Summary
마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다.
Abstract
마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 따라서, 프로토콜은 분리하고 그 문화를 개별 기관이 모두 발달의 변화를 시각화하고 있도록 새로운 치료 전략의 방법을 제공하는 것이 필수적이다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다. 이 기판은 3 차원 구조를 유지하기 위해 충분한 지원 제공하지만 지속적인 수축을 허용 할만큼 충분히 유연합니다. 간단히 말해서 마음이 배아에서 절제와 추위 마트 리젤의 혼합물에 배치 성장 매체로 1:1 희석. 희석 마트 리젤이 굳은 후 성장 배지 배양 접시에 추가됩니다. 배아 일 16.5로 늦게 절제의 마음 나흘 후 해부 가능한 하였다. 관상 동맥 신경 얼기의 분석이 방법은하지 않는 것을 보여줍니다관상 동맥 혈관 발달을 방해. 따라서, 우리는 배아 마음의 장기적인 문화의 새로운 방법을 제시한다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 형질 전환 마우스의 개발 심장 결함을 공부 지배적 인 모델 시스템이다. 그러나, 제브라 피쉬와 같은 다른 모델 생물은 마우스에 비해 상당한 장점을 가지고 입증했다. 제브라 피쉬의 세 가지 주요 장점은 배아에 대한 접근의 용이성을 위해, 계란의 외부 누워있다, 심장 개발을 쉽게 시각화 할 수 배아의 광학 투명성, 그리고에 작은 분자 치료를 적용의 용이성은 배아의 발달을 조절 1. 따라서, 배아 기관의 전직 자궁 내 성장을 허용하는 문화 기술의 발전은 적어도 부분적으로 제한 현재 형질 전환 생쥐의 발달 과정을 공부하는 연구자에 의해 경험 우회 것이다.
생체 심장 배양 시스템은 DIF 방법 작은 분자 및 분석 치료를 허용하는 병아리와 마우스 배아 모두에서 개발 된마음의 ferent 지역은 2-6 통신합니다. 전체 마우스 심장 문화, 마음 배아로 배아에서 채택 (E) 연령 12.5 흔들 2,3,5의 유무에 관계없이 배지에 배치 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 배아 마음은 성공적 E13.5의 동등성을 배양하고 있고, 흔들 배양 마음은 오랫동안 3 일 (5 E10.5에서 시작) 3로 유지되고있다. 그러나, 연구는 이전 배아에서 마음의 성공적인 문화를보고있다. 마찬가지로, 구조 실험은 배양 배지 2 전 세계적으로 치료제를 적용 제한되었습니다.
마음은 절제 내장하고 vibratome를 사용하여 절편되는 슬라이스 문화 시스템은, 또한 E12.5 마우스 마음과 햄버거 - 해밀턴 단계 36 (약 E16 마우스) 병아리 마음으로 두 어린 마음에 활용 된 이러한 출생 후 성인 마우스를 H로 2,4,6, 세 마음,earts 성인 인간의 마음 7,8. 배아 분석은 일반적으로 150 μm의 두께 섹션 2.4을 활용하고 있지만, 단면의 두께는 산소 부족 8 증거도없이 큰 500로 μm의 수 있습니다. 이러한 슬라이스 문화는 대부분 조각이 기간 9 내내 수축성 유지 보수와 문화 2 개월만큼 유지되고있다. 고립 된 심근의 연구에 비해, 이러한 슬라이스 문화는 이웃 세포 유형과 심근의 공동 문화를 허용하고 생체 분석을위한 유용한 방법을 제공합니다. 그러나, 이러한 문화는 단순히 문화 매체의 마음을 (예 : vibratome에서 단면의 살아있는 심장을 포함) 배치보다 더 정교한 셋업이 필요하며 모든 분석은 분명 섹션에서 마음의 부분으로 제한됩니다.
제한 배양 배아 마우스 마음과 형질 전환 생쥐 AVA의 재산에 대해 위에서 설명한 주어연구 ilable, 우리는 위버에 의해 개발 된 생체 폐 배양 시스템과 유사한 생체 마우스 심장 배양 시스템을 개발 하였다. 10 우리의 문화 시스템은 전체 배아 마우스 마음에서 리모델링 관상 동맥 순환의 장기 문화와 시각화를 허용합니다. 또한, 마트 리젤의 사용에 따라서 치료 에이전트와 지역화 된 치료를 제공, 구슬이 심장에 가까운 장소에서 개최 할 수 있습니다. 이 실험은 관상 동맥 형성 등의 과정에서 주어진 치료의 효과를 비교하기 위해 다른 개발 시점에서 수행 할 수 있습니다. 작은 분자는 리겔을 통해 확산 할 수 있기 때문에,이 문화 시스템은 또한 특정 세포 - 세포 연락처가 특정 개발 프로세스에 필요하거나 다른 한 지역에서 paracrine 신호가 있는지 여부를 확인하는 서로 가까이 심장의 문화를 해부 지역에 사용할 수 있습니다 필요.
이 배양 시스템비교적 간단하고, 슬라이스 문화 시스템과는 달리, 기본적인 문화 시약 및 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 셋업을 사용합니다. 간단히, 절개 배아의 마음은 반 고체 지원을 제공 희석 리겔에 배양한다. 이 지원은 계약의 마음을 허용하면서 심장의 3 차원 형태를 유지하기에 충분합니다. 이 시스템을 사용하여, 이전 마우스 배아 (E14.5-E16.5)의 전체 마음은 최대 네 개의 일을위한 문화 유지 될 수 있습니다. 전체 관상 동맥 혈관 따위는 슬라이스 문화 달리, 유지, 그래서 마음의 다른 지역에서 발생하는 신호 단서가 존재 남아있다. 또한, 살아있는 세포 형광 염료는 살아있는 마음의 시각화를 허용하도록 마트 리젤을 침투 할 수 있고, 단백질 복합 구슬 지역화 된 신호 소스를 제공하기 위해 심장 근처에 배치 할 수 있습니다. 함께, 이러한 장점은이 기술에게 embryon의 발달 과정을 연구하기위한 이상적인 방법을IC 마우스 마음입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 배아의 마음을 절개
- 승인 안락사 기술을 사용하여 원하는 배아 일에 시간 초과 임신 마우스를 안락사. 모든 실험은 채플 힐에서 노스 캐롤라이나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
- 대충 해부하기 전에 70 % 에탄올로 여성 스프레이. 자궁을 검색하고 소비세하는 여성의 복강을 엽니 다.
- 차가운 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)와 필요에 린스를 포함하는 페트리 접시에 자궁을 놓습니다. 첨부 된 배아 주머니를 노출 정중선을 통해 자궁을 열고 잘라.
- 배아 주머니를 열고 잘라 배아를 검색 할 수 있습니다. 차가운 PBS로 두 번째 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 얼음 자궁 경적 페트리 접시를 돌려줍니다.
- 가슴 벽에 대한 액세스를 개선하기 위해 태아의 목을 베십시오. 유전자형이 필요한 경우, 제거하고 얼음에 배치 에펜 도르프 튜브에 꼬리를 저장합니다.
- 와그것의 뒤에 태아는 심장과 폐를 시각화하는 가슴 벽을 열고 잘라. 단계에 따라 가슴 벽이 투명 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 아래의 혈관을 잘라. 그런 마음을 해방하는 큰 그릇 위에 잘라. 필요한 경우, 불필요한 조직을 제거합니다.
- 차가운 PBS로 가득 찬 24 잘 접시의 잘 하나에 마음을 놓고 얼음에 접시를 놓습니다.
- 마음은 모든 배아에서 적출 될 때까지 이전 단계를 반복합니다.
2. 문화 셋업
- 층류 후드에 1:1 비율로 차가운 리겔하고 원하는 문화 매체 (Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM) 예를 들면 10 % 태아 소 혈청 (FBS)) 결합. 미리 따뜻한 문화 매체하지 않습니다.
- 얼음도 얼음에 유지되는 24 잘 배양 접시의 잘으로 희석 용액의 피펫 500 ~ 1,000 μL의 희석 마트 리젤을 유지.
- 후드에서 신중하게 픽업과 절제를 배치마트 리젤 함유 배양 접시의 잘 심장 얼음에 문화 접시를 유지하면서.
- 임베디드 마음의 방향이 매우 중요합니다 경우 대충 70 % 에탄올로 거꾸로 현미경과 주변 공간을 스프레이. 후드 반면, 여전히 얼음 마트 리젤 함유 문화 판의 잘 절제의 마음을 놓으십시오. 그런 다음, 현미경 플레이트를 배치하고 신속하게 방향을 절제 마음을 마트 리젤이 응고하기 시작.
- 가습 37 ° C 배양기 (5 % CO 2)에 배양 접시를 놓고 마트 리젤 약 30 분 동안 응고 할 수 있습니다.
- 잘 마음을 포함하는 각에 1 ML 미리 예열 문화 매체를 추가합니다.
- 마음은 적어도 나흘 문화에 남아있을 수 있습니다. 배지 2 일마다 변경하는 것이 좋습니다.
3. 고정 및 시각화
- 원하는 경우, 살아있는 마음을 시각화하기 위해 (예를 들어 SYTO-16) 형광 라이브 세포 염료를 추가합니다. 사진이 될 것입니다이 포함되었을 때의 위치에 따라 볼 수있는 마음의 측면에 제한됩니다.
- 후 배양 분석 (예 : 전체 마운트 영상 또는 단면)을 수행 할 경우, 배양액을 제거하고 차가운 4 % 포름 알데히드로 교체합니다. 30 분 동안 얼음에 접시를 놓습니다.
- 차가운 포름 알데히드와 얼음 마트 리젤의 용해를 촉진 한 후, 신선한 포름 알데히드와 (과 마트 리젤) 정착액을 교체하고 4에서 하룻밤 마음 ° C.를 해결
- 4 ° C까지 추가 분석에서 버퍼 (예 : PBS 또는 트리스) 및 저장과 마음을 씻으십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 기술을 사용하여, 마음은 3 차원의 형태를 유지하고 가능한 유지 등의 지속적인 수축 (동영상 1)로 표시. 이러한 수축은 심실에 비해 심방에서 지속적으로 더 유명하다. 문화에 따라, 마음은 고정 및 처리 특정 마커 식 또는 구조를 검사하는 면역 또는 조직학도합니다. 그림 1A는 고정, 24 시간 동안 배양 한 배아 마우스 심장의 심실과 대 혈관의 기초를 보여줍니다 대해 처리 할 수 있습니다 내피 세포의 레이블에 면역. 이 공 초점 현미경은 관상 동맥 혈관이 자궁 (그림 1B)에서 유지되었다 비교적 나이 배아에서 적출 심장 비슷 나타납니다 보여줍니다. 그러나 마음 교양 전직 생체 내에서 관상 동맥 혈관 자궁에서 유지 된 심장보다 작게 나타납니다 않습니다. 모두의 마음에, 일심실의 전자 apices은 조직에 항체의 더 나은 액세스를 허용하려면 제거되었습니다.
4 일 동안 E16.5 배양 전직 생체 내에서 절제의 마음 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 분석을 보여주는 큰 동맥의 벽 (그림 2A) 및 심실 및 심실 중격 심근 (그림 2B)의 등 전반적인 형태, 마음은 그대로 유지됩니다. 순환의 부족에도 불구하고, 관상 동맥 오스 티아 (그림 2A) 분명합니다. 그러나 DNA 파편은 H & E (그림 2A, 2B) 및 DAPI (데이터 표시되지 않음)으로 모두 관찰 컴팩트 심근과 큰 혈관 주위에 분명하다. 생체 배양 마음은 여전히 구타에도 불구하고, 자궁 (그림 2C, 2D)에서 개발 E18.5 배아에서 심장과 비교 또한, 심근 적은 밀도이다. 따라서, 제한 길이가시간이나 무대하는이 마음이 유지 될 수 있습니다.
이 문화 기술은 찬란 마음의 문화에있는 동안 레이블을 사용할 수 있습니다. 이 경우, 마음은 내피 특정 형광 염료로 배양 된 후 48 시간 동안 배양한다. 이 경우, 시각화 마음의 방향과 조직 (그림 3A의, 3B)의 불투명도에 따라 제한됩니다. 그러나, 심실 심근를 통해 다음 조직 학적 부분이 형광 분자가 심실 (그림 3C, 3D)에서 서브 심 외막 혈관에 라벨을 바깥 세포층을 통과 할 수 있는지 확인하고,이 형광 염료 (그림 3D) ISO-렉틴과 colocalizes.
그림 1. 개발은 생체 조건에서 정상 나타납니다. (A) 문화 24 시간 후, E14.5 배아의 체외 마음이 고정 된 내피 세포 마커 (녹색)으로 표시, 삭제 및 공 촛점 현미경으로 몇 군데. 폐동맥 (PA), 대동맥 (아오), 그리고 마음의 기초가 표시됩니다. (B) 자궁에서 개발 한 E15.5 배아에서 적출 마음을 유사하게 처리 하였다. 스케일 바 100 μm의.
그림 2. 형태는 크게 생체 배양 기간 동안 유지됩니다. (A, B) 마음을 4 일 동안 E16.5 배아 배양 전직 생체 내에서 절제 하였다. 마음 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E)와 그 단면과 스테인드되었습니다. 대동맥 (아오)와 폐동맥 (PA)의 정렬을 보여주는 (A) 횡단면. 관상 동맥 오스 티아 (화살촉) 중 하나가 표시됩니다. 심근 쉬르반올림 대동맥 제어 (C)에서보다 밀도이며, 일부 핵 분열 (화살표)도 존재합니다. (B) 심실 및 심실 중격 (IVS)의 컴팩트 한 심근의 전체 형태는 정상 표시되지만 심근 제어 (D)에서보다 밀도이며, 일부 핵 분열 (화살표) IVS에 분명하다. (C, D) 비교를 위해, 정면 H & E18.5 마음에서 E-스테인드 섹션이 표시됩니다. (C) 관상 동맥 개구부는 아오 (화살촉)에 인접하여 관찰된다. (D) 심실 중격이 잘 정의되어 있습니다. 스케일 바, 70 μm의.
의 그림 3. 생체 마음이 찬란 문화 48 시간 후 동안 문화. (A, B)로 표시 할 수 생체 하트E16.5 배아는 1 시간 동안 SYTO 16 (녹색)으로 배양하였으며, 형광 배양 후 48 시간 늦게으로 관찰 할 수있다. (C, D)이 형광 냉동 절편 통해 유지되고 subepicardial 상피 세포에서 관찰 할 수 심실 심근 내. D에서 심실 심근 내의 섹션 (적색) ISO-렉틴와 공동 레이블되었다. ISO-렉틴 공동 레이블은 녹색 SYTO 16-양성 세포 (화살표)도 SYTO 16로 염색되지 않은 심근 내 혈관 레이블. AB, 4 배 확대, CD의 스케일 바, 120 μm의.
영화 1. 30 시간 동안 체외 배양 한 후, E14.5 배아에서 적출 심장은 심방과 심실 사이의 일관성 수축 및 페이싱을 보여줍니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
현재 문화권 시스템은 마우스 배아 심장 연구에 상당한 이점을 포즈. 이 문화 시스템도 문화 사일 후 괴사의 제한 징후와 심근 수축력과 관상 동맥 신경총을 보존합니다. 또한, 반 고체 매트릭스 문화 동안 자리에 코팅 구슬을 보유하는 것이 계약의 유연성을 허용하면서 개발 중심의 3 차원 형태를 유지하기 위해 충분한 지원합니다. 이러한 지원에도 불구하고,이 행렬은 살아있는 마음의 형광 분석을 허용하는 등 SYTO 16 개의 형광 염료 투과이다.
슬라이스 문화 방법은 모세관 작용에 7을 통해 산소를 유지하기 위해 공기 - 액체 계면에서 다공성 막에, 관상 동맥 신경 얼기의 그것의 부분을 포함, 심장 섹션을 배치합니다. 반면, 이전의 온 마음 배양 방법은 기능 관상 동맥 vasculat하기 전에 배아 나이에 락과 제한된 연구에 의존URE는 2,3,5이 필요합니다. 관상 동맥 신경 얼기는 공기 - 액체 인터페이스의 복잡성없이 형성 한 후 현재의 기술을 사용하지만, 마음은 쉽게 배양 할 수 있습니다.
후반 배아 마음 (예 : E16.5)는 문화에 오랜 기간이 지난 후 괴사 될 것이라는 우리의 우려에도 불구하고, 제한된 괴사 문화의 사일 (즉 출생 후 1 일 심장에 해당) 후 관찰되었다. 원래 프로토콜은 같은 배아 폐 꽃 봉오리를 사용하여 수행, 10 이전에 개최 배아로부터 괴사뿐만 아니라 활용 폐를보고. 따라서, 괴사는 초기 배아 시점에 연구를 제한함으로써 피할 수 있습니다.
이 생체 배양 시스템은 한계를 가지고있다. 문화 이틀, 외막이 시작 매트릭스 확산, 4 일 이내에 외막은 배양 접시에 부착. 때문에 심 외막 가지 미상의 시각화에 영향을 미치지 않습니다, 그러나,이 문제는 심 외막의 연구에 가장 중요 할 수 있습니다. 따라서, 그 부산물은 관상 동맥 신경 얼기에 부정적인 영향을 미칠 것으로 나타나지 않습니다; 단계에서 (E14.5-E16.5), 외막은 심장 11 포위하고 개발 신경총 12 신호를 제공 오래전에이 문서에 분석했다. 또한, 문화에 마음은 자궁 대응에 같은 큰 성장을 중지 나타납니다. 또 다른 제한은 마우스 배아 심장 제브라 피쉬 배아처럼 투명하지 것입니다. 모든 실시간 시각화 따라서 심장의 외부 층에서 관찰 할 수있는 제한됩니다. 그러나 라이브 내피 세포 마커 충분히 관상 동맥 신경 얼기의 일부를 레이블을 마음을 침투 문화에서 볼 수 있습니다.
이러한 한계에도 불구하고, 우리는이 생체 배양 방법은 응용 프로그램의 번호를 유용하게 사용될 수 있으리라 기대하고 있습니다. 형질 전환 생쥐의 다양한 라인 그 차공예 찬란 세포 유형은 쉽게 시간 경과 이미징을 사용하여 개발의 다양한 측면을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 작은 분자 화합물 배아 마음 전직 생체 치료, 임상 사용의 소설이나 이미이 달성하기 쉬운 및 약물 치료는 인간에 적용되는 방식을 모방할지 여부를 지정합니다.
결론적으로, 우리는 배아 마우스 심장 생체 배양 방법을 적용했다. 이 기술은 개발하는 동안, 같은 간 또는 신장으로 액세스 할 수없는 기관에 쉽게 접근 할 수 있도록 이들 기관의 조작과 실시간 분석을 위해 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 중요한 원고의 읽기 및 자금 지원을위한 NIH (부여 # R01HL061656)의 안드레아 포트 베리에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
