Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

Published: April 10, 2013 doi: 10.3791/50357
* These authors contributed equally

Summary

Met zijn kleine transparante lichaam, goed gedocumenteerde neuroanatomie en een groot aantal vatbaar genetische technieken en reagentia,

Abstract

De nematode worm C. elegans is een ideaal modelorganisme voor relatief eenvoudige, goedkope neuronale imaging in vivo. Zijn kleine transparante lichaam en eenvoudig, goed gekarakteriseerde zenuwstelsel maakt de identificatie en fluorescentie beeldvorming van een neuron in het intacte dier. Eenvoudige immobilisatie technieken met minimale impact op de fysiologie van het dier kunnen langere time-lapse imaging. De ontwikkeling van genetisch gecodeerde calcium gevoelige fluoroforen zoals cameleon 1 en 2 laten GCaMP in vivo beeldvorming van neuronale calcium worden zowel celfysiologie en neuronale activiteit. Talrijke transgene stammen die deze specifieke fluoroforen in neuronen gemakkelijk verkrijgbaar of kunnen worden geconstrueerd met gevestigde technieken. We beschrijven gedetailleerde procedures voor het meten van calcium dynamiek van een neuron in vivo in zowel GCaMP en cameleon. We bespreken voordelen en disadvantleeftijd waarop en verschillende werkwijzen van monstervoorbereiding (dier immobilisatie) en beeldanalyse. Tenslotte presenteren we de resultaten van twee experimenten: 1) Gebruik GCaMP de sensorische respons van een bepaald neuron aan een extern elektrisch veld en 2) Met Cameleon de fysiologische reactie van een calcium neuron traumatische beschadiging laser meten. Calcium beeldvormingstechnieken zoals deze worden veel gebruikt in C. elegans en zijn uitgebreid tot metingen in vrij bewegende dieren, meerdere neuronen tegelijk en vergelijking tussen genetische achtergronden. C. elegans presenteert een robuust en flexibel systeem voor in vivo neuronale beeldvorming met voordelen ten opzichte van andere modelsystemen in technische eenvoud en kosten.

Introduction

Hier presenteren we praktische methoden voor in vivo calcium beeldvorming in C. elegans neuronen. De ontwikkeling van genetisch gecodeerde calcium-gevoelige fluoroforen met een hoge signaal-ruisverhouding wordt C. elegans een relatief eenvoudig en kostenbesparend systeem voor het meten van de neurofysiologie en activiteit. Onze beeldvorming wordt gedaan met een standaard samengestelde microscoop met behulp van wide-field fluorescentie beeldvorming van de algemeen beschikbare fluoroforen. We presenteren verschillende technieken inzet van verschillende fluoroforen en verschillende monster voorbereiding, het bespreken van de sterke en zwakke punten van elk. Gegevens worden gepresenteerd op twee voorbeeldexperimenten. Een uitstekende extra bron op de hier beschreven technieken zijn te vinden in WormBook, "Beeldvorming van de activiteit van neuronen en spieren" door R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) 3.

Twee belangrijke klassen van genetischautomatisch gecodeerd fluorescerende calcium reporters worden vaak gebruikt in C. elegans: een kanaal GCaMP en FRET-gebaseerde cameleon. Beschrijven we methoden en tonen voorbeelden voor gegevens die zijn gegenereerd door elk.

GCaMP is gebaseerd op een gemodificeerd Green Fluorescent Protein (GFP) die gevoelig is voor de omringende calciumconcentratie. Dit wordt bereikt door fusie van GFP en de hoge affiniteit calcium eiwit calmoduline, zodat de binding van calcium door calmodulin de GFP molecuul brengt in een efficiënte fluorescerende bevestiging 2. De recente ontwikkelingen in deze fluoroforen genereren uitzonderlijke signaal formaat met tot 500% toename van de fluorescentie-intensiteit over een fysiologische bereik van calcium niveaus en redelijk snel kinetiek van ~ 95 msec stijgtijd en ~ 650 msec decay tijd 4. Over relatief korte perioden (minuten), kan deze grote signalen zorgen voor lagere resolutie imaging (lagere vergroting) en, gegeven een goed opgevoede initial nulmeting, ontkennen de noodzaak van permanente basislijn of vergelijkende metingen.

Cameleon heeft het voordeel dat een FRET-gebaseerde fluorofoor die een ratiometrische meting vergelijken van twee onafhankelijke kanalen of golflengten 1 genereert. Het bestaat uit twee fluoroforen (cyaan-en gele-emitterende fluorescerende eiwitten, CFP en YFP) verbonden door een calmoduline eiwit. Het complex is verlicht met blauw licht (440 nm) dat het GVB prikkelt. Binding van calcium brengt de fluoroforen dichter bij elkaar, waardoor fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET) van de CFP (donor) de YFP (acceptor) en waardoor de emissie CFP (480 nm) en neemt de emissie YFP (535 nm) om het . Relatieve calciumgehalte gemeten als de verhouding van de YFP / CFP intensiteit. Cameleon kinetiek langzamer dan GCaMP, gemeten in vivo een stijgtijd van ~ 1 sec en een vervaltijd van 3 sec 5 hebben. Echterde verhouding van tegengesteld bewegende signalen verhoogt de signaalgrootte en compenseert een aantal mogelijke artefacten als gevolg van veranderingen in fluorofoor concentratie beweging of aandacht drift en bleken.

Genetisch gecodeerd fluorescerende verslaggevers ontkennen veel van de monstervoorbereiding vereist met exogeen toegediende sondes en C. elegans kleine transparant lichaam maakt beeldvorming binnen de intacte dier met behulp van eenvoudige brede veld fluorescentie. De belangrijkste technische uitdaging in monstervoorbereiding is dan ook om veilig te immobiliseren de dieren. Er zijn een aantal verschillende algemeen gebruikte technieken elk met voor-en nadelen. Met een farmacologisch middel om de dieren verlammen is eenvoudig te implementeren, de bevestiging van meerdere dieren een preparaat (Levamisol, een cholinerge agonist die spierweefsel veroorzaakt grijpen om wordt meestal gebruikt 6). C. elegans kan ook fysiek inactief worden gemaakt door ze aan te koppelenop stijve 10% agarose 7, 8. Dit minimaliseert impact op de dierlijke fysiologie, laat de lange termijn beeldvorming (uur) en het herstel van meerdere dieren, maar is meer technisch moeilijk. Beide technieken de fysieke toegang tot de dieren (die onder een dekglas) en kan daarom alleen worden gebruikt met bepaalde experimentele stimuli (zoals licht, temperatuur, elektrisch veld of laser schade). Voor stimuli waar fysieke toegang nodig is, zoals aanraking of toediening van chemicaliën, hebben vele studies met succes geplakt C. elegans op zijn plaats (met behulp van veterinaire graad lijm) 9. Dit is technisch meer uitdagende, is een enkel dier voorbereiding en staat niet toe dat dierlijke herstel. Ten slotte hebben talloze microfluïdische apparaten in dienst die fysiek C. beperken elegans, kan het behoud van dierfysiologie, waardoor de blootstelling aan de meeste soorten stimuli (afhankelijk van het apparaat ontwerp) en maken een snelle uitwisseling en herstel van de dieren

De hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om neuronale activiteit en celfysiologie in C. meten elegans. We geven een voorbeeld van elk: GCaMP met de sensorische respons van de ASJ neuron een extern elektrisch veld meten, en het gebruik Cameleon de fysiologische reactie op calcium laser schade van neuron meten. Deze voorbeelden tonen de voordelen en nadelen van de twee soorten fluoroforen en illustreren wat mogelijk is met het systeem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optische Setup

  1. Gebruik een standaard samengestelde microscoop met epifluorescentie imaging-mogelijkheden. We maken gebruik van een Nikon Eclipse Ti-U omgekeerde microscoop met een Intensilight HG Illuminator.
  2. Voor de beste beeld-en signaalkwaliteit gebruik maken van een hoge vergroting, hoge numerieke apertuur doelstelling. Wij gebruiken meestal een Nikon X60 1,4 NA olie-immersie objectief. In sommige gevallen is het mogelijk om kleinere vergroting gebruiken (X40, X20) afhankelijk van het expressieniveau van de fluorofoor en de signaalsterkte.
  3. Gebruik een hoge gevoeligheid gekoelde CCD camera, zoals een Andor Clara Camera om beeld gevoeligheid maximaliseren en minimaliseren achtergrondgeluiden.
  4. Voor enkele kleur fluoroforen gebruik maken van de standaard microscoop fluorescentie filter in te stellen ontworpen voor de specifieke golflengte van de fluorofoor. Voor GCaMP een standaard GFP-filter ingesteld geoptimaliseerd voor excitatie bij 488 nm en emissie bij 525 nm. Geen verdere optische aanpassingen nodig zijn.
  5. figuur 1. Het bestaat uit:
    1. Een microscoop filter in te stellen met 440 ± 20 nm excitatiefilter en 455 nm lang voorbij dichroïsche spiegel.
    2. Een beeldmasker geplaatst op de eerste beeldvlak direct buiten de microscoop imaging-poort (waar de camera CCD-sensor normaal zou gaan zitten). Dit beperkt het gezichtsveld zodanig zijn dat het slechts de helft van de camerasensor vullen. Het plaatsen van dit masker bij het eerste beeldvlak resultaten in scherp beeld randen en geen overlap wanneer de twee beelden naast elkaar geprojecteerd.
    3. De eerste relais lens ingesteld een brandpuntsafstand weg van thij de eerste beeldvlak zodanig dat het licht collimeert.
    4. Een dichroïsche spiegel die het licht splitst in de twee afzonderlijke imaging golflengten of kanalen reflecterende een kleur (> 515 nm, geel) tijdens het zenden de andere (<515 nm, cyaan).
    5. Emissiefilters (banddoorlaatfilters) verder beperken doorgelaten licht de specifieke imaging golflengten (cyaan op 485 ± 40 nm en geel 535 ± 30 nm),
    6. Het tweede relais lenzen (een voor elk kanaal) geplaatst in de straalpaden zodanig dat het licht kerndoel een tweede beeldvlak bij de CCD camera.
    7. Een paar spiegels en een tweede dichroïsche spiegel richt de bundel paden zodanig dat de twee beelden gerecombineerd en worden geprojecteerd side-by-side op de camera CCD sensor. Figuur 4A toont een voorbeeld van het resultaat.
  6. Eerste optische uitlijning: Start setup en uitlijning van de optiek met een hoog contrast image het gebruik van een lage vergroting lens en verzonden wide-field verlichting (een zwarte fijnschrijver getekend op een microscoopglaasje werkt goed). Breng het beeld te richten door de microscoop oculair en vervolgens in de microscoop te gebruiken poort. Met hoge licht verlichting geven het beeld op een index-kaart bij de eerste focal plane (een paar cm buiten de microscoop poort). Plaats de eerste relais lens (C) in de stralengang zodat het een brandpuntsafstand van de eerste brandvlak en collimeert het licht terwijl niet afbuigen van de stralengang (dus direct gecentreerd in de stralengang). Plaats het masker in het eerste brandvlak aangepast aan half het gezichtsveld beperken en een scherpe grens te produceren in het beeld. Plaats de spiegels en filters (D, E, G) zodat de stralengang evenwijdig blijft aan het tafelblad en loopt in twee parallelle trajecten side-by-side, zoals getoond in figuur 1B. Centreer de tweede relais lenzen (F) in hun bundel paden enbewegen ze heen en weer langs de paden naar de foto's tot een focus op een index-kaart geplaatst waren de camera CCD-sensor zal zijn. Als dit juist gebeurt de twee beelden moeten parfocaal met de microscoop oculair en andere camera-poorten. Tot slot plaatst u de camera in positie en fine-tunen van de uitlijning.
  7. Fine Tuning Optische uitlijning: Gebruik de dubbele beeld bekeken door de CCD-camera te fine-tunen van de optische uitlijning. Gebruik een hoog contrast beeld en beginnen met een lagere vergroting, overschakelen naar een hogere vergroting voor de definitieve uitlijning. Plaats het doorgezonden beeld (cyaan kanaal in Figuur 1B) de helft van het gezichtsveld van de camera gezien dekken door de camera in X en Y. Position het spiegelbeeld (gele kanaal in figuur 1B) op de andere helft van het gebied van dekking bekijken door aanpassing van de laatste twee spiegels (G) in de stralengang. Optimaliseer richten door het bewegen van het tweede relais lens voor elk kanaal heen en weer langs de stralengang. Indien verlatenonveranderd de optische opstelling moet stabiel en vereisen slechts zelden fijnafstemming aanpassing.

2. Monstervoorbereiding and Data Acquisition.

  1. Acquire dieren uitdrukken van een calcium gevoelige fluorofoor in het neuron van belangstelling van de Caenorhabditis Genetics Center (CGC) of andere bronnen. Als alternatief kunnen transgene dieren worden geconstrueerd met behulp van standaard C. elegans technieken. Single cell expressie niet nodig (en soms wenselijk dat meerdere neuronen worden onderzocht, zie 12) zolang afbeeldingen en metingen uit meerdere cellen kan gemakkelijk worden gescheiden. Als de fluorofoor transgen is niet geïntegreerd in het genoom, kan sterk uiteenlopen expressie komen van dier tot dier. In dit geval voorselectie dieren met hogere expressie gebruikmaking van een fluorescentie dissectiemicroscoop betere signaal-ruisverhouding en verbetert de metingen. Fluorofoor expressie niveaus need toereikend gemakkelijk worden afgebeeld met de camera onder verkrijging parameters die door de experiment.
  2. Maak de agarose pads voor de gewenste immobilisatietechniek (zie 2.3) door een kleine druppel gesmolten agarose tussen twee glasplaatjes gescheiden door twee stukken laboratorium tape. Indien nodig kan agarose pads worden overgebracht naar een glazen dekglaasje alvorens de dieren. Zie Figuur 2.
  3. Immobiliseren C. elegans voor beeldvorming via een van de volgende technieken:
    1. Farmacologische Paralyzation: Voeg 0,05% Levamisol tot 2% agarose pads (mengen in de gesmolten agarose voordat u de pads in 2.2). Neem 5 tot 10 dieren op het pad en dek af met een deksel slip. Breng een kleine hoeveelheid warm was mengsel (50% paraffine en 50% vaseline) de hoeken van het dekglaasje te houden deze vast. Laat 5-10 minuten voor de Levamisol van kracht en de dieren nemen naar become volledig stil.
    2. Stiff Agarose Immobilisatie: C. elegans kan fysiek worden geïmmobiliseerd met behulp van stijve 10% agarose pads en 0,05 micrometer diameter polystyreen nanodeeltjes. Maken 10% agarose pads (10% agarose in NGM buffer gewicht) als in 2.2. Voeg ~ 3 pl bead oplossing (1:10 polystyreen microsferen in NGM volume) aan de bovenkant van de pad. Snel, pak 5 tot 10 C. elegans in het zwembad van de kraal oplossing op de pad en voorzichtig te bedekken met een dekglas. Gebruik gesmolten was toegepast op de hoeken van het dekglaasje te houden deze vast. (Zie voor meer informatie over deze techniek 7, alsook een eerder Jove artikel 8)
    3. Lijmen: C. elegans worden gelijmd met kleine hoeveelheden veterinaire kwaliteit lijm aangebracht op een zijde van het dier.
    4. Microfluïdische apparaten: Tal van microfluïdische apparaten zijn ontworpen om fysiek te houden C. elegans op zijn plaats voor de beeldvorming.
    </ Li>
  4. Plaats de voorbereide dia op de microscoop en de focus op de gewenste neuron. Vaak is het makkelijkst te vinden C. elegans met helderveld verlichting en lage vergroting. Over te schakelen naar een hoge vergroting en fluorescentie beeldvorming te vinden en zich richten op de specifieke neuron.
  5. Stimulus: Als een neuronale reactie op een specifieke stimulus gewenst (licht, elektrisch veld, smaak-en olfactorische signalen, temperatuur enz.) moet de stimulus inrichting worden ontworpen in de microscoop setup, zodat het kan worden toegediend aan de dieren in de monstervoorbereiding terwijl beeldvorming.
  6. Acquire beelden met behulp van de microscoop CCD-camera. Belichtingstijden en excitatielicht niveau zal afhangen van de basislijn signaal en het expressieniveau van de fluorofoor, bij zwakkere signalen die een langere belichtingstijden met concordantly minder tijdsresolutie. Wij gebruiken meestal ~ 300 msec belichtingstijden.
  7. Acquire beelden hetzij individueel, hetzij als een time-Lapse-film. Omdat C. elegans neuronen algemeen langzaam activering dynamiek (dwz ze missen natrium gebaseerd actiepotentialen) weer te geven, relatief langzame frame rates van ~ 1 sec zijn vaak voldoende om neuron dynamiek te meten. Overname rates tot ongeveer 90 frames per seconde werden gebruikt hoewel deze kan worden beperkt door de integratietijd nodig zwakke fluorescentie. Afzonderlijke films van een neuron kan eenvoudig uitbreiden enkele minuten (~ 5-10 min) of langer indien de immobilisatie preparaat is stabiel en de framesnelheid relatief traag.

3. Data-analyse

  1. Er zijn een aantal verschillende fluorescerende beeldvorming software pakketten beschikbaar met dynamische en ratiometrisch analyse mogelijkheden, waaronder ImageJ en NOS-Elements. We gebruiken een eenvoudige aangepaste MATLAB programma dat de gemiddelde fluorescent signaal over een geselecteerd gebied van belang meet.
  2. Voor individuele beelden (of time-lapse filmpjes die blijvenonbeweeglijk) selecteer een gebied van belang (ROI) in de belichte neuron en een aparte nabijgelegen regio voor achtergrondmeting. Voor ratiometrische vergelijkbare beelden te selecteren en achtergrond ROI's voor elk van de dubbele beelden.
  3. Een lichte beweging van de afgebeelde neuron binnen een time-lapse film vereist aanvullende analyse om automatisch de ROI in elk frame, die kan worden bereikt met behulp van tal van object tracking systemen. Ons programma geeft een gecomprimeerd beeld van alle beelden in de film waar een ruwe grens (omvat het doel van belangen in alle frames) handmatig is geselecteerd en een onafhankelijke achtergrond regio geselecteerd. Voor het eerste frame, wordt een ROI handmatig vanuit het grensgebied. Voor elk volgend frame, het programma selecteert de helderste pixels binnen het grensgebied genereren van een ROI van de juiste grootte (dwz hetzelfde aantal pixels als de manuele eerste frame ROI). Voor afbeeldingen waar de doelstelt van belang is voldoende helderder dan de omringende achtergrond binnen het grensgebied dit protocol selecteert een redelijke ROI voor elk frame.
  4. Het fluorescentiesignaal, F voor elk frame wordt berekend als het gemiddelde pixelintensiteit in het ROI minus de gemiddelde intensiteit op de achtergrond regio. Ratiometrische waarden worden berekend als de verhouding van de twee signalen (YFP-YFP achtergrond) / (CFP CFP-achtergrond) -0,65. De factor van 0,65 compenseert bloeden door de GVB kanaal in het kanaal YFP, die afhankelijk van de fluoroforen en de specifieke set filter gebruikt (deze waarde is waarschijnlijk ~ 0,6 voor cameleon setups) zijn.
  5. De relatieve calcium voor elk frame berekend als het percentage verandering in intensiteit genormaliseerd tot een nulmeting gemeten vanaf het eerste frame (of een reeks frames): AF / F = (F (t)-F o) / F o, waarin F (t) de fluorescentie op tijdstip t en F ois de initiële uitgangswaarde.
  6. Een ROI selecteren cellichaam genereert de sterkste signalen meest robuuste maar het is ook mogelijk om signalen te meten en een ROI langs de zenuw processen.

4. Problemen oplossen

  1. Bleken: Blootstelling aan excitatielicht kan bleken van de fluorofoor en wordt gekenmerkt door een gestage afname in signaal dat afhankelijk is van blootstelling. Ratiometrisch metingen helpen om dit te compenseren. Maar selectief bleken van een golflengte kan nog steeds optreden (meestal GVB bleekmiddelen sneller dan YFP). Als het bleken gebeurt verminderen van de blootstelling aan licht niveau door het verminderen van de blootstelling tijden en / of excitatie-intensiteit (met grijsfilters in de verlichting route). Indien nodig kan men compenseren bleken door het uitvoeren schijnprocessen (dezelfde excitatie blootstelling maar neuronale stimulus) en kwantificeren van de tijdconstante van signaal verval.
  2. C.. elegans reageren belichting en experimentele stimuli, waardoor ze waarschijnlijk te bewegen op het moment van opname. Lichte beweging kan voor belangrijke ruis in de metingen vooral bij het meten van de axon processen. Ratiometrische analyse helpt om deze effecten te verminderen enigszins en metingen van het cellichaam robuuster zijn. Zorgvuldige uitvoering en verfijning van de immobilisatie procedures zal leiden tot volledig stil dieren.
  3. Selectie achtergrond: Zorgvuldige selectie van een achtergrond regio is nodig voor een succesvolle beeldanalyse. Achtergrond regio's moet redelijk uniform en donkerder dan de afgebeelde neuron. Het moet voldoende worden verwijderd verstrooide licht (en dus pickup een signaal) van de afgebeelde neuron voorkomen. We vinden een uniforme regio twintig-vijf0 micron van de ROI werkt goed in de meeste gevallen.
  4. Ratiometrisch Optiek: correcte uitlijning van de imaging optiek is van cruciaal belang voor het genereren van een duidelijke dubbele beeld. Commerciële microscoop hulpstukken voor ratiometrisch beeldvorming zijn beschikbaar. Een alternatieve techniek is het gebruik van een snelle sequentiële beeldvorming met behulp van een snelle filterwiel snel schakelen tussen emissiegolflengten tijdens het opnemen van afzonderlijke beelden voor elk.
  5. Ratiometrische analyse: De analyse hier beschreven is een relatief eenvoudige techniek die sterke signaal genereert op grond van gemiddelde over een ROI. Het vereist een herkenbaar helder object te selecteren de ROI. Verfijndere ratiometrische analyse kan door aanpassing nauwkeurig in kaart brengen en de dubbele beelden zodanig dat de fluorescerende verhouding kan worden berekend pixel voor pixel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wij presenteren resultaten van twee afzonderlijke experimenten. De eerste werk GCaMP de reactie van een specifieke sensorische neuron naar een gedefinieerde externe stimulus te meten, wat een goed voorbeeld van hoe fluorescente calcium reporters kan worden gebruikt om optisch monitoren neuronale activiteit intact C. elegans. De tweede dienst cameleon het meten van de intracellulaire calcium voorbijgaande geactiveerd bij een neuron in antwoord op specifieke laser schade Dit illustreert hoe calcium fysiologie kan worden gemeten binnen een cel in vivo. Te richten op de technische aspecten van elke meting de individuele studieresultaten worden gepresenteerd en besproken. Vaak gemiddelde response tijd (berekend als het gemiddelde respons op elk tijdstip ten opzichte van de stimulus) een specifieke metriek (zoals de gemiddelde amplitude van de respons) worden berekend over verschillende proeven. Typisch 10-20 trials nodig zijn om een ​​acceptabele gemiddelde meting genereren, maar tzijn nummer afhankelijk van de inherente variabiliteit van de respons. Dergelijke gegevensanalyse voor de experimenten hier besproken worden gevonden in 12 en 13.

GCaMP meting van sensorische respons: Bij blootstelling aan een sterk extern elektrisch veld (≥ 3 V / cm), C. elegans actief kruipen in de richting van de negatieve pool van het veld met nauwkeurige gerichte beweging. We toonden eerder aan dat dit gedrag electrotactic voornamelijk wordt bemiddeld door de linker en rechter ASJ neuronen, sensorische neuronen amphid in hoofd van het dier 12. Deze reactie visualiseren we een transgene stam die GCaMP3 specifiek in de linker en rechter ASJ neuronen onder GPA-9 promoter. We geïmmobiliseerd dieren beeldvorming met agarose pads met 0,05% Levamisole tussen twee dekglaasjes (zoals beschreven in de procedures). De elektrische prikkel werd toegediend met behulp van een op maat gemaakte imaging kamer die past op defase van een omgekeerde Nikon Ti microscoop (zie 12). In het kort wordt het dekglaasje geplaatst preparaat (met de worm naar beneden) over een gat in een plastic kamer toelaten van de doelstellingen van onderen en door de standaard imaging dekglas. De kamer werd gevuld met 0,25 mM NaCl en 50 mM glycerol buffer en het elektrische veld stimulus aangebracht met twee platina elektroden langs de uiteinden van de kamer. Zoals hierboven beschreven, een neuron ASJ expressie CGaMP werd afgebeeld met een X100 1.4 NA olie immersie objectief en standaard GFP filterset. Een time-lapse film is verkregen 80 sec (1 frame / sec, 300 msec belichtingstijd) en het onderwerpen van het dier een externe 3 V / cm elektrisch veld in drie verschillende proeven van telkens 10 sec (figuur 3). Wij maten fluorescentie intensiteit bij het cellichaam met de hierboven beschreven beeldanalyse. De video toont een lichte fouten van zowel beweging en focus drift in de loop van het experiment. Het strength van de GCaMP signaal blijft robuust echter met groot ~ 250% toename van de fluorescentie in reactie op zowel de 1 e en 3 e stimuli. Het resultaat van de tweede stimuli aanzienlijk verminderd aantonen variabiliteit in de neuronale respons. Bleken is minimaal als duidelijk door de terugkeer naar een consistent basisniveau.

Cameleon meting van cellulaire calcium fysiologie: Traumatische cellulaire beschadiging veroorzaakt een grote calcium van voorbijgaande aard in een neuron dat een essentiële rol speelt in de fysiologische respons dicteren cellulaire lot (dwz celdood vs aanvang van de reparatie processen). We kunnen meten schade geïnduceerde respons in vivo in een femtosecondelaser individuele C. verbreken elegans neuronen 14 terwijl tegelijkertijd meten van cellulaire calcium signalen met cameleon YC3.60 13, 15. Dieren uitdrukken cameleon YC3.60 in de zes mechanosensorische neuronen (onder demec-4 promoter) werden geïmmobiliseerd met 10% agarose en polystyreen nanodeeltjes zoals beschreven in de procedures. We gebruikten dual imaging optics signalen opnemen van zowel de CFP en YFP fluorescentie kanalen zoals beschreven in de procedures. We afgebeeld een ALM neuron en laser gericht op de axon ~ 20 urn van het cellichaam (Figuur 4A). De axon is verbroken door een korte (<1 sec) blootstelling aan licht van een femtoseconde gepulste infrarood laser gericht op het doel punt langs de axon door de beeldvorming doelstelling (zie 13 voor meer informatie over ooglaseren). Time-lapse beelden op een frame om de 3 sec, met 400 msec belichtingstijden werden opgenomen voor 320 sec tijdens het uitvoeren van laser chirurgie en calcium niveaus berekend op basis van ratiometrisch analyse.

Signalen werden onafhankelijk gemeten op het cellichaam (Figuur 4B) en het axon segment binnen 5 urn van het snijpunt (Figuur 4C). Uit de cijfers blijkt zowel de CFP en YFP intensiteiten en de resulterende FRET ratio. De meting bij het cellichaam goed gedroeg de GVB snel afnemende en YFP toe in reactie op laser schade op t = 0 sec (rode pijl). Dit resulteert in een onmiddellijke ~ 200% stijging van de ratiometrische signaal (AF / F) dat voor ~ 90 seconden volgehouden alvorens terug te vallen tot bijna de uitgangswaarden. Bleken is minimaal zoals blijkt uit de consistente basislijn.

In het axon segment nabij het snijpunt, de plaatselijke hoeveelheid fluorofoor varieert in de loop van het experiment het signaal bemoeilijkt. Laser chirurgie verbreekt het axon en in het kort scheurt het membraan, waardoor fluorofoor te ontsnappen en tijdelijke verlaging van de lokale cytoplasmatische concentratie. Dit blijkt uit een aanvankelijke afname in de YFP trace in figuur 4C en een vergelijking van de axon segment nabij de schade punt in de YFP beelden op tijdstippen t = 0 sec en t = 6 sec, figuur 4A. Op later tijdstippen het afgesneden einde zwelt als onderdeel van de verdere herstel, resulterend in meer gelokaliseerde fluorofoor en een toename in intensiteit. Dit is het duidelijkst in de langzaam toenemende GVB trace in figuur 4C en een vergelijking van de axon segment in CFP beelden op tijdstippen t = 0 en t = sec 270 sec, figuur 4A. Maar deze variaties beïnvloeden beide kanalen even en de FRET-ratio effectief compenseert. De resulterende meting geeft een reactie vergelijkbaar met het cellichaam met een onmiddellijke ~ 150% meer signaal (AF / F), een dramatisch herstel tot nabij basislijn bij ~ 90 sec en daarna een extra kleinere secundaire respons op ~ 150 sec. De ratiometrische analyse is essentieel voor deze meting aangezien het uiterst moeilijk om de calcium signaal scheiden van de andere effecten, die sterk kan variëren van neuron tot neuron en chirurgie een operatie. De axon signaal meer ruis ten opzichte van het cellichaam signaal voornamelijk door fluorescentie en dimmerde kleinere ROI in engere axon.

Figuur 1
Figuur 1. Installatie & ratiometrisch optiek. A) De foto toont de experimentele opstelling bestaande uit een omgekeerde samengestelde microscoop en ratiometrische imaging optics. B) Een schematisch diagram dat de beeldvormende optica nodig voor het ratiometrische FRET gebaseerde metingen. Het beeld wordt gesplitst in de twee golflengten of kanalen, die naast elkaar worden geprojecteerd op de CCD array.

Figuur 2
Figuur 2. Voorbereiding van het monster. C. elegans zijn gemonteerd op agarose dunne kussentjes voor imaging. A) Agarose pads worden gemaakt door daartussen een kleine druppelgesmolten agarose tussen twee microscoopglaasjes gescheiden door twee stukken laboratorium tape. B) De dieren worden overgebracht op de agarose pad en bedekt met een dekglaasje, vastgehouden door een kleine hoeveelheid was bij elk van de vier hoeken.

Figuur 3
Figuur 3. GCaMP voorbeeldgegevens. GCaMP Het signaal AF / F, opgenomen in vivo van het cellichaam van het neuron ASJ reageert op een wisselspanning aan / uit elektrisch veld (groen trace). Dikke grijze lijnen geven periodes waarin het externe elektrische veld (3 V / cm) werd aangebracht op het dier. Scale balk vertegenwoordigt 100% toename van de fluorescentie-intensiteit.

Figuur 4
Figuur 4. Cameleon voorbeeld data. A) Drie afzonderlijke frames die de dubbele afbeeldingaanzicht van een neuron ALM voor en na de laserbehandeling van het axon 20 urn van het cellichaam. De rode pijl in het middelste paneel geeft het snijpunt. Het onderste paneel toont het cellichaam en axonen segment produceren van de signalen in B en C. B) De cameleon YC3.60 signaal gemeten op het cellichaam van het neuron ALM voor en na de laserbehandeling (rode pijl). C) De cameleon YC3 0.60 signaal gemeten op het axon segment binnen 5 micrometer van het snijpunt voor en na de laserbehandeling. Geel sporen geven YFP signalen, blauwe sporen geven GVB-signalen en oranje sporen zijn de resulterende FRET verhouding. Alle tijden zijn in verhouding tot de tijd van laser chirurgie. Scale balken geven een 100% toename van de fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Genetisch gecodeerd calcium indicatoren zijn op grote schaal gebruikt in C. elegans neurobiologie. Talrijke groepen gebruikt deze technieken reactie van primaire sensorische neuronen externe stimuli bestuderen zoals hier aangetoond met ASJ reactie op een elektrisch veld. Prominente voorbeelden zijn gevoel van mechanische druk, specifieke chemicaliën, temperatuur en een elektrisch veld 12, 16-19. Activiteit van interneuron en spiercellen zijn ook gecontroleerd als respons op stimuli en controle van diergedrag. Veel van deze studies hebben geduwd deze technieken een stap verder met behulp van beeldherkenning en het bijhouden van technieken om de opname van neuronen in gedeeltelijk ingehouden of zelfs vrij bewegende dieren, alsmede het opnemen van meerdere neuronen tegelijk mogelijk te maken. Aanvullende studies hebben andere aspecten van calcium fysiologie zoals de respons op neuronale schade 13, 20 hier gepresenteerde enneuronale degeneratie op langere tijdschalen 21.

Bij het ontwerpen van een bepaald experiment, moet elk van de alternatieve technieken met betrekking tot veelgebruikte calcium verslaggevers en dierlijke immobilisatie zorgvuldig worden overwogen. Immobilisatietechnieken zal worden bepaald door technische aspecten zoals de noodzaak van fysieke toegang tot het dier, het vermogen om dieren herstellen van imaging of de noodzaak voor high throughput. Verschillende fluorescente calcium verslaggevers hebben specifieke voor-en nadelen. GCaMP stelt eenvoudig kanaal beeldanalyse en de grote signaal-ruisverhouding is het voor veel situaties. Cameleon anderzijds zijn complexere beeldvorming en analyse maar de resulterende ratiometrische meting kritisch in situaties met potentieel grote voorwerpen. Bijvoorbeeld kunnen fluctuaties in de hoeveelheid fluorofoor (zoals in de laser schade voorbeeld) ook plaatsvinden gedurende lange perioden(Uur) door wijzigingen in expressieniveaus. Extra dubbele beeldvormingsstrategieën zijn mogelijk zoals GCaMP co-expressie gebracht met (of fysisch verbonden met) een RFP fluorofoor. Hoewel niet FRET-gebaseerd zou profiteren van het grote dynamische bereik van de moderne GCaMP varianten tijdens het gebruik van het rode kanaal als een real-time nulmeting.

Het is belangrijk op te merken dat talrijke tweekanaals imaging microscoop en analyse software in de handel verkrijgbaar die weliswaar vaak duurder, kunnen voor onderzoekers weigeren het huis gebouwd systeem toe te construeren. Commerciële dual beeldvormende systemen (DualView2-DV2, Photometrics) gebruiken meestal optiek vergelijkbaar met onze huis gebouwd systeem, maar zitten in een microscoop bevestiging met gestandaardiseerde uitlijning procedures. U kunt ook snel filter systemen voor de uitwisseling (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) maken een snelle real-time sequentiële beeldvorming van twee kleurkanalen without aanvullende beeldvormende optiek, maar zijn ook duur en vereisen nauwkeurige synchronisatie tussen de filter-uitwisseling en camera acquisitie.

Samengevat C. elegans geeft een aantal voordelen als in vivo imaging systeem. De genetisch gecodeerde fluoroforen vaak celspecifieke en de noodzaak voor injectie of toediening van exogene fluoroforen elimineren. C. elegans optische toegankelijkheid maakt beeldvorming in intacte dieren die gemakkelijk en kosteneffectief te onderhouden, vereisen geen ingewikkelde dissectie of neuronale kweken en celfysiologie te behouden. Bovendien C. elegans heeft grote mogelijkheden voor genetische analyse met een groot aantal beschikbare genetische reagentia en gevestigde technieken. Er zijn natuurlijk nadelen aan het systeem, de primaire zorg mogelijk wordt dat het een invertebrate. Bovendien rapporteren fluoroforen relatieve veranderingen in calciumconcentratie Rather dan een absolute waarde en de tijdsresolutie van metingen kan worden beperkt door de dynamiek van de fluorofoor maar ook de benodigde integratietijd van zwakke fluorescentie signalen. Tenslotte, terwijl calcium is een integraal onderdeel van neuronale activiteit en signaleren van de fluoroforen niet rechtstreeks rapporteren membraan spanningspotentiaal zoals gemeten met elektrofysiologische technieken. Toch blijkt uit de procedures hier gepresenteerde C. elegans is een aantrekkelijke, relatief eenvoudig, kostenbesparend systeem voor een breed scala van neuronale beeldvormende studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Verschillende mensen hebben bijgedragen aan het werk beschreven in dit document. CVG bouwde de experimentele opstelling, en LS, SHC, en CVG de uitgevoerde experimenten. CVG en SHC schreef het manuscript. Alle auteurs nam vervolgens deel aan het herzieningsproces en keurt de definitieve versie van het manuscript. Wij danken Paul Sternberg voor de GCaMP stam. Sommige nematoden stammen die in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). De MATLAB beeldanalyse programma werd aangepast van die in 18. De auteurs werden ondersteund door Boston University en het Massachusetts Life Sciences Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eclipse Ti-U inverted
microscope
Nikon
Intensilight HG Illuminator Nikon C-HGFI Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil Nikon
Optical table or 3'X3' optical
grade breadboard
Thor Labs If an optical table is not used an
optical grade breadboard on a
solid laboratory bench should
suffice.
Clara Interline Camera Andor
Technology
High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission Chroma Technology
Corp.
41015 GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm Chroma D440/20x EX excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm
longpass
Chroma 455DCLP BS microscope dichroic for cameleon
imaging
Dichroic mirror > 515 nm
longpass
Chroma 515DCLP BS dichroic mirror for cameleon
imaging
Filter 535 +/- 15 nm Chroma D535/30m EM YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm Chroma D485/40m EM CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat Thor Labs AC508-200-A1 Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror Thor Labs ME2S-P01 FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole Sigma
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 08691-10, 2.5% by
volume, 50 nm
diameter
polystyrene nanoparticles for C.
elegans immobilization
Transgenic strain, Strain
gpa-9::GCaMP3(in pha-1;
him-5 bkg)
Sternberg Lab Strain PS6388
Transgenic strain, mec-
4::YC3.60
Gabel Lab Strain CG1B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
  3. Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , The C. elegans Reseach Community. (2006).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
  6. Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , The C. elegans Reseach Community. (2005).
  7. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
  8. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
  9. Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  10. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  11. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  12. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
  13. Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
  14. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  15. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
  16. Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
  17. Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
  18. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
  19. Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
  20. Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
  21. Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).

Tags

Neuroscience Fysiologie Biofysica neurobiologie Cellular Biology Moleculaire Biologie Anatomie Developmental Biology Biomedical Engineering Geneeskunde, Microscopie Fluorescentie Neurowetenschappen calcium beeldvorming genetisch gecodeerd calcium indicatoren cameleon GCaMP neuronale activiteit time-lapse imaging laser ablatie optische neurofysiologie neurofysiologie neuronen diermodel
<em>In vivo</em> neuronale calcium Imaging in <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V.More

Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. (74), e50357, doi:10.3791/50357 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter