 0 ثانية وثانية T = 6، الشكل 4A. في Laنقاط زمنية ثالثا، نهاية قطعت تتضخم كجزء من الانتعاش المتواصل، مما أدى إلى fluorophore أكثر محلية، وزيادة في كثافة. هذا هو أكثر وضوحا في التتبع وCFP يتزايد ببطء في الشكل 4C ومقارنة للجزء محور عصبي في الصور CFP في أوقات ر = 0 ثانية وثانية T = 270، الشكل 4A. لكن هذه الاختلافات تؤثر على كل القنوات على قدم المساواة ونسبة الحنق يعوض بشكل فعال. قياس الناتج يظهر استجابة مشابهة لخلايا الجسم مع زيادة فورية ~ 150٪ في إشارة (ΔF / F)، انتعاش كبير لخط الأساس في القريب ثانية ثم 90 ~ إضافية استجابة أصغر الثانوية في ثانية 150 ~. تحليل ratiometric أمر بالغ الأهمية لهذا القياس لأنه سيكون من الصعب للغاية فصل إشارة الكالسيوم من الآثار الأخرى، التي يمكن أن تختلف على نطاق واسع من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية وجراحة الجراحة. إشارة محور عصبي لديه مزيد من الضجيج مقارنة الخلية إشارة الجسم يرجع أساسا إلى باهتة ومضانأصغر ROI في أضيق محور عصبي.

الشكل 1
الشكل 1. الإعداد الأساسية والبصريات ratiometric. A) وتظهر الصورة الإعداد التجريبية تتألف من المجهر المركب المقلوب والبصريات التصوير ratiometric. B) رسم تخطيطي يوضح البصريات التصوير اللازمة لقياسات الحنق القائم على ratiometric. يتم تقسيم الصورة إلى موجات اثنين أو قنوات، والتي من المتوقع جنبا إلى جنب على مجموعة CCD.

الشكل 2
الشكل 2. تحضير العينة. C. هي التي شنت على منصات ايليجانس الاغاروز رقيقة للتصوير. مصنوعة A) من قبل منصات الاغاروز يقحم قطرة صغيرة منالشرائح متباعدة الاغاروز المنصهر بين اثنين المجهر من قبل قطعتين من الشريط المختبر. B) يتم نقل الحيوانات على منصة الاغاروز ومغطاة ساترة، الذي عقد في مكان من كمية صغيرة من الشمع في كل من الزوايا الأربع.

الشكل 3
الشكل 3. بيانات المثال GCaMP. إشارة GCaMP، ΔF / F، سجلت في الجسم الحي من خلايا الجسم من الخلايا العصبية ASJ الاستجابة لبالتناوب على / قبالة الحقل الكهربائي (الخضراء تتبع). سميكة خطوط رمادية تشير إلى فترات عند تطبيق مجال كهربائي خارجي (3 V / سم) للحيوان. شريط النطاق يمثل زيادة بنسبة 100٪ في كثافة مضان.

