In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

Summary

Med sin lille transparent legeme, veldokumenteret neuroanatomi og et væld af medgørlige genetiske teknikker og reagenser,

Abstract

The nematode worm C. elegans er en ideel model organisme for relativt enkle, billige neuronal billeddannelse in vivo. Dens lille gennemsigtig krop og enkle, velkarakteriseret nervesystem tillader identifikation og fluorescensimagografi af enhver neuron i det intakte dyr. Enkle immobiliseringsteknikker med minimal indvirkning på dyrets fysiologi giver udvidet time-lapse imaging. Udviklingen af genetisk kodede calciumfølsomme fluoroforer såsom Cameleon ¹ og GCaMP ² tillader in vivo billeddannelse af neuronal calcium om både celle fysiologi og neuronal aktivitet. Talrige transgene stammer, der udtrykker disse fluoroforer i specifikke neuroner er let tilgængelige eller kan konstrueres ved anvendelse velkendte teknikker. Her beskriver vi nærmere procedurer for måling af calcium dynamik inden for en enkelt neuron in vivo ved hjælp af både GCaMP og Cameleon. Vi diskuterer fordele og disadvantalder såvel såvel som forskellige fremgangsmåder til prøvefremstilling (animalsk immobilisering) og billedanalyse. Endelig præsenterer vi resultater fra to forsøg: 1) Anvendelse GCaMP at måle sensoriske reaktion af en bestemt neuron til et eksternt elektrisk felt og 2) Brug Cameleon at måle den fysiologiske calciumrespons af en neuron for traumatisk laser skader. Calcium billeddiagnostiske teknikker som disse er udbredt i C. elegans og er blevet udvidet til at omfatte målinger i frit bevægelige dyr, flere neuroner samtidigt og sammenligning på tværs af genetiske baggrunde. C. elegans præsenterer en robust og fleksibelt system til in vivo neuronal billeddannelse med fordele frem for andre modelsystemer i teknisk enkelhed og omkostninger.

Introduction

Her præsenterer vi praktiske metoder til in vivo calcium billeddannelse i C. elegans neuroner. Udviklingen af genetisk kodede calcium-følsomme fluoroforer med højt signal-støjforhold gør C. elegans en forholdsvis enkel og omkostningseffektiv system til måling af neurofysiologi og aktivitet. Vores billeddannelse sker med et standard sammensat mikroskop med bred felt fluorescensimagografi af almindeligt tilgængelige fluorophorer. Vi præsenterer flere teknikker anvender forskellige fluoroforer og forskellige sample præparater, diskuterer styrker og svagheder ved hver. Data så præsenteret fra to eksempler eksperimenter. En fremragende supplerende ressource på teknikkerne beskrevet her, kan findes i WormBook, "Imaging aktiviteten af neuroner og muskler" af R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

To store klasser af genetisktisk kodede fluorescerende calcium reportere er almindeligt anvendt i C. elegans: enkelt kanal GCaMP og FRET-baserede Cameleon. Vi vil beskrive metoder og vise eksempler på data genereret af hver.

GCaMP er baseret på en modificeret grønt fluorescerende protein (GFP), der er følsom over for det omgivende calciumkoncentration. Dette opnås ved fusion af GFP og den høje calcium affinitet protein calmodulin, således at bindingen af calcium fra calmodulin bringer GFP molekylet i en effektiv fluorescerende bekræftelse ^2. Den nylige fremskridt i disse fluorophorer genererer exceptionel signal størrelse med op til 500% stigning i fluorescensintensiteten over et fysiologisk område af calcium og rimeligt hurtig kinetik for ~ 95 msek stigetid og ~ 650 msek henfaldstid ^4. Over relativt korte perioder (minutter), kan disse store signaler giver mulighed for lavere opløsning billeddannelse (lavere forstørrelse), og da en artig initial basismåling, ophæve behovet for kontinuerlig baseline eller sammenlignende målinger.

Cameleon har den fordel, at et FRET-baseret fluorophor, der genererer en ratiometrisk måling sammenligning af to uafhængige kanaler eller bølgelængder ^1. Den består af to separate fluoroforer (cyan-og gul-emitterende fluorescerende proteiner, CFP og YFP) forbundet af en calmodulin-protein. Komplekset belyses med blåt lys (440 nm), der ophidser den fælles fiskeripolitik. Binding af calcium fører fluoroforer tættere på hinanden, hvilket øger fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) fra CFP (donor) til YFP (acceptor) og forårsager CFP emission (480 nm) at falde, og YFP emission (535 nm) for at øge . Relative niveauer af calcium måles som forholdet mellem den YFP / CFP intensitet. Cameleon kinetikken er langsommere end GCaMP, målt in vivo til at have en stigetid på ~ 1 sekund og en henfaldstid på ~ 3 sek ^5. Imidlertidforholdet mellem modsat bevægelige signaler forøger signalet størrelse og kompenserer for en række mulige artefakter som følge af ændringer i fluorophor koncentration, bevægelse eller fokus drift og blegning.

Genetisk kodede fluorescerende reportere ophæver meget af prøven nødvendige forberedelser med exogent administrerede sonder og C. elegans lille gennemsigtig krop giver billeddannelse i det intakte dyr ved hjælp af simple bredt felt fluorescens. Den største tekniske udfordring i prøveforberedelse er derfor for sikkert at immobilisere dyrene. Der findes en række forskellige almindeligt anvendte teknikker hver med fordele og ulemper. Anvendelse af et farmakologisk middel til at lamme dyrene er let at gennemføre og tillader montering af flere dyr på et præparat (Levamisol, en cholinerg agonist, der forårsager muskelvæv at gribe anvendes typisk ^6). C. elegans kan også fysisk immobiliseres ved at montere dempå stiv 10% agarose ^{7, 8.} Dette minimerer indvirkning på dyrs fysiologi, tillader langsigtet imaging (timer) og inddrivelse af flere dyr, men er mere teknisk vanskeligt. Begge disse teknikker begrænser fysisk adgang til dyr (som er under et dækglas) og kan derfor kun anvendes sammen med visse eksperimentelle stimuli (såsom lys, temperatur, elektrisk felt eller laser beskadigelse). For stimuli hvor fysisk adgang er påkrævet, såsom berøring eller administration af kemikalier, har mange studier med succes limet C. elegans på plads (ved hjælp af veterinære klasse lim) ^9. Dette er teknisk mere udfordrende, er et enkelt dyr forberedelse og tillader ikke dyr opsving. Endelig har adskillige mikrofluidenheder været ansat som fysisk begrænse C. elegans, kan bevare dyrs fysiologi, så udsættelse for de fleste typer af stimuli (afhængigt af enhedens design) og muliggøre hurtig udveksling og nyttiggørelse af dyrene

Fremgangsmåderne præsenteres her kan anvendes til at måle neuronal aktivitet og cellefysiologi i C. elegans. Vi giver et eksempel på hver: hjælp GCaMP at måle den sensoriske respons ASJ neuron til en ekstern elektrisk felt, og ved hjælp Cameleon at måle den fysiologiske calcium respons på laser beskadigelse af en neuron. Disse eksempler viser fordelene og ulemperne ved de to typer af fluoroforer og illustrerer, hvad der er muligt med systemet.

Protocol

1. Optisk Setup

1. Brug et standard sammensat mikroskop med epifluorescens billedbehandling kapaciteter. Vi bruger et Nikon Eclipse Ti-U omvendt mikroskop med en Intensilight HG illuminator.
2. For bedste billedkvalitet og signalkvalitet bruge en stor forstørrelse, høj numerisk apertur mål. Vi bruger typisk en Nikon X60 1,4 NA olieimmersionslinse mål. I nogle tilfælde er det muligt at anvende lavere forstørrelse (X40, X20) afhængigt af ekspressionsniveauet af fluoroforen og signalstyrke.
3. Anvende en høj følsomhed afkølet CCD-kamera, såsom et Andor Clara Camera at maksimere billede følsomhed og minimerer baggrundsstøjen.
4. For enkelt farve fluoroforer bruge standard mikroskop fluorescens filtersæt udformet til den bestemte bølgelængde af fluoroforen. For GCaMP bruge en standard GFP filtersæt er optimeret til excitation ved 488 nm og emission ved 525 nm. Ingen yderligere optiske ændringer er nødvendige.
figur 1.. Den består af:
1. Et mikroskop filter indstillet til 440 ± 20 nm excitationsfilter og 455 nm lang pass dichroisk spejl.
2. Et billede maske placeret ved den første billedplan umiddelbart uden for mikroskopet imaging port (hvor kameraet CCD-sensor vil normalt sidde). Dette begrænser synsfeltet, således at den vil udfylde kun halvdelen af ​​kamerasensoren. Placere denne maske ved det første billedplan resulterer i skarpe billeder grænser og ingen overlapning, når de to billeder projiceres side om side.
3. Den første relæ linse sætte en brændvidde væk fra tHan første billedplan, således at den kollimerer lyset.
4. En dichroic spejl, som deler lyset ind i de to separate billeddannende bølgelængder eller kanaler afspejler én farve (> 515 nm, gul), mens transmission den anden (<515 nm, cyan).
5. Emission filtre (båndpasfiltre) yderligere begrænser det transmitterede lys til de specifikke billeddiagnostiske bølgelængder (cyan til 485 ± 40 nm og gule på 535 ± 30 nm),
6. Det andet relæ linser (en for hver kanal) er anbragt i strålebaner, således at det genfokuserer lyset til et andet billedplan på CCD-kameraet.
7. Et par af spejle og et andet dichroisk spejl dirigerer strålebaner, således at de to billeder rekombineres og forventes side om side på kameraet CCD-sensor. 4A viser et eksempel på det resulterende billede.
5. Indledende Optisk Alignment: Start opsætning og tilpasning af optik med høj kontrast image med en lav forstørrelse linse og transmitteres bred felt lys belysning (en sort Sharpie trukket på et objektglas fungerer godt). Bringe billedet til at fokusere gennem mikroskopet okularer og skiftede derefter til mikroskopet port, der skal anvendes. Med høj lys belysning se billedet på et kartotekskort i den indledende fokalplan (et par cm udenfor mikroskop port). Anbring det første relæ linse (C) i strålegangen således, at det er en brændvidde fra den første brændplan og kollimerer lyset uden at afbøje strålens vej (dvs. er direkte centreret i strålegangen). Placere masken ved det første brændplan, justeret til at begrænse den halve synsfelt og frembringe en skarp grænse i billedet. Positionere spejlene og filtre (D, E, G), således at strålegangen er parallel med bordpladen og løber i to parallelle baner side om side, som vist i figur 1B. Center det andet relæ linser (F) i deres respektive strålebaner ogflytte dem frem og tilbage langs stier til at bringe billederne til et fokus på et kartotekskort placeret, var kameraet CCD-sensor vil være. Hvis det gøres korrekt, de to billeder skal være parfokalt med mikroskopet okularer og andre kameraindstillinger havne. Endelig placere kameraet i position og finjustere tilpasning.
6. Finindstilling Optisk Alignment: Brug dobbelt billede ses af CCD-kameraet for at finjustere den optiske justering. Brug et billede med høj kontrast og starte med lavere forstørrelse, at skifte til en højere forstørrelse til endelig justering. Anbring det overførte billede (cyan kanal i figur 1B) til at dække den ene halvdel af kameraets synsfelt ved at flytte kameraet i X og Y. Position det reflekterede billede (gul kanal i figur 1 B) for at dække den anden halvdel af området vis ved at justere de sidste to spejle (G) i strålegangen. Optimere fokus ved at flytte det andet relæ linse for hver kanal frem og tilbage langs strålevejen. Hvis venstreuforandret den optiske setup skal være stabilt og kræver kun sjælden finjustere justering.

2. Prøveforberedelse og Data Acquisition.

1. Erhverve dyr, der udtrykker en calciumsensitiv fluorofor i neuronet af interesse fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) eller andre kilder. Alternativt transgene dyr kan konstrueres ved anvendelse af standard C. elegans teknikker. Enkelt celle ekspression er ikke nødvendigt (og undertiden ikke ønskeligt, hvis flere neuroner skal undersøges, se ^12), så længe billeder og målinger fra flere celler kan let adskilles. Hvis fluorophor transgenet ikke er integreret i genomet, kan betydelig variation i ekspression forekommer fra dyr til dyr. I dette tilfælde forøger udvælgelse af dyr med højere ekspressionsniveauer ved anvendelse af en fluorescerende dissektionsmikroskop signal-til-støj-forhold og forbedrer målingerne. Fluorofor ekspressionsniveauer need er tilstrækkelig til let at kunne afbildes på kameraet under erhvervelse parametre, der kræves eksperimentet.
2. Gøre agarose puder, der er nødvendige for den ønskede immobilisering teknik (se 2,3 nedenfor) ved at trykke på en lille dråbe smeltet agarose mellem to glasplader afstand af to stykker laboratorie tape. Om nødvendigt kan agarose puder overføres til et glas-dækglas, før montering af dyrene. Se figur 2.
3. Immobilisere C. elegans til billeddannelse ved hjælp af en af følgende teknikker:
   1. Farmakologisk paralyzation: Tilføj 0,05% Levamisol til 2% agarose puder (blande det ind i den smeltede agarose før puderne i 2,2). Pick 5-10 dyr på puden og dække med et dækglas. Anvende små mængder af varm voks blanding (50% paraffinvoks og 50% vaseline) på hjørnerne af dækglasset for at holde den på plads. Tillad 5-10 min for Levamisol kan træde i kraft, og dyrene til become helt stille.
   2. Stiff Agarose Immobilisering: C. elegans kan fysisk immobiliseres ved hjælp af stive 10% agarose puder og 0,05 um diameter polystyren nanopartikler. Gør 10% agarose puder (10% agarose i NGM buffer efter vægt) som i 2,2. Tilføj ~ 3 pi bead opløsning (1:10 polystyrenmikrosfærer i NGM på volumenbasis) til toppen af ​​puden. Hurtigt, plukke 5-10 C. elegans i puljen af perle løsning på puden og forsigtigt dække med et dækglas. Anvender smeltet voks anvendes til hjørnerne af dækglasset for at holde den på plads. (For yderligere oplysninger om denne teknik se ⁷ samt en tidligere Jové artikel ⁸⁾
   3. Limning: C. elegans kan limes på plads ved hjælp af små mængder af veterinære klæbemiddel påføres den ene side af dyret.
   4. Mikrofluidenheder: Talrige mikrofluidenheder er designet til fysisk at holde C. elegans på plads til billeddannelse.
   </ Li>
4. Placer forberedte slide på mikroskopet og fokusere på den ønskede neuron. Det er ofte lettest at finde C. elegans med lyse felt belysning og lav forstørrelse. Så skift til høj forstørrelse og fluorescensimagografi at finde og fokusere på den særlige neuron.
5. Stimulus: Hvis en neuronal reaktion på en specifik stimulus ønskes (lys, elektrisk felt, gustatoriske og olfaktoriske signaler, temperatur osv.), skal stimulus apparatet være konstrueret ind i mikroskopet setup, således at det kan indgives til dyrene i prøveforberedelse mens billeddannelse.
6. Erhverve billeder ved hjælp af mikroskop CCD kamera. Eksponeringstider og excitationslys niveau vil afhænge af baseline signal og ekspressionsniveauet af fluoroforen, med svagere signaler kræver længere eksponeringstider med samstemmende mindre tidsopløsning. Vi bruger typisk ~ 300 msek eksponeringstider.
7. Erhverve billeder enten enkeltvis eller som en timig-bortfalde film. Fordi C. elegans neuroner generelt udviser langsomme aktivering dynamik (dvs. de mangler natriumbaserede virkningspotentialer), relativt langsomme frame rates på ~ 1 sek er ofte tilstrækkeligt at måle neuron dynamik. Erhvervelsesprocent op til ~ 90 frames per sekund er blevet anvendt selv om disse kan være begrænset af integrationstiden nødvendig for svag fluorescens. Individuelle film af en enkelt neuron kan nemt udvide i flere minutter (~ 5-10 min), eller længere, hvis immobiliseringen forberedelse er stabil og frame rate forholdsvis langsom.

3. Dataanalyse

1. Der er en række af forskellige fluorescerende billeddannelse softwarepakker til rådighed med dynamiske og ratiometrisk analyse kapaciteter herunder ImageJ og NIS-Elements. Vi anvender et simpelt brugerdefineret MATLAB program, der måler den gennemsnitlige fluorescerende signal over et udvalgt område af interesse.
2. For de enkelte billeder (eller time-lapse film, der forbliverhelt stille) vælge en region af interesse (ROI) i det afbildede neuron og et separat nærliggende region for baggrunden måling. For Ratiometrisk billeder vælge lignende ROI og baggrund regioner for hver af de to billeder.
3. Let bevægelse af det afbildede neuron inden for en time-lapse film kræver yderligere analyse til automatisk at vælge den ROI i hver ramme, hvilket kan opnås ved hjælp af talrige sporing af genstande ordninger. Vores program viser et komprimeret billede af alle billeder i filmen, hvorfra en ru grænse (som omfatter formålet med interesser i alle frames) er manuelt udvalgte og en uafhængig baggrund region valgt. For det første billede, er en ROI manuelt valgt blandt inden for grænsen region. For hver efterfølgende ramme, vælger programmet de lyseste pixels fra inden for grænseområdet at frembringe et ROI med den korrekte størrelse (dvs. det samme antal pixler som den manuelle første billede ROI). For billeder, hvor målt interesser er tilstrækkeligt lysere så den omkringliggende baggrund inden for grænsen regionen i denne protokol vælger en fornuftig ROI for hver ramme.
4. Det fluorescerende signal, F, for hver ramme beregnes som den gennemsnitlige pixelintensitet i ROI minus den gennemsnitlige intensitet i baggrunden region. Ratiometrisk værdier beregnes som forholdet mellem de to signaler (YFP-YFP _baggrund) / (CFP-CFP _baggrund) -0,65. Faktoren på 0,65 kompenserer for bløder gennem af FFP kanal i YFP-kanalen, hvilket vil være afhængig af de fluoroforer, samt den særlige filtersæt anvendes (denne værdi er typisk ~ 0,6 til Cameleon opsætninger).
5. Den relative calciumniveau for hver ramme beregnes som procent ændring i intensitet normaliseret til en første basisværdi målt fra den første ramme (eller serie rammer): bf / F = (F _(t)-Fo) / F _o, hvor F (t) er fluorescensen på tidspunkt t, og F _oer den indledende baseline-værdi.
6. En ROI udvælgelse cellelegemet frembringer de stærkeste mest robuste signaler, men det er også muligt at udvælge og måle signaler fra en ROI langs nerve processer.

4. Problemløsning

1. Blegning: Udsættelse for excitationslys kan forårsage blegning af fluoroforen og er præget af et støt fald i signal, der er afhængig af eksponeringsniveauer. Ratiometrisk målinger bidrage til at kompensere for dette. Men selektiv blegning af én bølgelængde kan stadig forekomme (typisk fælles fiskeripolitik blegemidler hurtigere derefter YFP). Hvis blegning opstår reducere lyseksponeringsniveau ved at reducere eksponeringstider og / eller excitationsintensitet (med neutralfiltre i belysningen pathway). Om nødvendigt kan man kompensere for blegning ved at køre simulerede retssager (med samme excitations-eksponering men ingen neuronal stimulus) og kvantificere tidskonstant signal henfald.
2. C.. elegans reagere på udsættelse for lys og eksperimentelle stimuli, hvilket gør dem mest tilbøjelige til at flytte på det tidspunkt, optagelsen. Lidt bevægelse kan indføre væsentlig støj i målingen, især når måling fra Axon processer. Ratiometrisk analyse hjælper med at afbøde disse virkninger til en vis grad og målinger fra cellen kroppen er mere robust. Omhyggelig udførelse og finjustering af flytningsrestriktionerne procedurer vil resultere i helt stille dyr.
3. Baggrund Selection: Omhyggelig udvælgelse af en baggrund regionen er nødvendig for en vellykket billedanalyse. Baggrund regioner bør være nogenlunde ensartet og mørkere end den afbildede neuron. Det må være tilstrækkelig langt til at undgå det spredte lys (og dermed pickup a signal) fra den billeddannede neuron. Vi finder en ensartet region 20-50 um fra ROI fungerer godt i de fleste tilfælde.
4. Ratiometrisk Optik: Korrekt opretning af den billeddannende optik er kritisk for generering af en klar dobbelt billede. Kommercielle mikroskop tilbehør til ratiometrisk billeddannelse er tilgængelige. En alternativ teknik er at anvende en hurtig sekventiel billeddannelse under anvendelse af en hurtig filterhjul til hurtigt at skifte mellem emissionsbølgelængder under optagelse separate billeder for hver.
5. Ratiometrisk analyse: Analysen beskrevet her er en forholdsvis simpel teknik, der frembringer robuste signaler i henhold til gennemsnittet over en ROI. Det kræver en genkendelig lyst motiv for at vælge ROI. Mere sofistikeret ratiometrisk analyse er mulig ved at afstemme og kortlægning af to billeder, således at det fluorescerende forhold kan beregnes pixel for pixel.

Representative Results

Her præsenterer vi resultater fra to separate forsøg. Den første anvender GCaMP at måle responsen af en specifik sensorisk neuron til en defineret ekstern stimulus, hvilket giver et godt eksempel på, hvordan fluorescerende calcium reportere kan anvendes til optisk at overvåge neuronal aktivitet i intakt C. elegans. Det andet anvender Cameleon at måle den intracellulære calcium transient udløst i en neuron som reaktion på specifikke laser beskadigelse, hvilket således illustrerer, hvordan calcium fysiologi kan måles i en enkelt celle in vivo. At fokusere på de tekniske aspekter af hver måling enkelte forsøgsresultater bliver præsenteret og drøftet i detaljer. Ofte den gennemsnitlige respons over tid (beregnet som den gennemsnitlige respons på hvert tidspunkt med hensyn til stimulus) eller en specifik parameter (såsom den gennemsnitlige amplitude af reaktionen) beregnes på tværs af talrige forsøg. Typisk 10-20 forsøg er nødvendige for at generere et acceptabelt gennemsnit måling, men thans nummer afhænger i iboende variabilitet svar. Sådanne dataanalyse til eksperimenterne beskrevet her kan findes i ^12.-13.

GCaMP måling af sensorisk reaktion: Når udsættes for et stærkt ydre elektrisk felt (≥ 3 V / cm), C. elegans aktivt kravle mod negative pol af feltet med præcis rettet bevægelse. Vi har tidligere vist, at denne electrotactic adfærd primært medieres af den venstre og højre ASJ neuroner, amphid sensoriske neuroner beliggende i dyrets hoved ^12. For at visualisere denne reaktion, vi brugte en transgen stamme udtrykker GCaMP3 specifikt i venstre og højre ASJ neuroner i henhold til GPA-9 promotor. Vi immobiliserede dyr til billeddannelse ved hjælp af agarose-puder indeholdende 0,05% Levamisol anbragt mellem to dækglas (som beskrevet i procedurerne). Det elektriske stimulus blev administreret under anvendelse af en specialbygget imaging kammer, der passer påtrin i et inverteret Nikon Ti mikroskop (se ^12). Kort fortalt er dækglasset præparatet anbringes (med snekken nedad) over et hul i en lille plast kammer hensyn til adgang for målene nedefra og standard billeddannelse gennem dækglasset. Kammeret blev fyldt med 0,25 mM NaCI og 50 mM glycerol-puffer, og det elektriske felt stimulus påføres under anvendelse af to platinelektroder foring ender af kammeret. Som beskrevet ovenfor er en enkelt ASJ neuron udtrykker CGaMP blev afbildet under anvendelse af en X100 1,4 NA olieimmersion objektiv og standard GFP filtersæt. En time-lapse film blev erhvervet for 80 sec (1 ramme / sek, 300 msek eksponeringstid), og underkaster det dyr, til en ekstern 3 V / cm elektrisk felt for tre separate forsøg hver varer 10 sekunder (fig. 3). Vi målte fluorescensintensitet ved cellelegemet hjælp af billedanalyse beskrevet ovenfor. Videoen viser mindre fejl af både bevægelse og fokus afdrift i løbet af forsøget. Den strength af GCaMP signalet forbliver robust men viser store a ~ 250% stigning i fluorescens som respons på både ^1. og ^3. stimuli. Resultatet af den anden stimuli reduceres væsentligt viser variabilitet i den neuronale respons. Blegning er minimal som tydeligt ved en tilbagevenden til en ensartet baseline niveau.

Cameleon måling af cellulært calcium fysiologi: Traumatisk cellebeskadigelse udløser et stort calcium transient inden for en neuron, der spiller en vigtig rolle i den fysiologiske reaktion dikterer cellulær skæbne (dvs. celledød vs initiering af reparationsprocesser). Vi kan måle denne skade-inducerede respons in vivo ved hjælp af en femtosekund laser til at adskille de enkelte C. elegans neuroner ¹⁴ samtidig måling af cellulært calcium signaler med Cameleon YC3.60 ^{13, 15.} Dyr, der udtrykker Cameleon YC3.60 i de seks mechanosensory neuroner (underMEC-4-promotor), blev immobiliseret under anvendelse af 10% agarose og polystyren nanopartikler, som beskrevet i procedurerne. Vi anvendte to billeddannende optik til at optage signaler fra både FFP og YFP fluorescenskanaler som beskrevet i procedurerne. Vi filmede en enkelt ALM neuron og laser målrettet Axon ~ 20 um fra cellen kroppen (figur 4A). Axon blev afbrudt af en kort (<1 sek) udsættelse for lys fra en femtosekund pulseret infrarød laser fokuseret på målet punkt langs Axon af imaging formål (jf. ¹³ for yderligere oplysninger om laser kirurgi). Time-lapse billeder med en ramme hver 3 sec, med 400 msek eksponeringstider blev registreret for 320 sek, mens de udfører laser kirurgi og calciumniveauer beregnet ved hjælp ratiometrisk analyse.

Signaler blev målt uafhængigt ved cellelegemet (fig. 4B) og for axon-segmentet inden for 5 um i skæringspunkt (figur 4C). Tallene viser både CFP og YFP intensiteter og den resulterende FRET ratio. Målingen på cellen kroppen er velopdragen med den fælles fiskeripolitik hastigt faldende, og YFP stigende som reaktion på laser skader ved t = 0 sek (rød pil). Dette resulterer i en øjeblikkelig ~ 200% stigning i ratiometrisk signal (bf / F), der opretholdes i ~ 90 sek, før det faldt tilbage til tæt på baseline niveauer. Blegning er minimal som det fremgår af den konsekvente baseline.

I Axon segment tæt på det skæringspunkt, varierer den lokale mængde af fluorofor i løbet af eksperimentet, hvilket komplicerer signalet. Laser kirurgi skærer Axon og kortvarigt sprænger membranen, så fluorofor at undslippe og midlertidig nedsættelse af det lokale cytoplasmatisk koncentration. Dette fremgår af en indledende nedgang i YFP spor i figur 4C og en sammenligning af Axon segment nær skaden punkt i YFP billeder på tidspunkter t = 0 sec, og t = 6 sek, Figur 4A. At later tidspunkter, den adskilte ende svulmer som led i sin fortsatte helbredelse, hvilket resulterer i mere lokaliseret fluorofor og en stigning i intensitet. Dette er mest tydeligt i langsomt voksende fælles fiskeripolitik spor i figur 4C og en sammenligning af Axon segment i den fælles fiskeripolitik billeder på tidspunkter t = 0 sek og t = 270 sek, figur 4A. Men disse forskelle berører begge kanaler ens, og det FRET forholdet effektivt kompenserer. Den resulterende måling viste en reaktion svarende til cellelegemet med en øjeblikkelig ~ 150% stigning i signal (bf / F), en dramatisk opsving i nærheden af ​​basislinien ved ~ 90 sekunder og derefter en yderligere mindre sekundære respons ved ~ 150 sek. Den ratiometrisk analyse er kritisk for denne måling, som det ville være yderst vanskeligt at adskille calcium signal fra de andre virkninger, som kan variere meget fra neuron til neuron og kirurgi til kirurgi. Axon signal har mere støj forhold til cellelegemet signalet primært lysdæmper fluorescens ogden mindre ROI i det snævrere axon.

Figur 1. Grundlæggende opsætning og ratiometrisk optik. A) Fotografiet viser den eksperimentelle opsætning bestående af en inverteret forbindelse mikroskop og Ratiometrisk billeddannende optik. B) En skematisk diagram, der illustrerer de billeddannende optik, der er nødvendige for ratiometrisk FRET-baserede målinger. Billedet er opdelt i de to bølgelængder eller kanaler, som bliver projiceret side om side på CCD-arrayet.

Figur 2. Prøveforberedelse. C. elegans er monteret på tynde agarose puder til billeddannelse. A) agarose puder er lavet af sandwiching en lille dråbesmeltede agarose mellem to mikroskop-objektglas adskilt af to stykker laboratorieudstyr tape. B) Dyr der overføres på agarose-pude og dækket med et dækglas, holdt på plads med en lille mængde voks ved hvert af de fire hjørner.

Figur 3. GCaMP eksempel data. The GCaMP signal, bf / F, registreres in vivo fra cellen legeme ASJ neuron reagere på en alternerende on / off elektrisk felt (grøn spor). Tykke grå linjer indikerer perioder, hvor det ydre elektrisk felt (3 v / cm) blev anvendt til dyret. Scale bar repræsenterer 100% stigning i fluorescensintensitet.

Figur 4. Cameleon eksempel data. A) Tre separate rammer viser den dobbelte billedevis en ALM neuron før og efter laserkirurgi af axon 20 um fra cellelegemet. Den røde pil i midten panelet angiver skrab punkt. Det nederste panel viser cellelegemet og Axon segmentet producerer signalerne i B og C. B) Cameleon YC3.60 signalet målt ved cellelegeme af ALM neuron før og efter laserkirurgi (rød pil). C) Cameleon YC3 0,60 signal målt ved Axon segmentet inden for 5 um slettepunktet før og efter laserkirurgi. Gule spor tyder YFP signaler, blå spor angiver den fælles fiskeripolitik signaler og orange spor er den resulterende FRET forholdet. Alle tider er i forhold til tid af laser kirurgi. Skala søjler repræsenterer en 100% stigning i fluorescensintensitet. Klik her for at se større figur .

Discussion

Genetisk kodede calcium indikatorer er blevet almindeligt anvendt i C. elegans neurobiologi. Adskillige grupper har anvendt disse teknikker til at studere reaktion af primære sensoriske neuroner på eksterne stimuli som vist her med ASJ reaktion på et elektrisk felt. Fremtrædende eksempler indbefatter fornemmelse af mekanisk kontakt, særlige kemikalier, temperatur og et elektrisk felt ^{12, 16-19.} Aktivitet af interneuron og muskelceller er også overvåges både som respons på stimuli og på kontrol af dyrenes adfærd. Mange af disse undersøgelser har skubbet disse teknikker et skridt videre ved hjælp af billedgenkendelse og tracking teknikker til at aktivere optagelse fra neuroner i delvis fastholdes eller endog frit flytte dyr samt optagelse fra flere neuroner samtidigt. Yderligere undersøgelser har undersøgt andre aspekter af calcium fysiologi, såsom reaktion på neuronbeskadigelse ^{13, 20} som beskrevet her, såvel somneuronal degeneration på længere tidsskalaer ^21.

Ved udformningen af ​​et bestemt eksperiment, skal hver af de alternative teknikker vedrørende almindeligt anvendte calcium journalister og dyr immobilisering overvejes nøje. Immobiliseringsteknikker vil blive dikteret af tekniske aspekter såsom behovet for fysisk adgang til dyret, evnen til at inddrive forsøgsdyr efter billeddannelse eller behovet for high throughput. Forskellige fluorescerende calcium reportere har specifikke fordele og ulemper så godt. GCaMP anvender ligetil enkelt kanal billedanalyse og det store signal-støj-forhold gør det gælder for mange situationer. Cameleon på den anden side kræver mere kompleks billedbehandling og-analyse, men den resulterende ratiometrisk måling kan være kritisk i situationer med potentielt store artefakter. For eksempel kan ændringer i mængden af ​​fluorofor (som i laser skader eksempel) også forekomme over lange tidsperioder(Timer) på grund af ændringer i ekspressionsniveauer. Yderligere dual billeddannende strategier er også mulige, såsom GCaMP co-udtrykkes med (eller fysisk bundet til) en RFP fluorofor. Selvom det ikke er FRET-baserede dette ville drage fordel af den store dynamikområde af moderne GCaMP varianter, mens du bruger den røde kanal som en real-time basismåling.

Det er vigtigt at bemærke, at talrige to-kanals billeddannende mikroskop systemer og analysesoftware er kommercielt tilgængelige som, selv ofte dyrere, kan være attraktivt for forskere modvillige til konstruktion af hjem bygget ordningen. Kommercielle dobbelt billeddannende systemer (DualView2-DV2, Photometrics) typisk bruge optik ligner vores hjem bygget system, men er indeholdt i en enkelt mikroskop vedhæftet fil med standardiserede tilpasning procedurer. Alternativt kan hurtigt filter udveksle systemer (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) mulighed for hurtig real-time sekventiel billeddannelse af to farvekanaler without yderligere billeddannende optik, men også dyre og kræver præcis synkronisering mellem filteret udveksling og kameraet købet.

Sammenfattende C. elegans viser en række fordele som et in vivo imaging system. De genetisk kodede fluoroforer har ofte cellespecifik og kan eliminere behovet for injektion eller indgivelse af eksogene fluoroforer. C. elegans optisk tilgængelighed tillader billeddannelse inden for intakte dyr, der er nemme og omkostningseffektivt at opretholde, ikke kræver kompliceret dissektion eller neuronal dyrkning og bevare celle fysiologi. Desuden C. elegans har store muligheder for genetisk analyse med et stort antal af tilgængelige genetiske reagenser og veletablerede teknikker. Der er naturligvis ulemper til systemet, den primære bekymring måske er at det er en invertebrat. Desuden rapporterer fluoroforer relative ændringer i calciumkoncentration rather end en absolut værdi og tidsopløsningen af ​​målinger kan begrænses af både dynamikken i fluoroforen, men også de nødvendige integrationstider af svage fluorescenssignaler. Endelig, mens calcium er en integreret del af neuronal aktivitet og signalering fluoroforerne ikke direkte rapporterer membranen spændingspotentiale målt med elektrofysiologiske teknikker. Alligevel illustreret ved de procedurer, der fremlægges her, C. elegans er en attraktiv forholdsvis enkel, omkostningseffektiv for en bred vifte af neuronale billeddannelse undersøgelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B