Summary
その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、
Abstract
線虫C. elegansは、in vivoで比較的簡単、低コスト神経イメージングのための理想的なモデル生物である。その小さな透明なボディとシンプルな、よく特徴付けられた神経系が無傷動物内の任意のニューロンの同定および蛍光イメージングを可能にします。動物の生理機能への影響を最小限に抑えてシンプルな固定化技術は、拡張タイムラプスイメージングを可能にする。そのようなカメレオン1とGCaMP 2として遺伝的にコード化されたカルシウム感受性蛍光色素の開発は、細胞生理学と神経活動の両方に関係する神経細胞のカルシウムのin vivoイメージングが可能です。特定のニューロンにこれら蛍光体を発現している多数のトランスジェニック系統は、容易に入手可能であるか、十分に確立された技術を用いて構築することができる。ここでは、GCaMPとカメレオンの両方を使用して、in vivoでの単一ニューロン内のカルシウム動態を測定するための詳細な手順について説明します。我々は、利点とdisadvantを議論両方の年齢だけでなく、試料調製（動物固定化）と画像解析の様々な方法。外傷性のレーザー損傷にニューロンの生理的カルシウム応答を測定するためにカメレオンを使用した外部電場と2に特有のニューロンの感覚反応）を測定するGCaMPを使用した：1）最後に、我々は2つの実験の結果を提示する。これらのようなカルシウムイメージング技術は、C で広く使用されていますエレガンスとは、遺伝的背景を越えて自由に移動する動物は、同時に複数のニューロンと比較して、測定値に拡張されました。Cでelegansは技術的シンプルさとコストで他のモデルシステムを超える利点を用いた in vivo神経イメージングのための堅牢で柔軟なシステムを提示する。
Introduction
ここでは、Cの生体内カルシウムイメージングのための実用的な方法を提示する線虫の神経細胞。高い信号対雑音比を持つ遺伝的にコードされたカルシウム感受性蛍光色素の開発は、Cを作る神経生理学および活性の測定のために比較的簡単で費用対効果の高いシステムをエレガンス 。当社のイメージングは、一般的に利用可能な蛍光団の広視野蛍光イメージングを用いた標準的な複式顕微鏡を使って行われます。我々は、それぞれの長所と短所を議論し、様々なフルオロフォアおよび異なる試料調製を採用するいくつかのテクニックを紹介します。その後、データは2つの例の実験から示されている。ここに記載されている技術上の優れた追加のリソースがWormBook "イメージング神経細胞や筋肉の活性" R. Kerrによる、（記載されていますhttp://www.wormbook.org ）3。
genetiの2つの主要なクラス的にエンコードされた蛍光カルシウム記者は、一般的にC言語で使用されているエレガンス ：単一チャネルのGCaMPとFRETベースのカメレオン。我々は方法を説明し、それぞれによって生成されるデータの例を示します。
GCaMPは、周囲のカルシウム濃度に敏感で修正された緑色蛍光タンパク質（GFP）に基づいています。これは、カルモジュリンによるカルシウムの結合が効率蛍光確認2にGFP分子をもたらすように、GFPの融合と高カルシウム親和性タンパク質カルモジュリンによって達成される。これらのフルオロフォアの最近の進歩は、カルシウム濃度の生理的範囲と合理的に高速〜95ミリ秒の立ち上がり時間の動態および〜650ミリ秒の減衰時間が4以上の蛍光強度の最大500％増加と優れた信号の大きさを生成します。比較的短い期間（分）をかけて、これらの大規模な信号は低解像度のイメージングを可能にする（低倍率）と、行儀のinitが与えられたことができますIALベースライン測定、連続ラインまたは比較測定の必要性を否定する。
カメレオンは、2つの独立したチャンネルまたは波長1を比較するレシオメトリック測定を生成FRETベースの蛍光団であるという利点があります。それはカルモジュリンタンパクによって連結された2つの別々の蛍光色素分子（水色と黄色発光蛍光タンパク質、CFPとYFP）で構成されています。錯体は、CFPを励起する青色光（440 nm）を照射する。カルシウムの結合はYFP（アクセプター）へCFP（ドナー）からの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を増加させるとCFPの発光（480 nm）は減少とYFP発光（535 nm）を増加させることを引き起こして、より緊密フルオロフォアをもたらし。相対的なカルシウムレベルがYFP / CFP強度の比として測定されます。カメレオン動態は〜1秒、3秒〜5の減衰時間の立ち上がり時間を持つようにインビボで測定GCaMPのそれよりも遅いです。しかし、逆に信号を移動の比率は、信号の大きさを増大させ、蛍光物質濃度、動きやフォーカスドリフトと漂白の変化による可能アーティファクトの数を補正します。
遺伝的にコードされた蛍光レポーターは、外因的に投与されたプローブとCで必要な試料調製の大半を否定elegansの小さな透明の本体はシンプルな広視野蛍光を用いて無傷動物内の撮像を可能にします。試料調製における主要な技術的課題は、安全に動物を固定することである。それぞれの長所と短所とは異なる一般的に使用される技術が数多くあります。動物を麻痺させる薬剤を使用することで、実装が容易であり、1つの準備（レバミゾール、つかむために筋肉組織を引き起こしコリン作動薬は一般的に6を使用されている）上に複数の動物の取付けができます。Cで虫も、物理的にマウントすることによって、固定化することができる堅い10パーセントアガロース7,8で。動物生理学上の影響を最小限に抑えることは、長期的なイメージング（時間）と、複数の動物の回復が可能になりますが、より技術的に困難である。これらの手法の両方は、動物への物理的アクセスを制限（カバースリップの下にある）、したがって、唯一の特定の実験刺激（光、温度、電界やレーザー損傷など）で使用することができます。そのような化学物質のタッチや管理などの物理的なアクセスが必要な刺激は、多くの研究では、正常にCをくぎ付けにしている代わりに虫 （獣医グレード接着剤を使用して）9。これは技術的に困難である、単一の動物の準備であり、動物の回復を許可していません。最後に、多数の微小流体デバイスは、物理的に温度を抑えることが採用されてきた虫 、動物の生理機能を維持する刺激のほとんどのタイプ（装置設計に依存します）への暴露を可能と動物の迅速な交換とリカバリを有効にすることができます ここで紹介する方法はCの神経活性および細胞生理機能を測定するために用いることができるエレガンス 。我々は、それぞれの例を参考にしてください外部電場にASJニューロンの感覚応答を測定するGCaMP使用しており、ニューロンのレーザー損傷に対する生理カルシウム応答を測定するためにカメレオンを使用しています。これらの例は、蛍光色素分子の2つのタイプの利点と欠点を示しており、システムで可能なことを示しています。
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Protocol
1。光学装置
- 落射蛍光イメージング機能を備えた標準的な複式顕微鏡を使用しています。我々はIntensilight HGイルミとニコンのEclipseのTi-U倒立顕微鏡を使用しています。
- 最高の画像と信号の品質確保のため、高倍率、高開口数の対物レンズを使用しています。我々は通常、ニコンX60 1.4のNA油浸対物レンズを使用しています。いくつかのケースでは、蛍光体の発現レベルと信号強度に応じて、低倍率（X40、X20）を使用することが可能です。
- このような画像の感度を最大にし、バックグラウンドノイズを最小限に抑えるためのアンドールクララカメラとしては、CCDカメラを冷却し、高感度を使用します。
- 単一色の蛍光団は、蛍光体の特定の波長のために設計された標準的な顕微鏡の蛍光フィルターを使用してください。 GCaMPための標準的なGFPフィルターは525nmの488nmおよび発光の励起用に最適化された設定を使用します。それ以上の光学変更は必要ありません。
- 440±20 nmの励起フィルターと455 nmの設定顕微鏡フィルタが長いダイクロイックミラーを渡す。
- 直ちに顕微鏡イメージングポート（カメラのCCDセンサーは通常座るところ）外初期像面に配置された画像のマスク。これは、カメラセンサーの半分だけがいっぱいになるような視野を制限します。 2つの画像を並べて投影されるシャープなイメージの枠の最初のイメージプレーンの結果とオーバーラップ無しでこのマスクを置く。
- 第1リレーレンズは徒歩トンから1つの焦点距離を設定彼が光をコリメートするような初期のイメージプレーン。
- （<515 nmであり、シアン）は、他の送信中に一つの色を（> 515 nmであり、黄色）を反映し、2つの別々のイメージング波長またはチャネルに光を分割するダイクロイックミラー。
- さらに具体的なイメージング波長（485±535でシアンで40 nmと黄色の±30 nm）の透過光を制限する発光フィルター（バンドパスフィルタ）
- それはCCDカメラでの第2像面に光をrefocusesような光路に配置され第2のリレーレンズ（各チャネルに1つ）。
- 一対のミラーと第2のダイクロイックミラーは、2つの画像が再結合し、カメラのCCDセンサー上に横並びに投影されるようにビーム経路を指示します。 図4Aは、得られた画像の例を示す。
- 初期の光学的アライメント：高コントラストIMAGと光学系のセットアップとアライメントを開始低倍率レンズと送信広視野光照明を（顕微鏡スライド上に描かれた黒のシャーピーがうまく機能）を使用して電子メール。顕微鏡の接眼レンズを通して集中するイメージを持ってきて、次に使用する顕微鏡のポートに切り替えました。高い光照明で初期焦点面（顕微鏡の外部ポート数cm）で、インデックスカードに画像を表示します。それが最初の焦点面から1焦点距離であり、ビーム経路（ すなわち、直接のビーム経路の中央に配置されます）偏向しないながら光をコリメートするようなビーム経路に第1リレーレンズ（C）を配置します。第一焦点面にマスクを置き、視野の半分フィールドを制限したり、画像にシャープなボーダーを生成するように調整。 図1Bに示すように、ビーム経路は、テーブル面に対して平行のままで、2つのパラレルパスサイド·バイ·サイドで実行されるように、ミラーやフィルタ（A、D、E、G）を置きます。それぞれのビーム経路の中心2のリレーレンズ（F）とカメラのCCDセンサーが置かれていたであろうインデックスカードに焦点を当てて画像を持って来るためにパスに沿って前後に移動します。正しく行えば二つの画像は、顕微鏡接眼レンズと他のカメラのポートを持つ同焦点であるべきである。最後の位置にカメラを配置し、アライメントを微調整します。
- ファインチューニング光学的アライメント：微調整光学アライメントにCCDカメラによって見デュアルイメージを使用します。高コントラストの画像を使用して、最終的な位置合わせのための高倍率に切り替えて、低倍率で始まります。反射像（ 図1Bに黄色チャネル）のフィールドの残りの半分をカバーするために、XとYの位置にカメラを移動することによって、カメラの視野の半分をカバーするために送信された画像（ 図1B、シアンチャンネル）を置きそのビーム経路に最後の2ミラー（G）を調整することによって表示できます。ビーム経路に沿って前後に各チャンネルの第2リレーレンズを動かすことにより、フォーカスを最適化します。残した場合不変の光学構成は安定しており、唯一の珍しい微調整を必要とすべきである。
2。サンプル調製とデータ収集。
- 線虫の遺伝学センター（CGC）や他のソースから目的のニューロンにおけるカルシウム感受性蛍光色素分子を発現する動物を取得します。あるいはトランスジェニック動物は、標準的なCを使用して構築することができる虫のテクニック。単一細胞の発現は、（時には望ましいものではない複数のニューロンが調査される場合は、12を参照）画像や複数のセルからの測定容易に分離できるものであれば必要ありません。フルオロフォア導入遺伝子がゲノムに組み込まれていない場合は、発現の有意な変化は、動物から動物に発生する可能性があります。この場合、蛍光解剖顕微鏡を使用して、より高い発現レベルを有する動物を事前に選択すると、信号対雑音比を向上させ、測定を向上させます。蛍光色素分子の発現レベル旧姓容易に実験が必要とする取得パラメータの下にカメラで撮像することにするのに十分でなければD。
- 実験室でのテープを2枚を隔てた二つのガラススライド間の溶融アガロースの小滴を押して目的の固定化技術（下記2.3参照）に必要なアガロースパッドを作る。必要に応じて、アガロースパッドは動物をマウントする前にガラスカバースリップに転送することができます。 図2を参照してください。
- Cを固定する以下のいずれかの手法を用いた撮像用虫 ：
- 薬理学的な麻痺：2％アガロースパッド（2.2でパッドを作る前に溶融アガロースにそれを混合）に0.05％レバミゾールを追加します。パッドの上に5月10日の動物を選んで、カバースリップで覆う。所定の位置に保持するためのカバースリップの四隅にホットワックス混合物（50％パラフィンワックスおよび50％ワセリン）の少量を適用します。を有効にするにはレバミゾールとbに動物のための5〜10分を許可まだ完全ecome。
- スティッフアガロース固定化：C.エレガンスは、物理的に硬い10パーセントアガロースパッドと0.05μmの直径のポリスチレンナノ粒子を用いて固定することができる。 2.2と同様に10％のアガロースパッド（重量のNGMバッファの10％アガロース）を作る。パッドの上にビーズ溶液の〜3μlの（体積NGMに1時10ポリスチレン微小球）を追加します。迅速に、5月10日Cを選ぶパッドの上にビーズ溶液のプールに虫で、静かにカバースリップでカバーしています。その位置に保持するためにカバースリップの四隅に適用溶融ワックスを使用しています。 （この手法に関するその他の詳細については同様に以前のJoveの記事8と7を参照）
- 糊付け：C.虫は動物の一方の側に適用される獣医グレード接着剤の少量を使用して所定の位置に接着することができます。
- マイクロ流体デバイス：多数の微小流体デバイスは、物理的に温度を保持するように設計されていますイメージングのための場所でエレガンス 。
- 顕微鏡にプレパラートを置き、希望のニューロンに焦点を当てています。これは C を見つけることが最も簡単な方法です明視野照明と低倍率を使用しエレガンス 。その後見つけ、特定のニューロンに焦点を当て、高倍率と蛍光イメージングに切り替える。
- 刺激：特定の刺激に対するニューロンの応答（光、電場、味覚や嗅覚、温度など）を希望する場合は、刺激装置は、それがで動物に投与することができるように、顕微鏡のセットアップに設計しなければなりませんイメージングしながら試料調製。
- 顕微鏡CCDカメラを用いて画像を取得する。露光時間と励起光レベルがconcordantly少ない時間分解能で長い露出時間を必要とする弱い信号と、基準信号と蛍光体の発現量に依存します。我々は通常、約300ミリ秒の露光時間を使用します。
- 個別に、またはTiのような画像を取得映画を私タイムラプス。なぜならC.線虫の神経細胞は一般的に遅い活性化ダイナミクス（ すなわち、彼らはナトリウムベースの活動電位を欠いている）が表示され、約1秒の比較的遅いフレームレートは、しばしばニューロンダイナミクスを測定するのに十分である。集録レートまで〜これらは微弱な蛍光のために必要な積分時間によって制限されるかもしれませんが、毎秒90フレームが使用されている。固定化の準備が安定しており、フレームレートが比較的遅い場合は、単一ニューロンの個々のムービーが簡単に数分（5〜10分）以上拡張することができます。
3。データ解析
- ImageJとNISの要素を含む動的およびレシオメトリック分析機能と利用可能な異なる蛍光イメージングソフトウェアパッケージは多数あります。我々は、関心のある選択された領域での平均蛍光シグナルを測定する簡単なカスタムMATLABプログラムを使用しています。
- 個々の画像（またはままタイムラプスムービーの完全に静止）画像化されたニューロンとバックグラウンド測定用に別の近隣地域内の関心領域（ROI）を選択します。レシオメトリック画像の場合、デュアル画像ごとに類似したROIと背景領域を選択します。
- タイムラプスムービー内の画像化された神経細胞のわずかな動きを自動的に多数のオブジェクトトラッキング方式を使用して行うことができ、各フレーム内のROIを選択するには追加の分析が必要です。私たちのプログラムは、ラフの境界が（すべてのフレームに興味の対象を包含する）手動で選択し、独立したバックグラウンド領域が選択されているから、映画の中のすべての画像の圧縮された画像が表示されます。最初のフレームは、ROIが手動で境界領域内から選択されています。その後の各フレームについては、プログラムが正しいサイズ（ すなわちマニュアル最初のフレームのROIとして同じ画素数）のROIを生成する境界領域内から最も明るいピクセルを選択します。イメージのためどこ客観利益のトンは、このプロトコルは、各フレームのための合理的なROIを選択する境界領域内の周囲の背景その後十分に明るくなっています。
- 各フレームの蛍光信号、Fは、ROI内の平均ピクセル強度マイナス背景領域の平均強度として計算されます。レシオメトリックの値が-0.65 / 2の信号の比（YFP-YFP 背景 ）（CFP-CFP 背景 ）として計算されます。 0.65倍は、フルオロフォアと同様に（この値は、通常、カメレオンのセットアップのための〜0.6である）を使用し、特定のフィルタセットに依存することになるのYFPチャンネルにCFPのチャネルを介してのブリードを補正します。
- 、ΔF/ F =（F（t）は、-F O）/ F○：各フレームの相対的なカルシウムレベルは、最初のフレーム（または一連のフレーム）から測定し、初期ベースライン値に正規化された強度の変化率として計算されF（t）は時間tとf oの蛍光である初期ベースライン値です。
- 細胞体を選択するROIが最強で最も堅牢な信号を生成し、それが神経突起に沿ってROIからの信号を選択して測定することも可能である。
4。問題解決
- 漂白 ：励起光への曝露は、フルオロフォアの漂白と暴露レベルに依存している信号の着実な減少によってマークされて発生することがあります。レシオメトリック測定は、これを補償するために役立ちます。 1波長の漂白しかし選択はまだ（速く次に、典型的にCFPの漂白YFP）が発生する可能性があります。漂白した場合は、（照明経路における中性密度フィルター付き）露光時間および/または励起強度を低減することにより、露光レベルを下げるに発生します。必要であれば、1はモック試験（同じ励起露出けどノー神経刺激）を実行すると、信号の減衰の時定数を定量することにより、漂白を補償することができます。
- 背景の選択：背景領域を慎重に選択することに成功し、画像解析のために必要である。背景領域は、合理的に均一で画像化されたニューロンその後暗くなるはずです。それは十分に画像化されたニューロンからの散乱光（そして、その結果、ピックアップ信号）を避けるために削除する必要があります。我々は、均一領域20-5を見つけるROIから0μmでは、ほとんどの場合に適しています。
- レシオメトリック光学：結像光学系の正しいアライメントが明らかデュアル画像を生成するために重要です。レシオメトリックイメージングのための商業顕微鏡アタッチメントが用意されています。代替技術は、それぞれに別々の画像を記録しながら、急速に発光波長を切り替えることが高速フィルタホイールを使用して迅速な連続イメージングを用いることである。
- レシオメトリック分析：ここで説明した分析では、投資収益率を平均のおかげで堅牢な信号を生成し、比較的簡単なテクニックです。それは、ROIを選択するに分かる明るいオブジェクトが必要です。より洗練されたレシオメトリック分析が正確に整列させ、蛍光比は画素ごとに算出することができる、このような二重の画像をマッピングすることにより可能です。
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Representative Results
ここでは、2つの独立した実験の結果を提示する。最初は蛍光カルシウム記者が光学的に無傷での神経活動を監視するために使用できる方法の良い例を与えて、定義された外部の刺激に対して特定の感覚ニューロンの応答を測定することがGCaMP採用エレガンス 。第二は、カメレオンが一時的細胞内カルシウムは、このようにカルシウムの生理機能が生体内での単一セル内で測定することができる方法を示す、特定のレーザー損傷に応答して、ニューロン内でトリガ測定するために採用しています。各測定個々の試験結果の技術的な側面に焦点を当てるために提示され、詳細に説明されています。多くの場合、時間をかけて平均応答（刺激に対する各時点での平均応答として算出）や特定のメトリックは、（このような応答の平均振幅など）を多数試験全体で計算されています。典型的には10〜20試験は許容平均測定値が、tを生成するために必要である彼の番号は、応答の固有の変動に左右されます。ここで説明する実験のためのこのようなデータ分析は12と13で見つけることができます。
感覚反応のGCaMP測定：外部からの強い電界（≥3 V / cm）で、Cにさらさelegansは積極的に的確な指示の動きを持つフィールドの負極に向かってクロール。我々は以前、このelectrotactic動作は主に左右ASJニューロンは、動物の頭部12に位置amphid感覚ニューロンによって媒介されることが明らかになった。この応答を視覚化するために、我々は、GPA-9プロモーター下左右ASJニューロンで特異的にGCaMP3を発現するトランスジェニック系統を用いた。我々は、2つのカバースリップ（手順で説明するように）の間に挟ま0.05％レバミゾールを含むアガロースパッドを使用してイメージングのために動物を固定した。電気刺激は、上に収まるカスタム構築されたイメージングチャンバーを用いて投与した反転したニコンのTi顕微鏡のステージ（12を参照）。要するに、カバースリップの準備が下から目標とカバースリップを介して標準イメージングのためのアクセスを可能にする小さなプラスチックのチャンバー内の穴の上（下ワームの側面と）に配置されます。チャンバーは0.25 mMのNaCl及び50mMグリセロールバッファーを満たしたと電界刺激は、チャンバの両端の内側を覆う2つの白金電極を使用して適用した。前述したように、CGaMPを発現する単一ASJニューロンはX100 1.4 NAの油浸対物レンズと標準GFPフィルターセットを用いて画像化した。 3つの独立した試験で、各10秒間持続する（ 図3）外部3 V / cmの電界に動物をさらしながらタイムラプスムービーは、80秒（1フレーム/秒、300ミリ秒の露光時間）に買収された。我々は、上記の画像解析を用いた細胞体の蛍光強度を測定した。映像は、実験の過程での動きやフォーカスドリフトの両方のわずかな障害を表示します。セントGCaMP信号のrengthしかし1回目と3 回目の刺激の両方に対応して蛍光の大〜250％の増加を示す引き続き堅調。第二の刺激からの結果は、実質的ニューロンの応答の変動を実証低減されます。漂白は、一貫したベースラインレベルへのリターンによって明らかなように最小限に抑えられます。
細胞内カルシウム生理学のカメレオン測定：外傷性細胞傷害は、生理的な応答口述細胞内運命（ すなわち細胞死対修復プロセスの開始）で重要な役割を果たしている神経細胞内カルシウムトランジェント大をトリガします。我々は個々のCを切断するためにフェムト秒レーザーを用いたin vivo でこの損傷誘発性応答を測定することができますelegansのニューロン14同時にカメレオンYC3.60 13,15を用いて細胞内カルシウムシグナルを測定しながら。 6機械刺激受容ニューロン（下にカメレオンYC3.60を発現する動物MEC-4プロモーター）などの手順で説明するように10パーセントアガロース、ポリスチレンナノ粒子を用いて固定した。我々は、の手順で説明するように、CFPとYFPの蛍光チャンネルの両方からの信号を記録するために二重の結像光学系を採用した。我々は、単一ニューロンのALMを画像化し、レーザーは軸索〜細胞体（ 図4A）から20μmを対象とした。軸索は、結像レンズ（レーザー手術の詳細については、13を参照）によって軸索に沿って目標点に焦点を当てた赤外線レーザーをフェムト秒パルスからの光に短時間（<1秒）の曝露によって切断されました。レーザー手術およびレシオメトリック分析を用いて計算カルシウムレベルを実行しながら400ミリ秒の露光時間とフレームごとに3秒でタイムラプス画像が320秒を記録した。
信号が細胞体（ 図4B）で、カットポイント（ 図4C）の5μm以内の軸索セグメントの独立に測定された。数字は、Cの両方を表示FPとYFP強度だけでなく、その結果は、比率のFRET。細胞体での測定がよく、CFPは急速に減少およびYFPは、t = 0秒（赤い矢印）でのレーザー損傷に応答して増加すると振る舞っている。近くにベースラインレベルにフォールバックする前に約90秒間持続するレシオメトリック信号（ΔF/ F）を即時〜200％の増加という結果に終ります。漂白は、一貫したベースラインから明らかなように最小限に抑えられます。
カットポイントに近い軸索のセグメントでは、蛍光体の局所量が信号を複雑にして、実験の経過とともに変化します。レーザー手術は、軸索を切断し、簡単に蛍光団が脱出し、一時的にその地方の細胞質濃度を低減することができ、膜を破裂。これは、 図4cに YFPトレースの初期減少と時間t = 0秒とt = 6秒、 図4AにおけるYFP画像でダメージポイントの近くに軸索の種類別セグメントとの比較からも明らかである。ラでTER時点は、切断端がよりローカライズフォアと強度の増加をもたらし、その継続的なリカバリの一部として膨らむ。これは、 図4Cおよび時間t = 0秒とt = 270秒、 図4Aにおいて、CFP画像内の軸索の種類別セグメントとの比較でゆっくりと増加CFPのトレースで最も明白です。しかし、これらの変化は等しく両方のチャンネルに影響を与え、FRET比率が効果的に補正します。結果の測定には、信号の即時〜150％増加（ΔF/ F）は、約90秒でほぼベースラインに劇的な回復とその後〜150秒で追加の小さい二次応答と細胞体と類似の応答を示しています。それはニューロンからニューロンや手術に手術に大きく異なる可能性があり、他のエフェクトから、カルシウム信号を分離することは非常に困難であるように、レシオメトリックな分析では、この測定に不可欠です。軸索信号は蛍光を調光器に主として細胞体の信号に比べてより多くのノイズを持っており、狭い軸索が小さいROI。
図1。基本的なセットアップおよびレシオメトリック光学。 A）写真は倒立複合顕微鏡およびレシオメトリックイメージング光学系で構成される実験的なセットアップを示しています。B）のレシオメトリックFRETベースの測定に必要な結像光学系を示す模式図。画像は、CCDアレイ上に並べて投影された2つの波長またはチャネルに分割されます。
図2。サンプル準備℃ でエレガンスは、イメージングのための薄いアガロースパッドに搭載されている。）アガロースパッドがの小滴を挟むことによって作られています実験室でのテープを2枚を隔てた2顕微鏡スライド間の溶融アガロースはB）の動物をアガロースパッド上に移し、カバーガラスで覆われ、四隅のそれぞれにワックスを少量によって所定の位置に保持されています。
図3。 GCaMPデータ例。電場オン/オフ交流（緑のトレース）に応答ASJニューロンの細胞体からインビボで記録された信号GCaMP、Δf/ fは、。厚い灰色の線は、外部電界（3 V / cm）を動物に適用された期間を示す。スケールバーは蛍光強度で100％の増加を示している。
図4。カメレオンのデータ例。 A）は 3つの別々のフレームは、デュアルイメージを示す細胞体から軸索20μmのレーザー手術の前と後のALMニューロンの眺め。中央のパネルの赤い矢印は、カットポイントを示します。下のパネルは、BとCに信号を生成する細胞体と軸索のセグメントを示します。レーザー手術（赤矢印）の前と後のALMニューロンの細胞体で測定B）がカメレオンYC3.60信号。C）カメレオンYC3 0.60信号はレーザー手術の前後にカットポイントの5μm以内、軸索のセグメントで測定。黄色のトレースはYFP信号を示し、青色のトレースがもたらしているが、比率のFRET CFP信号とオレンジの痕跡を示している。すべての時刻は、レーザー手術の時間を基準にしています。スケールバーは蛍光強度が100％増加を表しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
遺伝的にコードされたカルシウム指示薬は広く、Cで利用されてきたelegansの神経生物学。多数のグループが電界にASJ応答でここで示すよう外部刺激に対する一次感覚ニューロンの応答を研究するために、これらの技術を採用してきた。顕著な例は、機械的なタッチの感覚、特定の化学物質、温度、電界12、16から19が含まれています。介在ニューロンと筋細胞の活動も刺激に応答して、動物の行動の制御の両方で監視されている。これらの研究の多くは、これらの技術を部分的に抑制されたり、自由に移動する動物で同様に、同時に複数のニューロンから記録したニューロンから記録を有効にするには、画像認識やトラッキング技術を使用して、さらに一歩をプッシュしている。その他の研究では、そのようなだけでなく、ここに提示されるように神経損傷13、20への応答としてのカルシウムの生理機能の他の側面を検討してきた長い時間スケール21の神経変性。
特定の実験を設計する際に、一般的に使用されるカルシウムの記者や動物の固定化に関する代替技術の各々は慎重に考慮すべきである。固定化技術は、動物への物理的なアクセスの必要性、イメージングや高スループットを必要とする次の動物を回復する機能などの技術的な側面も考慮しなければなりません。異なる蛍光カルシウム記者だけでなく、具体的な長所と短所があります。 GCaMPは簡単単一チャンネル画像解析を採用しており、大規模な信号対雑音比は、多くの状況には適用できます。一方、カメレオンは、より複雑な画像処理と分析が必要ですが、結果のレシオメトリック測定は、潜在的に大規模なアーティファクトのような状況では重要になることがあります。例えば、蛍光体の量（レーザー損傷の例のように）の変動はまた、長い期間にわたって発生する可能性があります（時間）発現レベルの変化に起因する。追加のデュアルイメージング戦略は、このような（または物理的にリンクされている）RFPの蛍光体で共発現GCaMPとしても可能です。 FRETベースではありませんが、リアルタイムのベースライン測定として赤チャンネルを使用している間、これは現代のGCaMP変異体の広いダイナミックレンジを活用するだろう。
その数々の2チャンネルイメージング顕微鏡システムおよび解析ソフトウェアは、多くの場合、より高価ながら、ここで説明する家庭構築したシステムを構築することに消極的研究者にとって魅力的であるかもしれない、市販されている点に注意することが重要です。商用デュアルイメージングシステム（DualView2-DV2、Photometrics）は、典型的には、私たちの家庭に構築されたシステムに似ていますが、標準化されたアライメントの手順を持つ単一の顕微鏡アタッチメント内に含まれている光ファイバを使用します。あるいは、高速フィルタ交換システム（ラムダDG-4/DG-5プラス、サターインスツルメンツ）は、2つのカラーチャンネルwiの急速なリアルタイム連続イメージングを可能にする追加の結像光学系をthoutも高価であり、フィルター交換とカメラ買収間の正確な同期を必要とします。
要約すると、C elegansはin vivoイメージングシステムのように多くの利点を提供します。遺伝的にコードされた蛍光団は、多くの場合、細胞特異的であり、注入または外因性の蛍光体の投与の必要性をなくすことができます。C.エレガンス光学アクセシビリティが容易であり、維持するために費用対効果無傷の動物内のイメージングを可能にし、複雑な解剖や神経細胞を培養することを必要とし、細胞生理を保持しません。加えて、C elegansは遺伝可 能な試薬と十分に確立された技術の数が多い遺伝子分析のための優れた機能を持っています。もちろん欠点のシステムにありますが、主な関心事は、おそらくそれは無脊椎動物であるされていること。また、フルオロフォアはカルシウム濃度の早咲きの中で相対的な変化を報告絶対値と測定の時間分解能よりrは蛍光体のダイナミクスだけでなく、微弱な蛍光シグナルの統合に必要な時間の両方によって制限されることがあります。最後に、カルシウムは神経活動の不可欠な部分であり、電気生理学的手法を用いて測定した蛍光団が直接膜電位を報告していないシグナリングながら。それにもかかわらずで 、ここで紹介する手順で示され虫は神経イメージング研究の広い範囲のための魅力的な、比較的単純な、費用対効果の高いシステムです。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
何人かの人は、このホワイト·ペーパーで説明された仕事に貢献した。 CVGは、実験装置を構築し、LS、SHC、とCVGは、実験を行った。 CVGおよびSHCは原稿を書いている。すべての著者は、その後改訂プロセスに参加し、原稿の最後のコピーを承認した。我々はGCaMP株についてポールスタンバーグに感謝します。この作業で使用されるいくつかの線虫株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によって運営されている線虫遺伝学センター（CGC）から提供された。 MATLABの画像解析プログラムを18で使われているから脚色したものです。著者はボストン大学、マサチューセッツ工科大学ライフサイエンスセンターではサポートされていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3'X3' optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
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