الشكل 4
الشكل 4. بيانات المثال Cameleon. A) ثلاثة أطر منفصلة تظهر الصورة المزدوجةعرض من خلية عصبية ALM قبل وبعد الجراحة بالليزر من 20 ميكرومتر محور عصبي من خلايا الجسم. السهم الأحمر في لوحة الأوسط يشير إلى نقطة قطع. لوحة أسفل يظهر خلايا الجسم والجزء محور عصبي إنتاج الإشارات في B و C. B) وYC3.60 cameleon إشارة قياس في جسم الخلية من الخلايا العصبية ALM قبل وبعد الجراحة بالليزر (السهم الأحمر). C) وYC3 cameleon إشارة قياس 0.60 في الجزء محور عصبي في غضون 5 ميكرون من نقطة قطع قبل وبعد الجراحة بالليزر. آثار الصفراء تشير إشارات YFP، آثار الزرقاء تشير إشارات وآثار CFP البرتقال هي الناتجة الحنق النسبة. جميع الأوقات نسبة إلى وقت الجراحة بالليزر. على نطاق والحانات يمثل زيادة بنسبة 100٪ في كثافة مضان. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تم ترميز مؤشرات الكالسيوم وراثيا المستخدمة على نطاق واسع في C. ايليجانس بيولوجيا الأعصاب. استخدمت هذه التقنيات فئات عديدة لدراسة استجابة الخلايا العصبية الحسية الأولية للمؤثرات الخارجية كما هو موضح هنا مع الاستجابة لASJ مجال كهربائي. ومن الأمثلة البارزة الإحساس باللمس الميكانيكية، مواد كيميائية محددة، ودرجة الحرارة والمجال الكهربائي 12، 16-19. كما تم نشاط عصبون وخلايا العضلات في كل من رصد استجابة للمؤثرات وتسيطر على سلوك الحيوان. ودفعت العديد من هذه الدراسات هذه التقنيات خطوة أخرى باستخدام تقنيات التعرف على الصور وتتبع لتمكين تسجيل من الخلايا العصبية في الحيوانات ضبط النفس جزئيا أو نقل بحرية حتى وكذلك التسجيل من الخلايا العصبية متعددة في نفس الوقت. الدراسات التي بحثت في جوانب أخرى إضافية من الكالسيوم علم وظائف الأعضاء مثل استجابة لتلف الخلايا العصبية 13 و 20 كما وردت هنا وكذلكتنكس الخلايا العصبية في جداول زمنية أطول 21.

في تصميم تجربة خاصة، ينبغي لكل من تقنيات بديلة للصحفيين فيما يتعلق الكالسيوم شيوعا والشلل الحيوان بعناية. وسيتم تجميد تمليه التقنيات من الجوانب التقنية مثل الحاجة إلى الوصول الفعلي إلى الحيوان، والقدرة على استرداد الحيوانات بعد التصوير أو الحاجة إلى إنتاجية عالية. مختلفة للصحفيين الفلورسنت الكالسيوم لديها مزايا وعيوب محددة كذلك. GCaMP توظف مباشرة صورة قناة واحدة كبيرة وتحليل الإشارات إلى نسبة الضوضاء يجعل من تنطبق على كثير من الحالات. Cameleon من ناحية أخرى يتطلب التصوير أكثر تعقيدا ولكن تحليل قياس الناتج ratiometric يمكن أن تكون حاسمة في حالات مع التحف كبيرة محتملة. على سبيل المثال، يمكن أن التقلبات في كمية fluorophore (كما في المثال الليزر الضرر) تحدث أيضا على مدى فترات زمنية طويلة(ساعة) بسبب التغيرات في مستويات التعبير. استراتيجيات إضافية التصوير المزدوج من الممكن أيضا مثل GCaMP المشترك مع أعربت (أو مرتبطة فعليا إلى) fluorophore RFP ل. في حين لا الحنق، فإن هذا يعتمد الاستفادة من مجموعة كبيرة من الديناميكية المتغيرات الحديثة GCaMP أثناء استخدام القناة الحمراء وقياس خط الأساس في الوقت الحقيقي.

من المهم أن نلاحظ أن العديد من أنظمة ثنائي القناة المجهر التصوير وبرامج التحليل المتاحة تجاريا والتي، في كثير من الأحيان أكثر تكلفة في حين، قد تكون جذابة للباحثين مترددة في بناء نظام بني المنزل وصفها هنا. نظم التصوير المزدوج التجارية (DualView2-DV2، Photometrics) عادة ما تستخدم البصريات مماثلة لنظام بناء وطننا ولكن ترد ضمن المرفقات المجهر واحدة للإجراءات المواءمة موحدة. بدلا من ذلك، تبادل سريع تصفية أنظمة (لامدا DG-4/DG-5 بالإضافة إلى ذلك، سوتر الآلات) تسمح السريع في الوقت الحقيقي التصوير متتابعة من القنوات واي لون 2thout البصريات التصوير إضافية ولكن هي أيضا مكلفة وتتطلب التزامن الدقيق بين مرشح تبادل واكتساب الكاميرا.

وخلاصة القول، C. ايليجانس يقدم عددا من المزايا باعتبارها نظام التصوير في الجسم الحي. وfluorophores المشفرة وراثيا غالبا ما تكون خلية معينة، ويمكن القضاء على الحاجة لحقن أو إدارة fluorophores الخارجية. C. ايليجانس للمعاقين البصرية يسمح التصوير داخل الحيوانات سليمة التي هي سهلة وفعالة من حيث التكلفة للحفاظ على، لا تتطلب تشريح معقدة أو زراعة الخلايا العصبية علم وظائف الأعضاء والحفاظ على الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، C. ايليجانس لديها قدرات كبيرة لالتحليل الجيني مع عدد كبير من الكواشف الجينية المتاحة والتقنيات الراسخة. هناك بالطبع من العيوب لهذا النظام، ربما الشغل الشاغل هو أن ذلك هو اللافقارية. وبالإضافة إلى ذلك، يقدم fluorophores التغيرات النسبية في تركيز الكالسيوم راذهيمكن تقييد R من قيمة مطلقة، والقرار وقت القياسات بواسطة الديناميات كل من fluorophore ولكن أيضا التكامل مرات اللازمة من إشارات ضعيفة مضان. وأخيرا، في حين الكالسيوم هو جزء لا يتجزأ من نشاط الخلايا العصبية ويشير إلى fluorophores لا يقدم تقاريره مباشرة إمكانات غشاء الجهد قياس كما هو الحال مع التقنيات الكهربية. ومع ذلك يتضح من الإجراءات المعروضة هنا، C. ايليجانس هي جذابة وبسيطة نسبيا، فعالة من حيث التكلفة لنظام مجموعة واسعة من الدراسات التصويرية العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgments

ساهم عدة أشخاص في أعمال وصفها في هذه الورقة. بنيت CVG الإعداد التجريبية، وLS، SHC، وCVG إجراء التجارب. كتب CVG وSHC المخطوطة. جميع المؤلفين شارك بعد ذلك في عملية مراجعة والموافقة على النسخة النهائية من المخطوط. نشكر بول ستيرنبرغ لسلالة GCaMP. وقدمت بعض سلالات النيماتودا المستخدمة في هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC)، الذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). تم تعديل برنامج MATLAB تحليل الصور عن تلك المستخدمة في 18. ويؤيد الكتاب من جامعة بوسطن وماساتشوستس مركز العلوم الحياة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eclipse Ti-U inverted
microscope		 Nikon
Intensilight HG Illuminator Nikon C-HGFI Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil Nikon
Optical table or 3'X3' optical
grade breadboard		 Thor Labs If an optical table is not used an
optical grade breadboard on a
solid laboratory bench should
suffice.
Clara Interline Camera Andor
Technology		 High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission Chroma Technology
Corp.		 41015 GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm Chroma D440/20x EX excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm
longpass		 Chroma 455DCLP BS microscope dichroic for cameleon
imaging
Dichroic mirror > 515 nm
longpass		 Chroma 515DCLP BS dichroic mirror for cameleon
imaging
Filter 535 +/- 15 nm Chroma D535/30m EM YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm Chroma D485/40m EM CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat Thor Labs AC508-200-A1 Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror Thor Labs ME2S-P01 FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole Sigma
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 08691-10, 2.5% by
volume, 50 nm
diameter		 polystyrene nanoparticles for C.
elegans immobilization
Transgenic strain, Strain
gpa-9::GCaMP3(in pha-1;
him-5 bkg) 		Sternberg Lab Strain PS6388
Transgenic strain, mec-
4::YC3.60		 Gabel Lab Strain CG1B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
  3. Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , The C. elegans Reseach Community. (2006).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
  6. Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , The C. elegans Reseach Community. (2005).
  7. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
  8. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
  9. Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  10. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  11. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  12. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
  13. Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
  14. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  15. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
  16. Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
  17. Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
  18. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
  19. Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
  20. Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
  21. Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).

Tags

علم الأعصاب، العدد 74، علم وظائف الأعضاء، الفيزياء الحيوية، بيولوجيا الأعصاب، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، علم التشريح، علم الأحياء التنموي، والهندسة الطبية الحيوية، والطب،
الكالسيوم <em>في الجسم الحي</em> التصوير الخلايا العصبية في <em>C. ايليجانس</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V.… More

Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. (74), e50357, doi:10.3791/50357 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter