Summary
מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל.
Abstract
מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. לפיכך, פרוטוקולים לבודד ואיברים בודדים התרבות של עניין חיוניים כדי לספק שיטה של שתי אסטרטגיות הטיפול החדשניות לדמיין שינויים בפיתוח ומאפשרים. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל. מצע זה מספק מספיק תמיכה כדי לשמור על המבנה תלת ממדים, אבל הוא גמיש מספיק כדי לאפשר המשך התכווצות. בקיצור, לבבות הם נכרת מן העובר והניחו בתערובת של Matrigel הקר דילול 01:01 עם מדיום גידול. לאחר Matrigel המדולל מתמצק, מדיום גידול מתווסף למנת התרבות. לבבות עקורים מאוחר ככל יום עוברי 16.5 היו מעשיים עבור ארבעה ימים שלאחר נתיחה. ניתוח של מקלעת כלילית מראה כי שיטה זו אינהלשבש את התפתחות כלי דם כלילית. לפיכך, אנו מציגים שיטה חדשנית לתרבות לטווח הארוך של לב עוברי.
Introduction
בשנים האחרונות, העכבר המהונדס כבר את מערכת המודל העיקרית לחקר התפתחות מומי לב. עם זאת, אורגניזמים מודל אחרים, כגון דג הזברה, שהוכחו יש יתרונות משמעותיים על פני העכבר. שלושה יתרונות עיקריים של דג הזברה הם הנחת החיצונית של ביצים, על מנת להקל על גישה לעוברים; שקיפות האופטית של העוברים, מה שמאפשרת הדמיה קלה של התפתחות לב, ואת הקלות של יישום טיפולים מולקולריים קטנים כדי לווסת את התפתחותו של העובר 1. לפיכך, הפיתוח של טכניקת התרבות שאפשרה צמיחת רחם לשעבר של איבר עוברי הייתי לעקוף, לפחות בחלקו, את המגבלות כיום חוו על ידי חוקרים לומדים תהליכי התפתחות בעכברים מהונדסים.
מערכות תרבות לב לשעבר vivo פותחו בשניהם חומוס ועובר עכבר המאפשרים טיפול עם מולקולות קטנות וניתוח של איך אונטערשיידאזורים שונים שממפים של לב תקשורת 2-6. לכל עכבר תרבות לב, לב שנלקח מעוברים עד עוברי (E) יכול להיות ממוקמים בגיל 12.5 במדיום התרבות עם או בלי נדנדה 2,3,5. באמצעות טכניקה זו, לב עוברי טופח בהצלחה לשקילות של E13.5, ולב בתרבית עם נדנדה נשמר כל עוד שלושה ימים (החל משעת E10.5) 3. עם זאת, מחקרים לא דיווחו התרבות המוצלחת של לב מעוברים מבוגרים יותר. כמו כן, ניסויי הצלה היו מוגבלים להחלת הסוכן הטיפולי ברחבי העולם לתרבות בינונית 2.
מערכת התרבות פרוסה, שבלבם הם נכרת, מוטבעים, ומחולק באמצעות vibratome, גם נוצלה לשני לבבות צעירים יותר, כגון E12.5 לבבות עכבר חומוס ולבבות בשלב 36 (כ E16 בעכבר) המבורגר-המילטון 2,4,6, ומעלה את לב, כמו שלאחר לידה ומבוגרים עכבר שעותearts ולבבות אדם מבוגר 7,8. בעוד שהניתוחים העובריים מנוצלים בדרך כלל סעיפי 2,4-150 מיקרומטר עבים, עובי סעיף יכול להיות גדול כמו 500 מיקרומטר ללא עדות למחסור בחמצן 8. תרבויות פרוסה אלה קוימו כל עוד חודשים בתרבות, עם רוב פרוסות שמירת contractility לאורך תקופה זו 9. בהשוואה למחקרים בcardiomyocytes מבודד, תרבויות פרוסה אלה מאפשרים שיתוף התרבות של cardiomyocytes עם סוגי התאים השכנים שלהם ולספק שיטה יעילה לניתוח vivo לשעבר. עם זאת, תרבויות אלה דורשים משוכללים יותר ההגדרה מאשר פשוט הצבת לב במדיום התרבות (למשל הטבעת הלב החי עבור חתך בvibratome), וכל ניתוח הוא כמובן מוגבל לחלק של הלב בתוך הקטע.
בהתחשב במגבלות שתוארו לעיל ללב עכבר עוברי culturing והשפע של עכברים מהונדס אווהilable למחקר, פיתחנו מערכת לשעבר vivo עכבר לב התרבות דומה למערכת תרבות ריאות vivo לשעבר שפותחה על ידי ויבר, מערכת et al. 10 התרבות מאפשרת תרבות לטווח ארוך והדמיה של זרימת הדם הכליליים שיפוץ בתוך כל לב עכבר עוברי. בנוסף, השימוש בMatrigel מאפשר חרוזים שיתקיימו במקום סמוך ללב, ובכך לספק טיפול מקומי עם סוכנים טיפוליים. ניתן לבצע ניסויים אלה בנקודות זמן התפתחות שונות כדי להשוות את ההשפעה של טיפול שניתן בתהליך כגון היווצרות עורקים כלילית. בגלל מולקולות קטנות יכולות לנטרל באמצעות Matrigel, מערכת זו התרבות יכולה לשמש גם לאזורי התרבות גזורים של הלב אחד ליד שני כדי לקבוע אם אנשי קשר ספציפיים תאי תאים נחוצים לתהליכים התפתחותיים מסוימים או אם איתות paracrine מאזור אחד למשנהו צורך בכך.
מערכת זו התרבותהוא פשוט יחסית, ובניגוד למערכת התרבות הפרוסה, עושה שימוש בחומרים כימיים תרבות הבסיסיות ולהגדיר קופצים, כי הם זמינים ברוב המעבדות. בקיצור, לב עוברי בתרבית ניכר בMatrigel לדלל, המספק תמיכה מוצקה למחצה. תמיכה זו היא מספיק כדי לשמור את המורפולוגיה תלת ממדית של הלב בעת גם מאפשר ללב חוזה. באמצעות מערכת זו, ניתן לשמור על לב שלם מעוברי עכברים מבוגרים יותר (E14.5-E16.5) בתרבות לתקופה של עד ארבעה ימים. מקלעת כלילית כולו נשמר, שלא כמו בתרבויות פרוסה, כך שכל רמזי איתות המתרחשים באזורים שונים של הלב להישאר בהווה. יתר על כן, צבעי ניאון לחיות תאים יכולים לחלחל Matrigel כדי לאפשר הדמיה של הלב החי, והוא יכול להיות ממוקמים חרוזים חלבון מצומדות ליד הלב כדי לספק מקור איתות מקומי. יחד, יתרונות אלו הופכים טכניקה זו שיטה אידיאלית ללימוד תהליכים התפתחותיים בembryonלב עכבר IC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מוציא את הלבבות עובריים
- להרדים את העכבר מתוזמן בהריון ביום העוברי הרצוי באמצעות טכניקת המתת חסד מאושרת. כל הניסויים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.
- נדיבות לרסס את הנקבה עם אתנול 70% לפני הניתוח. פתח חלל הבטן של הנקבה כדי לאחזר והבלו קרן הרחם.
- הנח את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה תמיסת מלח קר 1x פוספט שנאגרו (PBS) ולשטוף במידת הצורך. גזור לפתוח קרן הרחם דרך קו האמצע לחשוף את שקי העובריים המצורפים.
- גזור לפתוח השק עוברי ולאחזר עובר. הנח את העובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS הקר. להחזיר את צלחת פטרי עם קרן הרחם לקרח.
- לערוף את העובר כדי לשפר את הגישה לקיר החזה. אם genotyping יש צורך, הסר אותו ולהציל את הזנב בצינור Eppendorf מונח על קרח.
- עםהעובר על הגב שלה, לחתוך לפתוח את דופן בית החזה כדי להמחיש את הלב וריאות. בהתאם לבמה, קיר החזה עשוי להיות שקוף.
- רם בזהירות את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי בהמשך. לאחר מכן, לחתוך מעל כלי הגדול כדי לשחרר את הלב. אם יש צורך, להסיר רקמות זרות.
- מניחים את הלב באחד טוב של צלחת 24 גם מלאות PBS הקר ומניח את הצלחת על קרח.
- חזרו על השלבים הקודמים עד שכבר נכרת לב מכל העוברים.
2. תרבות Set-up
- בברדס למינרית, לשלב Matrigel קר ומדיום התרבות הרצויה (למשל 10% בסרום שור העובר (FBS) בהשתנה Dulbecco נשר בינוני (DMEM)) בביחס 1:1. לא מדיום התרבות מראש החם.
- שמירת Matrigel לדלל על קרח, פיפטה μl 500-1,000 של הפתרון המדולל היטב של צלחת תרבות 24 גם כי הוא נשמר גם על קרח.
- במכסת המנוע, להרים בזהירות ומניח נכרתלב בטוב של צלחת התרבות המכילה Matrigel תוך שמירה על צלחת התרבות על קרח.
- אם הכיוון של הלב המשובץ הוא קריטי: נדיבות לרסס מיקרוסקופ הפוכה ומרחב הסובב עם 70% אתנול. במכסת המנוע, הנח את הלב נכרת בטוב של צלחת התרבות המכילה Matrigel בעודו על קרח. לאחר מכן, הנח את הצלחת על מיקרוסקופ ובמהירות אוריינט הלב נכרת כMatrigel מתחיל לחזק.
- מניחים את צלחת התרבות בhumidified 37 ° C חממה (5% CO 2) ולאפשר Matrigel לבסס לכ -30 דקות.
- הוסף מדיום התרבות מחומם מראש 1 מ"ל לכל המכיל גם לב.
- לבבות יכולים להישאר בתרבות במשך לפחות ארבעה ימים. שינוי התרבות בינונית כל יומיים מומלץ.
3. קיבעון ויזואליזציה
- אם תרצה, להוסיף צבע לחיות תאי ניאון (למשל Syto-16) כדי להמחיש את הלב החי. צילום יהיהמוגבל לצד של הלב, כי הוא גלוי הבוסס על המיקום שבו הוא משובץ.
- אם ניתוחים שלאחר culturing (למשל כל הדמיה הר או חתך) יבוצעו, להסיר את מדיום התרבות ולהחליף עם 4% פורמלדהיד קר. מניחים את הצלחת על קרח למשך 30 דקות.
- לאחר פורמלדהיד והקרח הקרים לקדם את פירוקה של Matrigel, החלף את המקבע (וMatrigel) עם פורמלדהיד הטרי ולתקן לבבות הלילה בשעה 4 ° C.
- שטוף את לבם עם חיץ (למשל PBS או טריס) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות טכניקה זו, הלב שומר מורפולוגיה תלת הממדים ונותר בת קיימא, כפי שצוין על ידי התכווצויות המשיכו (סרט 1). התכווצויות אלה הן באופן עקבי יותר בולטות בפרוזדורים מאשר בחדרי הלב. בעקבות התרבות, ניתן לתקן את לב ומעובד או אימונוהיסטוכימיה או היסטולוגיה לבחון ביטוי סמן ספציפי או מבנים. איור 1 א מציג את הבסיס של החדרים ועורקים גדולים של לב עוברי בעכבר שהיה בתרבית למשך 24 שעות, קבוע, ומעובד ל אימונוהיסטוכימיה לתייג האנדותל. micrographs confocal אלו מראה כי כלי הדם כליליים נראה דומה ללב נכרת מן עובר בגילים comparably שנשמר ברחם (איור 1). עם זאת, את כלי הכליליים בלב התרבותי vivo לשעבר לעשות להיראות קטן יותר מאשר בלב שנשמר ברחם. בשני הלבבות, הקודקודי דואר של החדרים הוסרו כדי לאפשר גישה טובה יותר של הנוגדנים לרקמה.
ניתוח (H & E) hematoxylin ו eosin של לבבות עקורים בE16.5 וvivo לשעבר תרבותי ל4 ד מוכיח כי המורפולוגיה הכוללת, כולל קירות של העורקים הגדולים (איור 2 א) וחדריות ושריר הלב במחיצה interventricular (איור 2) של הלב נשאר שלם. למרות חוסר מחזור, אוסטיה כלילית ניכרות (איור 2 א). עם זאת, פיצול ה-DNA, שנצפה גם עם H & E (איורים 2A, 2B) וDAPI (מידע לא מוצג), ניכר בשריר הלב הקומפקטי וסביב כלי הדם הגדולים. יתר על כן, שריר הלב הוא פחות צפוף בהשוואה ללב מעובר E18.5 שהתפתח ברחם (האיורים 2C, 2D), למרות שהלב התרבותי vivo לשעבר עדיין פועם. לפיכך, יש מגבלות לאורךזמן לאו השלב שבו יכולים להישמר הלבבות הללו.
טכניקה זו התרבות יכולה לשמש גם לתייג fluorescently לבבות ואילו בתרבות. במקרה זה, לבבות בתרבית ל48 שעות לאחר שטופח עם צבע פלואורסצנטי האנדותל ספציפי. במקרה זה, ויזואליזציה מוגבלת המבוססת על אורינטציה של הלב והאטימות של הרקמות (3A דמויות, 3 ב). עם זאת, סעיפים היסטולוגית לאחר מכן באמצעות חדרית שריר הלב לאשר כי מולקולת ניאון זה יכול לחדור את שכבות תאים החיצוניות לתייג כלי משנה epicardial בתוך החדרים (האיורים 3C, 3D), וצבע פלואורסצנטי זה colocalizes עם ISO-לקטינים (איור 3D).
איור 1. פיתוח מופיע בתנאים נורמלי vivo לשעבר. () לאחר 24 שעות בתרבות, לבבות לשעבר vivo מE14.5 עובר היו קבועים, שכותרתו עם סמן אנדותל (ירוק), ניקו, וצלמו עם מיקרוסקופיה confocal. עורק הריאה (רש"פ), אב העורקים (Ao), והבסיס של הלב מוצגים. (ב ') לבבות עקורים מE15.5 עוברים שהתפתחו ברחם עובדו באופן דומה. בר סולם, 100 מיקרומטר.
איור 2. מורפולוגיה נשמר גס במהלך תרבות vivo לשעבר. (A, B) לבבות שנכרתו מן E16.5 עוברים וvivo לשעבר התרבותי במשך 4 ימים. לבבות היו אז מחולק ומוכתמים עם hematoxylin ו eosin (H & E). (א) בסעיף רוחבי מראה את היישור של אב העורקים (Ao) ועורק ריאה (הרשות הפלסטינית). אחד אוסטיה כלילית (ראש החץ) הוא גלוי לעין. שריר הלב סורעיגול אב העורקים הוא פחות צפוף מאשר בבקרה (C), וחלק פיצול גרעיני (חץ) הוא גם בהווה. (ב ') המורפולוגיה הכללית של שריר הלב הקומפקטי של חדרים ומחץ interventricular (IVS) נראה נורמלית, אבל שריר הלב הוא פחות צפוף מאשר בבקרה (ד '), וחלק פיצול גרעיני (חץ) הוא לכאורה בעירוי. (C, D) לשם השוואה, החזיתי H & E-מוכתמים קטעים מלב E18.5 מוצגים. (ג) ostium כלילית הוא ציין בסמוך לאאו (ראש החץ). (ד ') מחץ interventricular מוגדרת היטב. בר סולם, 70 מיקרומטר.
לבבות vivo לשעבר איור 3. יכולים להיות שכותרתו fluorescently במהלך התרבות. (A, B) לאחר 48 שעות בתרבות, לבבות לשעבר vivo מE16.5 עוברים הודגרו עם Syto 16 (ירוק) עבור שעה 1, וקרינה יכולה להיבחן מאוחר ככל 48 שעות לאחר דגירה. (C, D) הקרינה זו נשמרת באמצעות חתך קפוא ויכולה להיבחן בתאי אפיתל subepicardial בתוך חדרית שריר הלב. ב-D, המדור תוך חדרית שריר הלב שכותרתו היה שותף עם ISO-לקטינים (אדום). שיתוף תוויות ISO-לקטינים בתאים הירוקים Syto 16-החיוביים (חיצים) וגם תוויות כלי בתוך שריר הלב שלא היו מוכתמים בSyto 16. א.ב., הגדלה 4x; סרגל קנה מידה בתקליטור, 120 מיקרומטר.
סרט 1. לאחר culturing vivo לשעבר למשך 30 שעות, לב נכרת מן העובר E14.5 מציג התכווצות עקבית וצעדה בין הפרוזדורים והחדרים. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת התרבות הנוכחית מהווה יתרונות משמעותיים למחקרי לב עכבר עובריים. מערכת זו התרבות משמרת contractility שריר הלב ומקלעת כלילית, עם סימנים מוגבלים של נמק, גם לאחר ארבעה ימים בתרבות. יתר על כן, המטריצה מוצקה למחצה מספקת מספיק תמיכה כדי לשמור על המורפולוגיה תלת ממדית של הלב תוך מתן אפשרות לפיתוח גמישות לחוזה וגם להחזיק חרוזים מצופים במקום במהלך התרבות. למרות התמיכה הזאת, מטריצה זו היא חדירה לצבעי ניאון כגון Syto 16, המאפשרת ניאון ניתוח של הלב החי.
שיטות התרבות פרוסה למקם את סעיף הלב, המכילים חלק מהמקלעת כלילית שלה, על קרום נקבובי בממשק האוויר נוזלי כדי לשמור על חמצון באמצעות פעולת נימים 7. לעומת זאת, כל שיטות תרבות לב קודמות מסתמכות על מחקרי נדנדה ומוגבלים לגילים עובריים לפני vasculat כלילית פונקציונלייור יש צורך 2,3,5. שימוש בטכניקה הנוכחית, לעומת זאת, יכולים בקלות להיות מתורבתים לאחר מקלעת כלילית יצרה ללא מורכבות הנוספת של ממשק אוויר נוזלי לבבות.
למרות החששות שלנו, כי לב עוברי מאוחרת (למשל E16.5) יהפוך נמקי לאחר תקופה ממושכת של זמן בתרבות, רק נמק מוגבל נצפה לאחר ארבעה ימים של התרבות (כלומר שווה הערך ללב שלאחר לידה יום 1). הפרוטוקול המקורי, כפי שבוצע באמצעות בלוטות ריאה עוברי, 10 לא דיווח על נמק אלא גם ריאות מנוצלות מעוברים מבוימים קודמים. לפיכך, נמק יכול להימנע על ידי הגבלת לימודים לנקודות זמן עוברי קודם לכן.
מערכת תרבות vivo לשעבר זו יש מגבלות. לאחר יומיים בתרבות, epicardium מתחיל להתפשט למטריקס, ובתוך ארבעה ימים, epicardium מתחבר לצלחת התרבות. משום תולדת epicardial האיילהזה לא משפיע על ראיה, עם זאת, בעיה זו עלולה להיות בעל חשיבות העיקרית ללימודי epicardial. בשלבים ניתחו בזאת (E14.5-E16.5), epicardium כבר מזמן הקיף את הלב וסיפק 11 אותות למקלעת פיתוח 12, ולכן אינה מופיעה תולדה שלו, כדי להיות השפעה שלילית על מקלעת כלילית. יתר על כן, מופיע את לבם בתרבות להפסיק לגדול גדול כמו עמיתיהם ברחם. מגבלה נוספת היא שהלב העכבר העוברי אינו שקוף כמו עובר דג הזברה. כל הדמיה חי מוגבלת ולכן למה שניתן לצפות בשכבות החיצוניות של הלב. עם זאת, סמן האנדותל חי יכול לחדור מספיק לב לתווית מסוים של מקלעת כלילית וגלוי בתרבות.
למרות מגבלות אלה, אנו צופים כי שיטת תרבות vivo לשעבר זה תהיה שימושית עבור מספר היישומים. מגוון הרחב של עכברים הטרנסגניים קווים שמכוניתיכולים לשמש סוגי תאים שכותרתו fluorescently ר"י בקלות להעריך היבטים שונים של התפתחות בשימוש בהדמית זמן לשגות. יתר על כן, טיפול בvivo לשעבר לב העוברי עם תרכובות מולקולריות קטנות, בין אם רומן או כבר בשימוש קליני, יהיה קל לביצוע ומחק כמה טיפולים תרופתיים מיושמים בבני אדם.
לסיכום, יש לנו להתאים שיטת תרבות vivo לשעבר ללב העכבר העוברי. טכניקה זו תאפשר גישה קלה לאיברים נגישים אחר, כגון כבד או כליות, במהלך פיתוח ותאפשר למניפולציה והניתוח חי של איברים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לאנדראה Portbury לקריאה ביקורתית של כתב היד וNIH (מענק # R01HL061656) לתמיכה במימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
