Summary
Ontwikkelingsstudies in de muis worden gehinderd door de ontoegankelijkheid van het embryo tijdens de dracht. Om de lange termijn cultuur van het embryonale hart te bevorderen in de late stadia van de zwangerschap, hebben we een protocol waarin het uitgesneden hart wordt gekweekt in een semi-vaste, verdunde Matrigel ontwikkeld.
Abstract
Ontwikkelingsstudies in de muis worden gehinderd door de ontoegankelijkheid van het embryo tijdens de dracht. Aldus protocollen het isoleren en kweken individuele organen plaats zijn essentieel voor een werkwijze voor het visualiseren van zowel veranderingen in de ontwikkeling en waardoor nieuwe behandelingsstrategieën bieden. Om de lange termijn cultuur van het embryonale hart te bevorderen in de late stadia van de zwangerschap, hebben we een protocol waarin het uitgesneden hart wordt gekweekt in een semi-vaste, verdunde Matrigel ontwikkeld. Dit substraat verschaft voldoende steun aan de driedimensionale structuur te behouden, maar is flexibel genoeg om verdere krimp mogelijk. In het kort, worden harten uitgesneden uit het embryo en in een mengsel van koude Matrigel 1:1 verdund met kweekmedium. Na het verdunde Matrigel stolt, wordt groeimedium toegevoegd aan de kweekschaal. Harten uitgesneden zo laat embryonale dag 16,5 levensvatbaar waren voor vier dagen na de dissectie. Analyse van de coronaire plexus blijkt dat deze methode nietverstoren coronaire vasculaire ontwikkeling. Zo presenteren we een nieuwe werkwijze voor de lange termijn kweek van embryonale hart.
Introduction
De afgelopen jaren heeft de transgene muis is het overheersende modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling hartafwijkingen. Echter, andere modelorganismen, zoals de zebravis, bewezen aanzienlijke voordelen boven de muis hebben. Drie belangrijke voordelen van de zebravis zijn de externe leggen van eieren, voor gemakkelijke toegang tot de embryo, de optische transparantie van de embryo's die eenvoudige visualisatie van de ontwikkeling van het hart toelaten, en het gemak van aanbrengen van kleine moleculaire behandelingen te moduleren ontwikkeling van het embryo 1. Aldus zou de ontwikkeling van een cultuur techniek die ex utero groei van een embryonale orgaan toegestaan omzeilen, althans gedeeltelijk, de beperkingen vandaag op onderzoekers die de ontwikkeling in transgene muizen.
Ex vivo cardiale kweek zijn ontwikkeld in zowel het kuiken en muisembryo dat behandeling met kleine moleculen en analyse van de ver mogelijklende regio's van het hart te communiceren 2-6. Voor geheel muizenhart cultuur, harten die uit embryo's tot embryonale (E) 12.5 van leeftijd kan in kweekmedium geplaatst worden met of zonder schommelen 2,3,5. Met deze techniek, zijn embryonale harten succes geïncubeerd om de gelijkwaardigheid van E13.5 en harten gekweekt met schudden werden wel drie dagen (vanaf E10.5) 3 gehandhaafd. Er zijn echter geen studies meldde de succesvolle cultuur van de harten van oudere embryo's. Ook hebben reddingsexperimenten beperkt tot de toepassing van de therapeutische agens wereldwijd aan het kweekmedium 2.
Een plak kweeksysteem waarin harten uitgesneden, ingebed en coupes met een vibratome is ook gebruikt bij jongere harten, zoals E12.5 muisharten en Hamburger-Hamilton stage 36 (ongeveer E16 in de muis) chick hearts 2,4,6, en ouder harten, zoals postnatale en volwassen muis hearts en volwassen menselijke harten 7,8. Terwijl de embryonale analyses hebben doorgaans gebruikt 150-urn dikke secties 2,4, kan snijdikte een groot als 500 micrometer zijn zonder bewijs van zuurstoftekort 8. Deze slice culturen zijn gehandhaafd zolang twee maanden in de cultuur, met de meeste schijfjes behoud contractiliteit in deze periode 9. Vergeleken met studies in geïsoleerde cardiomyocyten, die slice culturen kan de co-cultuur van cardiomyocyten met naburige celtypes en een bruikbare werkwijze voor ex vivo analyse. Echter, deze culturen vereisen uitgebreidere opstelling dan simpelweg plaatsen van een hart in kweekmedium (bijv. inbedding het levende hart voor het snijden op vibratome) en de analyses is uiteraard beperkt tot het gedeelte van het hart binnen het gedeelte.
Gezien de bovenstaande beperkingen voor het kweken van embryonale muis harten en de rijkdom van de transgene muizen available voor studie, hebben we een ex vivo muizenhart cultuur systeem vergelijkbaar met een ex vivo long kweeksysteem ontwikkeld door Weaver ontwikkeld, et al.. 10 Onze cultuur systeem maakt op lange termijn de cultuur en de visualisatie van de verbouwing coronaire circulatie binnen hele embryonale muis harten. Bovendien, het gebruik van Matrigel kunnen kralen worden vastgehouden in het hart, waardoor een gelokaliseerde behandeling met therapeutische middelen. Deze experimenten kunnen op verschillende ontwikkelingsstadia tijdstippen worden uitgevoerd om het effect van een bepaalde behandeling te vergelijken op een werkwijze zoals coronaire formatie. Omdat kleine moleculen kunnen diffunderen door Matrigel, kan deze cultuur systeem ook gebruikt worden om de cultuur ontleed regio's van het hart bij elkaar om te bepalen of specifieke cel-cel contacten die nodig zijn voor bepaalde ontwikkelingsprocessen of dat paracrienen van de ene regio naar de andere is zijn noodzakelijk.
Deze cultuur systeemis relatief eenvoudig en, in tegenstelling tot de slice kweeksysteem maakt gebruik van basiscultuur reagentia en configuraties die gemakkelijk beschikbaar in de meeste laboratoria. In het kort, worden uitgesneden embryonale hart gekweekt in verdunde Matrigel, waar semi-vaste drager verschaft. Deze steun is voldoende om de driedimensionale morfologie van het hart te handhaven en daarbij tevens het hart samentrekken. Met dit systeem kan geheel harten van oudere muizen embryo's (E14.5-E16.5) in cultuur worden gehandhaafd voor maximaal vier dagen. De gehele coronaire plexus wordt gehandhaafd, in tegenstelling tot in de slice culturen, zodat eventuele signalering signalen die zich voordoen tussen de verschillende regio's van het hart aanwezig blijven. Bovendien kunnen levende cellen fluorescerende kleurstoffen het Matrigel doordringen tot visualisatie van de levende hart toe, en proteïne-geconjugeerde kralen kunnen in de buurt van het hart worden geplaatst om een gelokaliseerde signalering bron bieden. Samen zijn deze voordelen maken deze techniek een ideale methode voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen in de embryonic muis hart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uitsnijden van de Embryonale Hearts
- Euthanaseren een timed-zwangere muis op de gewenste embryonale dag met behulp van een goedgekeurde euthanasie techniek. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.
- Deze spray het vrouwtje met 70% ethanol voorafgaand aan dissectie. Open buikholte van het vrouwtje op te halen en accijnzen de baarmoeder hoorn.
- Plaats de baarmoeder hoorn in een petrischaal met koude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en spoelen indien nodig. Knip de baarmoedertak via de middellijn naar de bijgevoegde embryonale zakken bloot.
- Knip een embryonale sac en halen een embryo. Plaats de embryo in een tweede petrischaal met koude PBS. Terug de petrischaal met de baarmoedertak om ijs.
- Onthoofden de embryo toegang tot de borstwand verbeteren. Als genotypering is nodig, verwijderen en opslaan van de staart in een Eppendorf buis op ijs geplaatst.
- Met deembryo op zijn rug, opengesneden de borstwand naar het hart en de longen te visualiseren. Afhankelijk van het stadium, kan de borstwand transparant zijn.
- Til het hart met behulp van een tang en snijd onder de schepen. Vervolgens snijd boven de grote vaten naar het hart te bevrijden. Verwijder eventueel vreemde weefsels.
- Plaats het hart in een putje van een 24-well schotel gevuld met koude PBS en plaats de schaal op het ijs.
- Herhaal de vorige stappen totdat harten zijn uitgesneden uit alle embryo's.
2. Cultuur Set-up
- In een laminaire afzuigkap, combineren koude Matrigel en het gewenste kweekmedium (bijv. 10% foetaal bovine serum (FBS) in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)) in een 1:1 verhouding. Niet pre-warme het kweekmedium.
- Het houden van de verdunde Matrigel op ijs, pipet 500-1000 ul van de verdunde oplossing in een putje van een 24-well cultuur schotel die ook wordt gehandhaafd op ijs.
- In de kap, zorgvuldig te halen en plaats de weggesnedenhart in een goed van de Matrigel-bevattende cultuur schotel met behoud van de cultuur schotel op het ijs.
- Als oriëntatie van de ingesloten hart is cruciaal: Royaal spuiten van een omgekeerde microscoop en de omringende ruimte met 70% ethanol. In de kap, plaats de uitgesneden hart in een goed van de Matrigel-bevattende kweekplaat terwijl nog op het ijs. Vervolgens plaatst u de plaat op een microscoop en snel oriënteren het uitgesneden hart als de Matrigel begint te stollen.
- Plaats de kweekschaal in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% CO2) en laat de Matrigel stollen gedurende ongeveer 30 minuten.
- Voeg 1 ml voorverwarmde kweekmedium aan elk putje met een hart.
- Harten kunnen in de cultuur blijven gedurende ten minste vier dagen. Wijzigen kweekmedium twee dagen wordt aanbevolen.
3. Fixatie en Visualisatie
- Indien gewenst, voeg een fluorescente live-cell kleurstof (bv. Syto-16) naar de live hart visualiseren. Fotografie zal wordenbeperkt tot de kant van het hart dat zichtbaar basis van de positie waarin deze is ingebed.
- Als post-kweken analyses (bv. ganse berg imaging of snijden) zullen worden uitgevoerd, verwijder het kweekmedium en vervang met koud 4% formaldehyde. Zet de schaal op ijs gedurende 30 minuten.
- Na de koude formaldehyde en ijs te bevorderen ontbinding van de Matrigel, vervang het fixeermiddel (en Matrigel) met verse formaldehyde en repareren harten overnacht bij 4 ° C.
- Was de harten met buffer (bijv. PBS of Tris) en bewaar bij 4 ° C tot verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met deze techniek het hart handhaaft zijn driedimensionale morfologie en levensvatbaar blijft, zoals aangegeven door aanhoudende contracties (Film 1). Deze samentrekkingen zijn steeds meer prominent in de atria dan in de ventrikels. Na cultuur, harten kan worden gefixeerd en verwerkt voor histologie en immunohistochemie of specifieke marker expressie of structuren te onderzoeken. Figuur 1A toont de basis van de ventrikels en de grote slagaders van een embryonale muizen hart dat werd gekweekt gedurende 24 uur, gefixeerd en verwerkt voor immunohistochemie te labelen het endotheel. Deze confocale microfoto tonen dat de coronaire vasculatuur lijkt vergelijkbaar met een hart uitgesneden uit een relatief oud embryo dat in utero (Figuur 1B) werd gehandhaafd. De coronaire vaten in het hart gekweekt ex vivo verschijn kleiner dan in het hart dat in utero werd gehandhaafd. In beide harten, the toppen van de ventrikels werden verwijderd om een betere toegang van de antilichamen aan het weefsel toe.
Hematoxyline en eosine (H & E) analyse van harten uitgesneden op E16.5 en ex vivo gekweekt gedurende 4 d blijkt dat de algemene morfologie, zoals de wanden van de grote vaten (Figuur 2A) en het ventriculaire myocardium en interventriculaire septum (figuur 2B) van het hart blijft intact. Ondanks het ontbreken van het verkeer, de coronaire ostia zijn duidelijk zichtbaar (Figuur 2A). Echter, DNA-fragmentatie, zowel waargenomen met H & E (Figuren 2A, 2B) en DAPI (gegevens niet getoond), blijkt in de compacte myocardium en in de grote vaten. Verder, het myocardium minder dicht ten opzichte van een hart van een E18.5 embryo ontwikkeld die in utero (figuren 2C, 2D), terwijl de ex vivo gekweekte hart nog klopt. Zo zijn er beperkingen op de lengtevan de tijd voor of het stadium waarin deze harten kunnen worden gehandhaafd.
Deze cultuur techniek kan ook gebruikt worden om fluorescent label harten terwijl in cultuur. In dit geval worden harten gekweekt gedurende 48 uur na geïncubeerd met een endotheel-specifieke fluorescente kleurstof. In dit geval is visualisatie begrensd volgens de oriëntatie van het hart en de opaciteit van het weefsel (figuren 3A, 3B). Echter, latere histologische secties via de ventriculaire myocardium bevestigen dat dit fluorescerend molecuul de buitenste cellagen kunnen doordringen tot sub-epicardiale schepen label binnen de ventrikels (Figuren 3C, 3D), en dit fluorescerende kleurstof colocalizes met iso-lectine (Figuur 3D).
Figuur 1. Ontwikkeling verschijnt normaal in ex vivo omstandigheden. (A) na 24 uur in cultuur, werden ex vivo harten van E14.5 embryo's vast, gelabeld met een endotheliale merker (groen), gewist, en afgebeeld met confocale microscopie. De pulmonale arterie (PA), aorta (Ao), en de basis van het hart worden weergegeven. (B) harten uitgesneden uit E15.5 embryo's ontwikkeld in utero werden eveneens behandeld. Schaal bar, 100 micrometer.
Figuur 2. Morfologie wordt schromelijk gehandhaafd tijdens ex vivo cultuur. (A, B) Harten werden uit E16.5 embryo's en ex vivo gekweekt voor 4 dagen. Harten werden vervolgens doorgesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E). (A) een dwarsdoorsnede van de alignering van de aorta (Ao) en longslagader (PA). Een van de coronaire ostia (pijlpunt) zichtbaar is. Het myocardium surafronden van de aorta is minder dicht dan in de controlegroep (C) en sommige kernfragmentatie (arrow) aanwezig is. (B) de totale morfologie van de compacte myocardium van de ventrikels en septum (IVS) verschijnt normaal, maar de myocardium is minder dicht dan in de controle (D) en sommige kernfragmentatie (pijl) is herkenbaar in de IVS. (C, D) Ter vergelijking, frontale H & E gekleurde coupes van een E18.5 hart getoond. (C) A coronaire ostium, naast het Ao (pijlpunt) waargenomen. (D) Het septum is goed gedefinieerd. Schaal bar, 70 micrometer.
Figuur 3. Ex vivo harten kunnen fluorescerend worden geëtiketteerd tijdens cultuur. (A, B) Na 48 uur in cultuur, ex vivo harten vanE16.5 embryo's werden geïncubeerd met Syto 16 (groen) gedurende 1 uur, en fluorescentie worden waargenomen zo laat als 48 uur na incubatie. (C, D) Deze fluorescentie hield gedurende bevroren coupes en kon worden waargenomen in de subepicardiale epitheelcellen binnen het ventriculaire myocardium. D In de sectie binnen het ventriculaire myocardium werd tezamen gelabeld met iso-lectine (rood). De iso-lectine co-labels de groene Syto 16-positieve cellen (pijlen) en labelt ook schepen in de hartspier die niet werden gekleurd met Syto 16. AB, 4x vergroting, schaal bar in CD, 120 micrometer.
Film 1. Na ex vivo kweken gedurende 30 uur, een hart uitgesneden uit een E14.5 embryo toont consequent contractiliteit en pacing tussen de boezems en de ventrikels. Klik hier om de film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige cultuur systeem vormt significante voordelen voor de embryonale muis hart onderzoeken. Deze cultuur systeem bewaart myocardcontractiliteit en de coronaire plexus, met beperkte tekenen van necrose, zelfs na vier dagen in de cultuur. Verder, de halfvaste matrix bevat voldoende steun aan de driedimensionale morfologie van het ontwikkelen van hart behouden terwijl flexibiliteit contract en om beklede kralen tijdens kweek op zijn plaats. Desondanks steun, deze matrix is permeabel voor fluorescente kleurstoffen zoals Syto 16, waardoor fluorescentie analyse van het levende hart.
Slice kweekmethoden plaats de sectie hart, met haar deel van de coronaire plexus, op een poreus membraan bij een lucht-vloeistof interface om oxygenatie te handhaven door middel van capillaire werking 7. In tegenstelling tot eerdere hele hart cultuur methoden rekenen op schommelstoel en beperkte studies naar embryonale eeuwen voordat een functionele coronaire vasculature noodzakelijk 2,3,5. Met de huidige techniek is echter harten eenvoudig worden gekweekt na coronaire plexus gevormd zonder de extra complexiteit van een lucht-water grensvlak.
Ondanks onze bezorgdheid dat late embryonale harten (bv. E16.5) necrotische na een langere periode van tijd in cultuur zou worden, werd slechts beperkte necrose waargenomen na vier dagen van de cultuur (dwz het equivalent van een postnatale dag 1 hart). Het oorspronkelijke protocol, zoals uitgevoerd met embryonale long knoppen, 10 gemeld geen necrose, maar ook gebruikt longen uit eerdere geënsceneerde embryo's. Aldus kan necrose worden vermeden door het beperken van eerdere studies embryonale tijdstippen.
Deze ex vivo cultuur systeem heeft wel beperkingen. Na twee dagen in kweek, begint het epicard zich naar de matrix en binnen vier dagen, het epicard hecht aan de kweekschaal. Omdat de epicardial uitgroei hindes geen invloed visualisatie, echter kan dit probleem zijn van primair belang voor epicardial studies. In de stadia die hierin geanalyseerd (E14.5-E16.5), de epicardium allang omvatte het hart 11 en verstrekt signalen naar de ontwikkeling van plexus 12; dus, doet haar uitgroei niet lijken te negatieve effecten op de coronaire plexus hebben. Verder, de harten in de cultuur lijken te stoppen met groeien groter als hun tegenhangers in de baarmoeder. Een andere beperking is dat de embryonale muis hart is niet doorzichtig als de zebravis embryo. Elke levende visualisatie is dus beperkt tot wat kan worden waargenomen op de buitenste lagen van het hart. Toch kan een live-endotheliale merker voldoende doordringen het hart om een aantal van de coronaire plexus label en is zichtbaar in de cultuur.
Ondanks deze beperkingen, verwachten we dat deze ex vivo kweken methode nuttig voor een aantal toepassingen. De grote verscheidenheid van transgene muizen lijnen die autory fluorescent gelabelde celtypes kunnen gemakkelijk worden gebruikt om verschillende aspecten van de ontwikkeling met behulp van time-lapse imaging beoordelen. Verder, behandeling van embryonale harten ex vivo met kleine moleculaire verbindingen, ook nieuwe of reeds in klinisch gebruik, makkelijk te bereiken zal zijn en bootst hoe drugs therapieën bij mensen worden toegepast.
Concluderend, hebben wij een ex vivo kweken wijze van embryonale muizenhart aangepast. Deze techniek zal gemakkelijk anders ontoegankelijke organen, zoals de lever of de nieren kunnen, tijdens de ontwikkeling en zal voor de manipulatie en analyse van deze levende organen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij willen Andrea Portbury bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript en het NIH (subsidie # R01HL061656) voor financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
